專利名稱：一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因，具體地說(shuō)是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，尤其是一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，因其有溶菌作用，故命名為溶菌酶。溶菌酶作為魚(yú)類的非特異性免疫(先天性免疫)物質(zhì)之一，在魚(yú)體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機(jī)制中起著重要作用?，F(xiàn)已知，溶菌酶是一種呈抗生性的、由淋巴球分泌的溶解性酶.并主要作用于革蘭氏陽(yáng)性菌(G’菌)及某些特定的細(xì)菌；其主要方式之一是溶解細(xì)菌胞壁中的粘多糖。在魚(yú)體內(nèi)，溶菌酶主要存在于血液、肌肉和淋巴組織中；代表一定非特異性免疫水平的溶菌酶活性，在魚(yú)體內(nèi)比在哺乳動(dòng)物體內(nèi)更為重要，因?yàn)轸~(yú)類的特異性免疫(后天性免疫)系統(tǒng)還不完善。國(guó)外關(guān)于魚(yú)類溶菌酶已有較深入研究，如B·Grinde等選擇含溶菌酶較多的虹鱒作溶菌酶基因供體，向溶菌酶含量較少的種類(如大西洋鮭和鱈)的魚(yú)卵中注射溶菌酶基因，從遺傳上改善這些魚(yú)類的免疫狀況。
實(shí)驗(yàn)證明，溶菌酶參與了血清的非特異性防御過(guò)程，1973年netcher和1987年Sia4cki等分別在鰈科魚(yú)類和鯉科魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)，溶菌酶的含量和活性都在免疫后大幅提高。溶菌酶還可與幾丁質(zhì)酶一起作用于細(xì)菌或其他病原的細(xì)胞壁，更有效地攻擊病原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種安全性好、可增強(qiáng)牙鲆魚(yú)對(duì)病原抵抗能力的牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒。溶菌酶來(lái)源于牙鲆魚(yú)，名稱為牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶重組質(zhì)粒。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列。
所述牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因的編碼蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明克隆了牙鲆魚(yú)溶菌酶基因，然后連接到表達(dá)載體opAFP上。
本發(fā)明基因的目的、用途、意義如下該基因能夠增強(qiáng)魚(yú)類的免疫能力，將溶茵酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒轉(zhuǎn)入牙鲆魚(yú)(轉(zhuǎn)基因牙鲆)中也可以增強(qiáng)其免疫力，增強(qiáng)牙鲆魚(yú)對(duì)病原的抵抗能力，從而提高產(chǎn)量。同時(shí)，從生物安全性角度考慮，本質(zhì)粒完全克隆自魚(yú)類自身的基因，有利于轉(zhuǎn)基因魚(yú)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到應(yīng)用。


圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒opAFP-ly的構(gòu)建過(guò)程中相關(guān)電泳圖譜；其中，A示RT-PCR擴(kuò)增出的長(zhǎng)度約為486bp的Lysozyme基因；B示引物A、B篩選克隆opAFP-ly擴(kuò)增出的長(zhǎng)度約為692bp的陽(yáng)性帶；C示PstI酶切陽(yáng)性克隆opAFP-ly，酶切片段長(zhǎng)度約為1.8kb(圖1C)的為插入片段為正向的陽(yáng)性克?。籑1，M2為DNA size markers，M1為λDNA/HindIII，M2為100bp DNAladder plus；圖2為經(jīng)EcoR I酶切后的線性化全魚(yú)基因元件模式圖；其中，A示opAFPpromoter；B示opAFP 5’untranslated sequence；C示lysozyme gene；D示opAFP 3’sequence；圖3為重組質(zhì)粒構(gòu)建的技術(shù)路線。
具體實(shí)施例方式
一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒，具有如下特征(1)序列特征長(zhǎng)度38716堿基對(duì)；類型核苷酸；鏈型單鏈；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型DNA(3)假設(shè)否(4)反義否(5)最初來(lái)源牙鲆魚(yú)(Paralichthys olivaceus)。
