專利名稱：半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術(shù)，是一種能在魚類單性育種中應(yīng)用的魚類性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，例如，羅非魚雌性比雄性生長快約40％以上，鯉魚、牙鲆及半滑舌鰨等魚類，雌性個體比雄性個體生長快30％-100％，因此，開展這些魚類性別相關(guān)基因及性別特異分子標(biāo)記的研究既有重要的科學(xué)意義，又有重大的應(yīng)用潛力和推廣前景。
半滑舌鰨(Cynoglossus semiliaevis)是我國特有的一種名貴經(jīng)濟(jì)海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。盡管近2年來，半滑舌鰨人工育苗技術(shù)獲得突破，年產(chǎn)半滑舌鰨苗種近百萬尾，不過，研究表明半滑舌鰨雌性個體和雄性個體在生長速率上存在巨大差別，其雌性個體比雄性個體大2-3倍(黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性個體生長過慢，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，由于難以鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，嚴(yán)重影響了半滑舌鰨雌核發(fā)育和性別控制研究的進(jìn)行。
有關(guān)魚類性別相關(guān)分子標(biāo)記的研究，目前只是在少數(shù)幾種魚類上進(jìn)行過。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西溫哥華實驗室的Devlin(1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；匈牙利農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心的Kovacs等(2000)用RAPD掃描非洲鯰魚雌雄基因池，找到兩個雄性性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記，一個(CgaY1)大約2.6kb，另一個(CgaY2)458bp，這是首次從鯰魚中找到性別特異的DNA標(biāo)記。美國新罕布什爾大學(xué)的Lee等(2004)用分離集團(tuán)分析法尋找羅非魚表型性別相連鎖的DNA標(biāo)記，找到10個與羅非魚表型性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記。這些標(biāo)記可以直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個或者幾個Y染色體拷貝的親魚的鑒定。英國Stirling大學(xué)的Ezaz等(2004)用AFLP技術(shù)掃描尼羅羅非魚基因組，找到三個Y染色體連鎖(OniY425、OniY382、OniY227)和一個X染色體連鎖(OniX420)的AFLP標(biāo)記，其中OniX420和OniY425證明為等位基因，然而這些標(biāo)記卻不能鑒別沒有親緣關(guān)系的個體的性別，達(dá)不到鑒定羅非魚遺傳性別的水平。由于不同魚類之間存在著很大差異，一種魚類的性別特異分子標(biāo)記不能在另一種魚類上應(yīng)用，因此必須建立各種魚類自己的性別特異分子標(biāo)記。有關(guān)半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別檢測技術(shù)，目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了篩選出半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記，建立遺傳性別鑒定的分子生物學(xué)方法，為半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究提供分子標(biāo)記和技術(shù)方法。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下一、半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記，包括1、半滑舌鰨血液DNA的提??；2、基因組DNA的AFLP分析；3、性別特異分子標(biāo)記的篩選；二、半滑舌鰨遺傳性別鑒定方法。
一、半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記，包括1、半滑舌鰨血液DNA的提?。?、基因組DNA的AFLP分析；3、性別特異分子標(biāo)記的篩選1、半滑舌鰨血液DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液，在冰上靜置后離心去除上層血漿，加4-6倍體積蒸餾水溶解血細(xì)胞沉淀，搖勻，靜置，再離心，去上清；加4-6倍體積STE緩沖液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE緩沖液，消化過夜，直至沉淀物溶解為止；添加等體積飽和酚，抽提一次；用與上述STE緩沖液體積相同的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液抽提一次，然后用與上述STE緩沖液體積相同的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次；最后用2-3倍體積的無水乙醇沉淀DNA。于-20℃放置20-30分鐘后于12000rpm離心，去上清，收集DNA沉淀，經(jīng)70％乙醇洗滌和自然干燥后，用TE溶解，將DNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 所述的基因組DNA的濃度應(yīng)不低于20ng/μl，基因組DNA的純度要求OD260/OD280值為1.76-1.80。
2、基因組DNA的AFLP分析
基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA模板進(jìn)行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，第四步是進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，第五步是電泳分析。
