專利名稱：一種原核表達載體pASK－75－EX的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原核表達載體，具體地說是采用設(shè)計并合成的載體克隆表達區(qū)基因構(gòu)建成一種新型原核表達載體pASK-75-EX。
背景技術(shù)：
載體pASK-75是一種在大腸桿菌中表達外源蛋白的高效表達載體，其嚴緊型控制的啟動子tetA保證了在誘導(dǎo)物缺失的情況下對外源基因的表達抑制，適合表達對宿主菌有細胞毒性的外源蛋白，微量的四環(huán)素即可充分誘導(dǎo)tetA啟動子的啟動，使其具有較高的表達效率。另外，tetA啟動子表達系統(tǒng)不受任何其它細胞調(diào)節(jié)機制的控制，因此對表達宿主菌的選擇沒有限制。但是pASK-75的多克隆位點缺乏常見的高活力的限制性內(nèi)切酶位點，且其下游融合的Strep-tag純化標簽需要極高的純化成本，限制了pASK-75的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用方便、廉價的原核表達載體pASK-75-EX。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對pASK-75載體進行改造，保留了tetA啟動子序列和OmpA信號肽序列，新添加了含常用限制性內(nèi)切酶的多克隆位點，并以His-tag標簽取代Strep-tag，構(gòu)建成新型表達載體pASK-75-EX。與原載體相比，pASK-75-EX使外源基因的克隆和外源蛋白的純化檢測更方便廉價；本發(fā)明設(shè)計并合成載體克隆表達區(qū)基因，包括StuI、NcoI、ShpI、EcoRI、NotI、BglII、XhoI和PstI限制性內(nèi)切酶位點，His-tag純化鑒定標簽，其具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列；設(shè)計并合成的載體克隆表達區(qū)基因堿基序列如下CCTGGCCCAG CCGGCCCATG GCATGCGAAT TCGCGGCCGC 40AGATCTGCTC GAGCTGCAGC ATCATCATCA TCATCATA78利用限制性核酸內(nèi)切酶StuI和Hind III的酶切連接技術(shù)，將合成的載體克隆表達區(qū)基因整合入表達載體pASK-75克隆表達區(qū)(替代原pASK-75表達載體201位至292位的堿基序列)，構(gòu)建成新型表達載體pASK-75-EX。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明構(gòu)建的新型表達載體pASK-75-EX具有含多種常用限制性內(nèi)切酶組成的多克隆位點，大大方便了外源基因的克隆。
2.本發(fā)明構(gòu)建的新型表達載體pASK-75-EX以His-tag純化鑒定標簽替換原載體的Strep-tag純化鑒定標簽，簡化了對表達的外源蛋白純化和鑒定的操作，并顯著降低了純化和鑒定的成本。
3.本發(fā)明保留了原載體的tetA啟動子序列和OmpA信號肽序列，保持了新構(gòu)建的表達載體pASK-75-EX對外源基因的嚴緊型表達控制。
4.應(yīng)用實施例制備的新型表達載體，方便廉價的實現(xiàn)了對單鏈抗體蛋白(scFv-ML)和融合免疫毒素蛋白(B-L-SEC2)的表達、純化和生物學(xué)鑒定。


圖1為pASK-75-EX多克隆位點的單酶切驗證以1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果圖，其中1.未經(jīng)酶切的原始pASK75質(zhì)粒，2.未經(jīng)酶切的pASK75-EX質(zhì)粒，3-7.分別經(jīng)SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI單酶切后的pASK75-EX質(zhì)粒，4.DL2000DNA分子量標準圖2為利用引入的His-tag將表達的單鏈抗體ML蛋白經(jīng)Ni親和層析柱純化后的結(jié)果。
圖3為利用引入的His-tag將表達的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白經(jīng)Ni親和層析柱純化后的結(jié)果。
圖4為利用引入的His-tag將表達的單鏈抗體ML蛋白經(jīng)蛋白免疫印記法鑒定的結(jié)果。
圖5為利用引入的His-tag將表達的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白經(jīng)蛋白免疫印記法鑒定的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1載體克隆表達區(qū)基因的制備，其具有序列表SEQ ID NO1中所示的堿基序列ACCATCGAATGGCCAGATGATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTGGCCCAGCCGGCCCATGGCATGCGAATTCGCGGCCGCAGATCTGCTCGAGCTGCAGCATCATCATCATCATCATAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCTCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACG
CCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTGATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAGGAATTAATGATGTCTCGTTTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCAGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAAAAGCAGCATAACCTTTTTCCGTGATGGTAACTTCACTAGTTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGACCCGAC以上載體的序列是利用限制性核酸內(nèi)切酶StuI和Hind III的酶切連接技術(shù)，將合成的載體克隆表達區(qū)基因(以上序列中帶下劃線部分的堿基序列片段)整合入表達載體pASK-75克隆表達區(qū)(替代原pASK-75表達載體201位至292位的堿基序列，替換前序列片段為CCTGAGACCAGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCTCGAGGTCGACCTGCAGGCAGCGCTTGGCGTCACCCGCAGTTCGGTGGTTAATA)，構(gòu)建成新型表達載體pASK-75-EX。
(1)SEQ ID NO.1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度3252堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA
(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源載體pASK-75(2)載體克隆表達區(qū)基因的制備1)載體克隆表達區(qū)基因的設(shè)計合成根據(jù)構(gòu)建新型表達載體的預(yù)期目的，設(shè)計并合成兩條寡聚核苷酸鏈正向鏈p-F5’-CC TGG CCC AGC CGG CCC ATG GCA TGC GAATTC GCG GCC GCA GAT CTG CTC GAG CTG CAG CAT CAT CAT CATCAT CATA-3’；反向鏈p-R5’-A GCT ATG ATG ATG ATG ATG ATG GTC CAG CTCGAG CAG ATC TGC GGC CGC GAA TTC GCA TGC CAT GGG CCG GCTGGG CCA GG-3’2)寡聚核苷酸鏈的退火10×退火雜交緩沖液(SSC)成分1.5mol/L NaCl0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，以HCl調(diào)pH至7.0退火反應(yīng)體系10×SSC buffer 1μl正反寡聚核苷酸鏈 各5pmol無菌超純水 補齊體積至10μl退火反應(yīng)條件94℃10min；0℃10min；72℃20min；實施例2新型表達載體pASK-75-EX的構(gòu)建(1)pASK-75載體的雙酶切將德國Biometra公司pASK-75載體質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶StuI和HindIII充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收純化3200bp大片段；(2)酶切產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化將退火的寡聚核苷酸鏈和pASK-75載體大片段以5∶1的摩爾比例混合，并以T4DNA連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建成表達載體pASK-75-EX。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，以氨卞青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。