其序列如下GGATCCCCCAGAATGAGCTGGAACATGTTGCGGGGAGAGGGAAGTCTGGGTCAGCCTGCTTGGCCTGCTGCCACCGTGACCCGACCTCAGATAAGCGGAGGAAAATGGATGGATGGATTGAATCACAGAATGTTTCTGAAGACAGATATCACCTTCGCTTCAAAGAGGTGCGCACCTGGGCAGGCACCCACACAGCCACACAAATGGCATATGAATCAACCAAGAAGACGGTTGGAACTGGTCAAAACCTTCACTATACCATGTGTGACAGTTGTTTGTCACAGTGTATAAAAGACAGGGACTTAGAGACAGAGCTCTGAGCAGCTATGAGATTGTAGTTTGGCCAGGATGCGCTTAAGACCTTTGTGATGAAAAGTTATCAAATTCGTGAGTTTTCATGGAAGAACCTTGACGTGGCGTGGTGGCCATTTTGCGTCATTCGGCATGGAAAAGGAAGTCGTTATAACTCCCAGGTACATTATCTTATCTACACAAAATGTCTAATGCATGATACTACTTAAAGCCTGAGCATATTTCAAGGCCAGCACTTTTCAATAACTCATAGGCCACCTGCTGGCAAAAGGAAATGCCACATTTTATACTTTTATTTACTCCTAGACAGTTGACCTGATCAGTCTCAAATTTGGTAAGGATAGCCTTAAGACAATGAAGATGCTTCATCAGGAATATTGTGAGTTGTCGTTGAACGTTGTTGCCGTGGCAACGCATCATTCGCCATGAAAAAGAAGCTGATGGTTCAGTGGCTTGGGATGCTCAAAAAGTCATGGAACTTTGTACATGTGTCATAATTGATGGGAAGTTGTATGGGTTTTTGGCTTGCTTGTTATAAATTGTCTCCATAGCGCCCCCTACAATATTTCAAAAGAGCAGCCCCAGTGCTACGTACATGTATGAAACTTAGTAGCCAGATGTACCATATAGAGACTTACAAAAAGGTATCTTGGCCATGCTCTCAACCGTACTGGAAGTCGGCCATTTTGATTTTTGCATAATTTTTCAATAGATTTTTGCACATTTGTAATCGCTATACTTTAACGAACTCCTCCAAGGAACTTTGTCTAATCAATTTCAAATTTTGTCAGTACAATCTCAGTACTACAGTACCAAATCTACAGTTCTGCATCTCGTAGCTGCTCAGAGGTCTGTCTCTAAGTCCCTGTCTTTTATACACTGTGACAAACAACTGTCACACATGGTATAGTGAAGGTTTTGACCAGTTCCAACCGTCTTGTTGGTTGATTCATATGCCATTCGTGTGGCTGTGTGGGTGCCTACCCAGATGCGCACCTCTTTGAAGCGAATGTGATATCTGTCTTCATAAACATTCTGTTATTAGCAAGTTCATATGAGAATGAAGGCTGTATGCAAACAGGTGCACAGTCTGTTTCTAAGCATCATGGAAAAGTACAAGCAATTTGCACAAATCATTCTGTATTTTTCCAATAGCTAACAATGTCACCGGGACATTGTGCTATTGGATAGAAGAGACCAGCTGATCTAGACAGTTGATATCATGATCAACAGCCCCAAACAACAAGTGTGCATGCGCGAGGAGTGATTGGCAGATGTATGAGAACTAAACCACTGACTGAACTTGCACTAGAGGCATCTATTTTGTCTTTTCTCATATGATGTTGGGATGGCACATGGGAGTTTTTCCCCTGTCTCAGCTTGCTTTTTACCCCAAATATTGTATATCTATTAGAACCGTTGTCACAGGGTTCAAATTAACGTTTTAGTTTAGTTTTGATCATGATATACACATTTTATCCGTAAAGCATGTGCATATACAGTAAGGGCTTGTTATTCGACAGCAAGAAGAAGAGGATATGTGTGCAGGCAGTCAGCTAATGCATGGATCACAAGTTATAGAATGCAAGCTTGTGATAGTTTGGACAAAAACAAGTTATACTTTACTTATAAGAATATAAAATTTCCATTGCAATTGGCATAAGGAGGTGTGACACAGTGACCTACTTTCAGGCCAATAGGAAACGGGATATGCCGGTTAAGTCCTCCCACATACTGTATATTAGATGCAGCACATGGACCTGTCCTGTCAGAAGTCTCAGCTACAGCTTTCACTTCGATCCAGATCTTTTCACTTCGATCTCCGATAATTAATTAATTAATTAATTATTAATTAATTAAGTCTCAGCCACCGTTGACGATT AATCAGAGAAACATCATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCCAACGCTCGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAATCAGGGGATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTGTCTGAGTGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACAACACTGATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCTGGTGGTGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATCAGATGCAGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGTGCCAAAAGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGGCGTGGCGTCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCAGGATGTGGTCTGTAAAAGCAACAT