所述的對DNA模板進(jìn)行酶切，其方法是先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 4-6小時，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。
所述的特異接頭連接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反應(yīng)混合液中加入12.0μl接頭混合物和0.5μl T4 DNA連接酶，20℃孵育12-20小時。
所述的預(yù)擴(kuò)增，其方法是將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預(yù)擴(kuò)增的模板；PCR引物是3’末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)的引物混合物，進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增。
所述的選擇性擴(kuò)增其方法是將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。用熒光標(biāo)記的MseI引物和EcoRI引物進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基。向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的上樣液，于94℃變性3分鐘后立即置于冰上待用?？偣灿昧?4個引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94℃變性后用6.5％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。
所述的電泳分析，其方法是將變性好的擴(kuò)增產(chǎn)物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳條件電壓1500V，功率40W，電流40mA，溫度45℃，時間3.5小時。然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進(jìn)行觀察，照相和分析。
3、性別特異分子標(biāo)記的篩選總共用64個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進(jìn)行了AFLP-PCR擴(kuò)增，通過SAGA軟件分析篩選出4個引物組合產(chǎn)生了7條雌性特異的DNA片段，這些片段在雄性個體基因組DNA中不存在其中引物組合M1-E1擴(kuò)增出三條雌性特異的DNA片段，長度分別為378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物組合M2-E2擴(kuò)增出一條460-464bp的雌性特異DNA片段；引物組合M3-E3擴(kuò)增出兩條雌性特異的DNA片段，長度分別為132-136bp和614-618bp；引物組合M4-E4，擴(kuò)增出一條300-305bp的雌性特異DNA片段。將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標(biāo)記，即可用于遺傳性別鑒定。
二、遺傳性別鑒定方法抽取待測半滑舌鰨魚的血液，提取基因組DNA，用產(chǎn)生雌性特異DNA片段的AFLP引物進(jìn)行AFLP分析，如果產(chǎn)生了這些特異片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點是本發(fā)明采用分子標(biāo)記技術(shù)，以半滑舌鰨為材料首次篩選到性別特異DNA分子標(biāo)記，首次建立了我國養(yǎng)殖魚類遺傳性別鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)具有準(zhǔn)確、靈敏、可靠等優(yōu)點，為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑，適宜在所有養(yǎng)殖魚類上推廣應(yīng)用，對養(yǎng)殖魚類單性育種具有重要意義和應(yīng)用價值。
具體實施例方式采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，篩選出性別特異的分子標(biāo)記，建立半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子技術(shù)，這對于培育半滑舌鰨全雌苗種，進(jìn)行全雌苗種養(yǎng)殖，提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，真正將半滑舌鰨開發(fā)為一個被廣大養(yǎng)殖戶接受的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，推動半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及海水魚類養(yǎng)殖品種的更新?lián)Q代，具有重要的現(xiàn)實意義和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
下面通過半滑舌鰨雌性特異AFLP分子標(biāo)記的篩選及遺傳性別鑒定方法的建立，對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明一、半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記，包括1、半滑舌鰨血液DNA的提取，2、基因組DNA的AFLP分析，3、性別特異分子標(biāo)記的篩選。