(3)表達載體pASK-75-EX的驗證將挑選的陽性轉(zhuǎn)化子擴培，提取質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒DNA提取方法按J.薩姆布魯克，E.F.費里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》美國紐約冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，分別經(jīng)僅存在于設(shè)計的載體克隆表達區(qū)的限制性內(nèi)切酶SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI單酶切鑒定(附圖1)，并以Sanger雙脫氧末端終止法測序證實。
實施例3新型表達載體pASK-75-EX的實際應(yīng)用及效果評價(1)將外源基因片段連接入新型表達載體pASK-75-EX將pASK-75-EX質(zhì)粒DNA和含有單鏈抗體ML基因的pET-28a-ml質(zhì)粒DNA分別用Nco I、Not I雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收770bp的ml片段及pASK-75-EX質(zhì)粒3200bp片段，以T4 DNA連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建單鏈抗體蛋白表達載體pASK-75-EX-ml。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞。以氨卞青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，挑選重組克隆擴培，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Nco I、Not I雙酶切鑒定正確重組克隆。
同樣方法以NcoI、XhoI雙酶切pASK-75-EX質(zhì)粒和含有融合免疫毒素基因的pET-28a-b-l-sec2質(zhì)粒DNA，構(gòu)建融合免疫毒素蛋白表達載體pASK-75-EX-b-l-sec2。
(2)外源蛋白的表達分別接種轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pASK-75-EX-ml和pASK75-EX-b-l-sec2的BL21(DE3)單菌落于含100μg/ml氨卞青霉素的液體LB中37℃過夜，次日按1∶50轉(zhuǎn)接，37℃培養(yǎng)至OD6000.8，加入終濃度為0.2ug/ml的四環(huán)素37℃誘導(dǎo)6h。
(3)利用新引入的His-tag標簽純化外源蛋白離心收集誘導(dǎo)表達后的菌體，每100ml原培養(yǎng)物的菌體重懸于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.5的緩沖液，加0.025％溶菌酶于37℃裂解細胞，于0℃超聲破碎直至菌液變的清亮，12000g離心20min收集上清，上樣于平衡緩沖液平衡好的Ni親和層析柱(購自美國Novagen公司)，以平衡結(jié)合緩沖液(5mmol/L咪唑，0.5MNaCl，20mmol/L Tris-HCl pH7.5)平衡至基線，用含100mmol/L咪唑的平衡結(jié)合緩沖液洗脫目的蛋白，并以SDS-PAGE分析純度(附圖2，3)。(SDS-PAGE具體操作方法按郭堯君《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》科學(xué)出版社1999年第一版P132)。單鏈抗體ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2的分子量分別為35kD和60kD。
(4)利用新引入的His-tag標簽以蛋白免疫印記法鑒定外源蛋白將純化后的單鏈抗體ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2以SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，2％脫脂牛奶封閉，以兔抗His-tag抗體、堿性磷酸酶標記的羊抗兔抗體依次處理，NBT/BCIP顯色試劑盒顯色(附圖4，5)。(所用緩沖液和具體操作方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》科學(xué)出版社2002第一版P166)
SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>一種原核表達載體pASK-75-EX<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3252<212>DNA<213>載體pASK-75<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3252)<223>
<400>1accatcgaat ggccagatga ttaattccta atttttgttg acactctatc attgatagag 60ttattttacc actcccratc agtgatagag aaaagtgaaa tgaatagttc gacaaaaatc 120tagataacga gggcaaaaaa tgaaaaagac agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg 180tttcgctacc gtagcgcagg cctggcccag ccggcccatg gcatgcgaat tcgcggccgc 240agatctgctc gagctgcagc atcatcatca tcatcataag cttgacctgt gaagtgaaaa 300atggcgcaca ttgtgcgaca ttttttttgt ctgccgttta ccgctactgc gtcacggatc 360tccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 420ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 480ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 540ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 600ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 660gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 720tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 780ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa 840atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 900tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 960aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc1020
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1.一種原核表達載體pASK-75-EX，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及原核表達載體，采用設(shè)計并合成的載體克隆表達區(qū)基因構(gòu)建成一種新型原核表達載體pASK－75－EX，其具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列；其具有常見的限制性核酸內(nèi)切酶組成的多克隆位點和純化檢測標簽。結(jié)果表明pASK－75－EX可高效表達外源蛋白scFv－ML與B－L－SEC2，且其表達產(chǎn)物由于載體中新添加的純化檢測標簽而可被方便廉價的純化和檢測。
文檔編號C12N15/74GK1840666SQ200510046140
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者徐明愷, 張惠文, 張成剛 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所