AATCTCTAGAGGATCCCCAACTGAACATGTCAAAACCTGTGGAGACTGTTGAGATTTGATGTTCTGAAAAGATAAAGCCTATAAATAAAATGTTGCCCAAATTTCCTGCCTGATGTTTTTCTTTGTCTTTGCTACATGGCTTTGCTGCTCGGATCGGCTCACTCTGTGTATGCCACGTTCACTTTGTACTCTCCTTCTCACGGTAGGTTTATTATTTTTAGATGTGCAGTTAGTTTCTGTGAAATAACACACCACACACTGATATTGTCTGTGCATTGACTTGGTGAGTGCACATTGTTTTTGATCTTGACATATTTATATTTGATTGATCAGGTGAACTGTGTGAATCTAAAGTGCTCCATACAGATGTTCTGCATTGAAAATATTCTCATTTTATTAGTGGAAGTGAGTGTATGCCACATCCAATCAATTTCAGCAAACACCCCAGTATGATTTAATGCAAAAAAATGAAGGTATCAAACACGCATTACTACTTTGCAGTTAAATATTTAACATTTATTCCAACACGAAAAAAAGCAGTAAATAACACTTTGACAAACACGTCAGGACATCTTATTTTTGTCACCCTCACAGGCAATTTAGTATAATATATTATATATATATATATATCATATAATAATATTCAGTATAATATATATATATATATCATATTATAATATTCAGTATAATATAAAACACAAACACATATATGTATAATATAATATAACATTTTTATTTATTGAGATGCCTCTATGGACCGTGTTATAAGAAGTAAAGATCAGGAGAAGTAAACATGAAGTGTAATTATGAATACTGATGTTAAATTAAGCTATGATGAGTTTTCACTGTTAATTTACCATCTCAATTAAATGTTGATGCCTCCATGACCAAGTTAAGCAGATGAGACTGAGACAACTGTAGAAGACAAGATGTTCACTTTGCTGAATATAGCTGGCTTGACAGTTATCTATGACTCTATAAATATATATATATTTTTTTTTTTATAAAATGATTTATTTATAACTATATATCCATTTCTCAGACAGGTGCTTCATATCCCTCACTCCCGTAGCTGTCCATGCTGGATCTGTCCCCGTTGTTTTTAAAAAGCTAAATAAGTTATTAACATGACTGCATCCAGCGAGCCAAACCTGTCTGGTGTACAGCTACCAGAGAAGCTT在序列中，帶下劃線的部份代表編碼區(qū)，其序列為ATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCCAACGCTCGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAATCAGGGGATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTGTCTGAGTGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACAACACTGATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCTGGTGGTGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATCAGATGCAGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGTGCCAAAAGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGGCGTGGCGTCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCAGGATGTGGT共426bp，在原序列上的位置為2230-2655。它編碼的蛋白質(zhì)序列為MRTLVVLLLVAVANARVYERCEWARLLRNQGMDGYRGISLANWVCLSEWESRYNTRATNHNTDGSTDYGIFQINSRWWCNDSQTPTSNACNIRCSELLTDDVIVAIKCAKRVVRDPNGIGAWVAWRQHCQGQDLSSYLAGCG，共142個(gè)堿基。倆個(gè)雙下劃線部分為RT-PCR的引物，兩個(gè)之間的部分是RT-PCR的產(chǎn)物，堿基對(duì)2195-2690，共496bp。
其具體制備過(guò)程如下1牙鲆c型溶菌酶基因的分離a.RNA提取利用15月齡的牙鲆外周血(背部抽血)單個(gè)核細(xì)胞作為RNA提取來(lái)源。將細(xì)胞按照不低于1∶10(重量g體積ml)加入TRIZOL試劑(TRIROLTM試劑盒購(gòu)自LIFE TECHNOLOGY公司)，冰上用研磨棒碾磨后，室溫下溫浴5分鐘，然后按照每毫升TRIZOL加0.2毫升的氯仿的比例加入氯仿，劇烈振蕩15秒，然后室溫放置3分鐘，然后4℃12000g離心15分鐘；取水相，按照每毫升TRIZOL試劑加入0.5毫升異丙醇的比例加入異丙醇，混勻后室溫溫浴10分鐘，然后4℃12000g離心10分鐘；棄上清，用75％的乙醇(每毫升TRIZOL用1毫升75％的乙醇)洗滌沉淀，然后4℃7500g離心5分鐘，棄上清，自然沉淀干燥，用無(wú)Rnase的水溶解沉淀；b.RT-PCR引物設(shè)計(jì)按照牙鲆(Paralichthys olivaceus)c型溶菌酶cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物P15’gtagctgcagctgtggagac，P2 5’aatcaccggagatgtttcag；P1 5’端帶Pst I酶切位點(diǎn)；c.RT-PCR(RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司)在10μl無(wú)Rnase的無(wú)菌水中加入2μgRNA和1μg引物，70℃水浴5分鐘，然后立即放在冰上冷卻。然后按照下列順序加入試劑M-MLV 5×Reaction Buffer 5μl，dATP 10mM 1.25μl，dCTP 10mM1.25μl，dGTP 10mM 1.25μl，dTTP 10mM 1.25μl，rRNasinRibonuclease Inhibitor 25units，M-MLV RT 200units；加無(wú)Rnase的無(wú)菌水至25μl，輕輕混勻后42℃水浴60分鐘，然后做PCR；PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s；循環(huán)30次，72℃延伸10min。