1、半滑舌鰨血液DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液200-400μl，取100-150μl血液于3500rpm離心15分鐘，去除上層血漿后，加5倍體積蒸餾水(滅菌)溶解血細(xì)胞沉淀，搖勻，靜置5-10分鐘，再以3500rpm離心15分鐘，去上清；加5倍體積STE(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))，清洗沉淀2次；每次在12000rpm離心7-8分鐘；去上清后加0.5ml STE，10％SDS 25-30μl，蛋白酶-K至終濃度100μg/ml，37℃消化過夜，直至沉淀物溶解為止；添加等體積飽和酚，倒轉(zhuǎn)搖勻10分鐘，12000rpm離心5分鐘，吸上層清夜入另一1.5ml離心管；加等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，倒轉(zhuǎn)混勻10分鐘后于12000rpm離心5分鐘，吸上層清夜入另一1.5ml離心管，向上清液中加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，倒轉(zhuǎn)混勻10分鐘，于12000rpm離心5分鐘，取上清入另一管；加1/12體積3M醋酸鈉，混勻后再加3倍體積的4℃無水乙醇，輕柔振搖；可觀察到白色絮狀物出現(xiàn)(DNA)，于-20℃放置20-30分鐘后于12000rpm低溫(4℃)離心10分鐘，去上清，收集DNA沉淀，加1ml70％乙醇洗滌，12000rpm低溫(4℃)離心10分鐘，去上清，重復(fù)1次；自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃?zhèn)溆??；蚪MDNA的濃度應(yīng)不低于20ng/μl，基因組DNA的純度要求OD260/OD280值為1.8左右。
2、基因組DNA的AFLP分析主要分為如下5步(1)、酶切用1.0μl EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 4-6小時，再用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，然后將充分酶切的DNA溶液于70℃孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。
(2)、連接向上面的酶切反應(yīng)混合液中加入12.0μl接頭混合物和0.5μl T4DNA連接酶，20℃孵育12-20小時，保證接頭充分連接。
(3)、預(yù)擴(kuò)增將連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為預(yù)擴(kuò)增的模板；預(yù)擴(kuò)增引物是3’末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)的引物混合物。PCR反應(yīng)條件為92-94℃，30秒；54-56℃，1分鐘；70-72℃，1分鐘。20個循環(huán)后，4℃待用。
(4)、選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。用含酶切位點MseI的引物和含酶切位點EcoRI的引物進(jìn)行擴(kuò)增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基。PCR反應(yīng)分為三步第一步進(jìn)行1個循環(huán)92-94℃，30秒；63-65℃，30秒；70-72℃，1分鐘；第二步進(jìn)行12個循環(huán)92-94℃，30秒；65-54℃，30秒；70-72℃，1分鐘；第三步進(jìn)行23個循環(huán)--92-94℃，30秒；54-56℃，30秒；70-72℃，1分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物加入適量的上樣液，94℃變性3分鐘，立即置于冰上。
(5)、電泳分析
將變性好的擴(kuò)增產(chǎn)物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳條件電壓1500V，功率40W，電流40mA，溫度45℃，時間3.5小時?？偣灿昧?4個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進(jìn)行了AFLP分析，用SAGA軟件分析電泳圖譜后，篩選出產(chǎn)生特異片段的引物組合4個，這4個引物組合共產(chǎn)生了7條雌性特異的DNA片段。
3、性別特異分子標(biāo)記的篩選總共用64個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進(jìn)行了AFLP-PCR擴(kuò)增，通過SAGA軟件分析篩選出4個引物組合產(chǎn)生了7條雌性特異的DNA片段，這些片段在雄性個體基因組DNA中不存在其中引物組合M1-E1擴(kuò)增出三條雌性特異的DNA片段，長度分別為378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物組合M2-E2擴(kuò)增出一條460-464bp的雌性特異DNA片段；引物組合M3-E3擴(kuò)增出兩條雌性特異的DNA片段，長度分別為132-136bp和614-618bp；引物組合M4-E4擴(kuò)增出一條300-305bp的雌性特異DNA片段。將只在雌性個體中出現(xiàn)、而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標(biāo)記，即可用于遺傳性別鑒定。
二、遺傳性別鑒定方法應(yīng)用上面建立的半滑舌鰨魚血液DNA提取技術(shù)抽取血液，分離出半滑舌鰨魚基因組DNA，這種方法不用殺魚，為非損傷性技術(shù)，適于推廣應(yīng)用；然后再用上面篩選出來的能產(chǎn)生半滑舌鰨雌性特異DNA片段的AFLP引物對基因組DNA進(jìn)行AFLP分析，電泳證實DNA條帶的有無，如果某條魚的基因組DNA中產(chǎn)生了性別特異的DNA片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則可認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。通過這種方法就可以鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，為半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究提供技術(shù)手段。這種方法準(zhǔn)確、可靠，在半滑舌鰨性別控制和單性育種中具有重要應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記，其特征在于它的技術(shù)內(nèi)容包括如下三個方面1)、半滑舌鰨血液DNA的提??