2構(gòu)建“全魚(yú)”元件基因a.RT-PCR產(chǎn)物純化使用試劑盒膠回收(小量)試劑盒(GelExtraction Mini Kit(Watson Biotechnologies)上海華舜生物工程有限公司，W5211)純化產(chǎn)物。
將產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖電泳，切取目的片斷膠塊，稱重后加入三倍體積的試劑盒中的S1液(上海華舜生物工程有限公司，W5211)，50℃水浴10分鐘，使膠塊完全融化，加入與S1液等體積的異丙醇，50℃水浴1分鐘，將液體轉(zhuǎn)移至吸附柱(上海華舜生物工程有限公司，W5211)中，12000rpm離心30秒，棄離出液，加入500微升試劑盒中的W1液上海華舜生物工程有限公司，W5211)，12000rpm離心15秒，棄離出液，加入500微升W1液，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心15秒，棄離出液，12000rpm離心1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的1.5毫升的離心管中，加入30微升試劑盒中的T1液(上海華舜生物工程有限公司，W5211)于柱中心，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，零下20℃保存。
b.回收產(chǎn)物與載體的連接回收產(chǎn)物與PMD-T載體在T4DNA連接酶(takara)的作用下室溫連接3小時(shí)；連接反應(yīng)體系如下回收產(chǎn)物3μl；PMD-T載體1μl；10×連接緩沖液1μl；無(wú)菌水5μl；總體積10μl。
c.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化加10微升連接產(chǎn)物至100微升感受態(tài)細(xì)胞DH-5α中，冰上放置35分鐘，42℃水浴45秒，冰上放2分鐘，加500微升LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨1％酵母粉0.5％NaCl 0.5％)，37℃培養(yǎng)50分鐘，鋪于加10μl IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和50μl X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的含氨芐青霉素的LB平板上，37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
d.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)挑取白色單菌落(陽(yáng)性克隆)接種于含有50μl/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；5000rpm 5分鐘收集菌體，PCR方法檢測(cè)確定陽(yáng)性克隆PMD-T-ly，并送至博亞測(cè)序。
e.PMD-T-ly的小量提取挑取白色單菌落(陽(yáng)性克隆)接種于含有50μl/ml氨芐青霉素的2.5毫升LB液體培養(yǎng)基中，37℃下220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；5000rpm 5分鐘收集菌體，棄上清，加入200微升溶液1，劇烈振蕩混勻，加入200微升溶液2，輕輕混勻，室溫放置5分鐘，加入200微升溶液3，混勻后冰上放置5分鐘；然后12000rpm離心5分鐘；轉(zhuǎn)移上層液體至干凈的1.5毫升的離心管，加入600微升異丙醇，混勻后冰上放置5分鐘；然后12000rpm離心5分鐘；把異丙醇抽吸凈，加入300微升70％乙醇，振蕩后12000rpm離心5分鐘，將乙醇抽吸干凈，風(fēng)干后溶于40微升無(wú)菌水中。
其中溶液150mMol/L葡萄糖，25mMol/LTris·Cl(PH8.0)，10mMol/LEDTA(PH8.0)；溶液20.2MolNaOH，1％SDS；溶液35Mol/L；f.PMD-T-ly 2的雙酶切和opAFP-V的單酶切用Sma I和HindII(Sangon公司)37℃雙酶切PMD-T-ly(小量提取產(chǎn)物)2小時(shí)，用Hpa I(Sangon公司)37℃單酶切表達(dá)載體opAFP-V 2小時(shí)，其反應(yīng)體系分別如下PMD-T-ly 2的雙酶切反應(yīng)體系Buffer Y+1μl，DDW 4μl，SmaI 1μl，HindII 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反應(yīng)體系。opAFP-V的單酶切反應(yīng)體系Buffer Y+1μl，DDW 5μl，HpaI 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反應(yīng)體系。
g.酶切產(chǎn)物純化后(方法同2-a)，將ly基因片段和線性化的表達(dá)載體opAFP-V在T4DNA連接酶(takara)作用下室溫進(jìn)行平末端連接3小時(shí)，并轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)DH-5α，鋪于加10μl IPTG和50μl X-gal的含氨芐青霉素的LB平板上，37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
h.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)挑取白色單菌落(陽(yáng)性克隆)接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜；5000rpm 5分鐘收集菌體，PCR方法檢測(cè)確定陽(yáng)性克隆opAFP-ly，測(cè)序(方法同2-d)。測(cè)序結(jié)果表明該質(zhì)粒構(gòu)建正確。
PCR檢測(cè)引物A、B，A5’atctcaacagtctccacaggt；B5’tctgctgatgccagtcttact。
PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；循環(huán)30次，72℃延伸10min。
牙鲆全魚(yú)SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120>一種牙鲆″全魚(yú)″溶茵酶基因重組質(zhì)粒<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3871<212>DNA<213>牙鲆魚(yú)(Paralichthys olivaceus)<220>
<221>CDS<222>(2230)..(2655)<223>
<400>1ggatccccca gaatgagctg gaacatgttg cggggagagg gaagtctggg tcagcctgct 60tggcctgctg ccaccgtgac ccgacctcag ataagcggag gaaaatggat ggatggattg120aatcacagaa tgtttctgaa gacagatatc accttcgctt caaagaggtg cgcacctggg180caggcaccca cacagccaca caaatggcat atgaatcaac caagaagacg gttggaactg240gtcaaaacct tcactatacc atgtgtgaca gttgtttgtc acagtgtata aaagacaggg300acttagagac agagctctga gcagctatga gattgtagtt tggccaggat gcgcttaaga360cctttgtgat gaaaagttat caaattcgtg agttttcatg gaagaacctt gacgtggcgt420ggtggccatt ttgcgtcatt cggcatggaa aaggaagtcg ttataactcc caggtacatt480atcttatcta cacaaaatgt ctaatgcatg atactactta aagcctgagc atatttcaag540gccagcactt ttcaataact cataggccac ctgctggcaa aaggaaatgc cacattttat600acttttattt actcctagac agttgacctg atcagtctca aatttggtaa ggatagcctt660aagacaatga agatgcttca tcaggaatat tgtgagttgt cgttgaacgt tgttgccgtg720gcaacgcatc attcgccatg aaaaagaagc tgatggttca gtggcttggg atgctcaaaa780agtcatggaa ctttgtacat gtgtcataat tgatgggaag ttgtatgggt ttttggcttg840cttgttataa attgtctcca tagcgccccc tacaatattt caaaagagca gccccagtgc900tacgtacatg tatgaaactt agtagccaga tgtaccatat agagacttac aaaaaggtat960cttggccatg ctctcaaccg tactggaagt cggccatttt gatttttgca taatttttca 1020
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權(quán)利要求
1.一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列中的2195-2690堿基序列。
2.一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列。
3.一種權(quán)利要求1所述牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因的編碼蛋白，其特征在于具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因，具體地說(shuō)是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，尤其是一種牙鲆“全魚(yú)”溶茵酶基因重組質(zhì)粒，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列。該基因能夠增強(qiáng)魚(yú)類的免疫能力，將溶茵酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒轉(zhuǎn)入牙鲆魚(yú)(轉(zhuǎn)基因牙鲆)中也可以增強(qiáng)其免疫力，增強(qiáng)牙鲆魚(yú)對(duì)病原的抵抗能力，從而提高產(chǎn)量。同時(shí)，從生物安全性角度考慮，本質(zhì)粒完全克隆自魚(yú)類自身的基因，有利于轉(zhuǎn)基因魚(yú)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/36GK1837368SQ200510046100
公開(kāi)日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者紀(jì)偉, 張培軍, 劉慶華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所