；2)、基因組DNA的AFLP分析；3)、性別特異分子標(biāo)記的篩選；1)、半滑舌鰨血液DNA的提取抽取半滑舌鰨魚血液，在冰上靜置后離心去除上層血漿，加4-6倍體積蒸餾水溶解血細(xì)胞沉淀，搖勻，靜置，再離心，去上清；加4-6倍體積STE緩沖液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE緩沖液，消化過夜，直至沉淀物溶解為止；添加等體積飽和酚，抽提一次；用酚、氯仿、異戊醇混合液抽提一次，然后用氯仿、異戊醇混合液抽提一次；最后用2-3倍體積的無水乙醇沉淀DNA；于-20℃放置20-30分鐘后于12000rpm離心，去上清，收集DNA沉淀，經(jīng)70％乙醇洗滌和自然干燥后，用TE溶解，將DNA保存在-20℃?zhèn)溆?；所述的基因組DNA的濃度應(yīng)不低于20ng/μl，基因組DNA的純度要求OD260/OD280值為1.76-1.80；2)、基因組DNA的AFLP分析基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟第一步對DNA模板進(jìn)行酶切，第二步是將特異接頭連接到酶切片段上，第三步是進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，第四步是進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，第五步是電泳分析；所述的對DNA模板進(jìn)行酶切，其方法是先用1.25U/μl EcoRI/MseI酶混合物消化80-110ng模板DNA 4-6小時，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，將充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶；所述的特異接頭連接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反應(yīng)混合液中加入12.0μl接頭混合物和0.5μl T4 DNA連接酶，20℃孵育12-20小時；所述的預(yù)擴(kuò)增，其方法是將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預(yù)擴(kuò)增的模板；PCR引物是3’末端帶有一個A或者C的選擇性堿基的引物混合物，進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增；所述的選擇性擴(kuò)增其方法是將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30-50倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板；用熒光標(biāo)記的MseI引物和EcoRI引物進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基；向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的上樣液，于94℃變性3分鐘后立即置于冰上待用；總共用了64個引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94℃變性后用6.5％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；所述的電泳分析，其方法是將變性好的擴(kuò)增產(chǎn)物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；電泳條件電壓1500V，功率40W，電流40mA，溫度45℃，時間3.5小時；然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進(jìn)行觀察，照相和分析；3)、性別特異分子標(biāo)記的篩選總共用64個引物組合對15個半滑舌鰨雌性個體和13個半滑舌鰨雄性個體的基因組DNA進(jìn)行了AFLP-PCR擴(kuò)增，通過SAGA軟件分析篩選出4個引物組合產(chǎn)生了7條雌性特異的DNA片段，這些片段在雄性個體基因組DNA中不存在其中引物組合M1-E1擴(kuò)增出三條雌性特異的DNA片段，長度分別為378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物組合M2-E2擴(kuò)增出一條460-464bp的雌性特異DNA片段；引物組合M3-E3擴(kuò)增出兩條雌性特異的DNA片段，長度分別為132-136bp和614-618bp；引物組合M4-E4，擴(kuò)增出一條300-305bp的雌性特異DNA片段；將只在雌性個體中出現(xiàn)，而在雄性個體中不出現(xiàn)的片段作為雌性特異DNA標(biāo)記，即可用于遺傳性別鑒定。
2.一種半滑舌鰨遺傳性別鑒定方法，其特征在于它的方法是抽取待測半滑舌鰨魚的血液，提取基因組DNA，用產(chǎn)生雌性特異DNA片段的AFLP引物進(jìn)行AFLP分析，如果產(chǎn)生了這些特異片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。
全文摘要
一種半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別檢測方法，它的方法是血液DNA的提取，基因組DNA的AFLP分析、性別特異AFLP分子標(biāo)記的篩選以及半滑舌鰨遺傳性別鑒定方法的建立。本發(fā)明確定了從半滑舌鰨血液中提取基因組DNA的條件和方法，建立了半滑舌鰨AFLP分析技術(shù)，從64個引物組合中篩選到4個引物組合能夠產(chǎn)生雌性特異DNA片段，篩選出半滑舌鰨雌性特異的AFLP分子標(biāo)記7個，創(chuàng)建了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明首次篩選到半滑舌鰨雌性特異AFLP分子標(biāo)記，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明方法具有先進(jìn)、高效、準(zhǔn)確、可靠的特點，在半滑舌鰨單性苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價值，同時在其它魚類遺傳性別鑒定和性別控制研究中也具有廣闊應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1814793SQ20051004555
公開日2006年8月9日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者陳松林, 李靜, 鄧思平, 田永勝, 沙珍霞 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所