專利名稱：融合免疫毒素ml－l－sec2和基因及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程制藥，具體的說是一種新型的抗人類表皮生長因子受體HER-2—金黃色葡萄球菌腸毒素C2融合免疫毒素ML-L-SEC2基因ml-l-sec2及其制備。
背景技術(shù)：
免疫毒素是在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)上提出的一種新的治療策略，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。融合免疫毒素是由靶向分子和細(xì)胞毒性分子結(jié)合而成的產(chǎn)物，抗體或基因工程抗體可變區(qū)片段常作為靶向分子，近年來單鏈抗體片段(Single Chain Variable Fragment，scFv)因其分子量小、腫瘤穿透力強(qiáng)、血液清除快和半衰期短等特點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于藥物靶向載體的研究。
人表皮生長因子受體2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER-2)是一種腫瘤相關(guān)抗原，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30％的過表達(dá)，并且其過表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。HER-2受體表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，是腫瘤靶向治療的合適靶點(diǎn)。目前，以抗HER-2單鏈抗體作為導(dǎo)向載體對HER-2過表達(dá)的腫瘤進(jìn)行靶向性治療已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。
金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)屬于C類腸毒素家族中的第二亞型。作為一種超抗原，在極低濃度時，即能與主要組織相容性復(fù)合體二類分子(MHCII)結(jié)合，刺激大部分有T細(xì)胞受體Vβ(TCRVβ)序列的T細(xì)胞增殖，使之釋放多種細(xì)胞因子如IL-2，IFN-γ，和TNF等，在體外和體內(nèi)產(chǎn)生極強(qiáng)的腫瘤抑制作用。在國內(nèi)，SEC2已經(jīng)應(yīng)用于臨床腫瘤治療并取得了良好的治療效果。然而MHCII類分子主要表達(dá)于正常的人體細(xì)胞，而腫瘤組織中表達(dá)量很少，這使SEC2的腫瘤治療缺乏特異性而產(chǎn)生副反應(yīng)。因此尋找一種合適的可將SEC2靶向性導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)載體對于SEC2的腫瘤治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種融合免疫毒素ML-L-SEC2和基因及其制備，本發(fā)明以抗HER-2單鏈抗體作為靶向分子，以SEC2作為效應(yīng)分子，經(jīng)短肽連接構(gòu)建成融合免疫毒素B-L-SEC2，并以表達(dá)載體pET-32a在大腸桿菌中高效表達(dá)融合免疫毒素蛋白。該融合免疫毒素可特異性識別結(jié)合HER-2受體過表達(dá)的癌細(xì)胞，并對其產(chǎn)生特異性細(xì)胞抑制作用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為融合免疫毒素ML-L-SEC2，具有序列表SEQ ID No2中蛋白序列。
融合免疫毒素ML-L-SEC2基因，具有序列表SEQ ID No1中堿基序列。
所述融合免疫毒素ML-L-SEC2基因的制備，是將人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9(具有序列表SEQ ID No3中堿基序列)和金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)基因sec2通過編碼連接短肽的DNA Linker以限制性核酸內(nèi)切酶連接技術(shù)連接，所得到的融合免疫毒素基因具有序列表SEQ IDNo1中堿基序列；所述連接短肽DNA Linker的堿基序列為，GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC；所述金黃色葡萄球菌腸毒素C2具有序列表SEQ ID No5中堿基序列。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明構(gòu)建了新型的融合免疫毒素基因，其為人工制備的新基因，屬首次制得的融合基因；其引入的連接序列保證抗體片段和腸毒素分子各自的生物學(xué)活性。
2.引用本發(fā)明，可進(jìn)一步提供直接用于生產(chǎn)ML-L-SEC2融合免疫毒素的工程菌株。
3.該融合免疫毒素可激活肌體免疫反應(yīng)，在HER-2受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞周圍對該腫瘤產(chǎn)生殺傷作用；消除全身給藥引起的副反應(yīng)，為腫瘤的免疫治療提供了新的途徑。
4.融合免疫毒素分子的大小是抗體分子的1/3，克服了單克隆抗體不易滲透到腫瘤組織的不足，抗腫瘤的作用更為明顯。


圖1為人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為ml3.9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2為SEC2基因sec2的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為sec2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為融合免疫毒素表達(dá)載體pET-32a-ml-l-sec2的雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL15000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為pET-32a-ml-l-sec2的NcoI和XhoI雙酶切驗(yàn)證，3為pET-32a-ml-l-sec2的NcoI和NotI雙酶切驗(yàn)證，4為pET-32a-ml-l-sec2的EcoRI和XhoI雙酶切驗(yàn)證，5為DL 2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖4為融合免疫毒素的大腸桿菌異源表達(dá)SDS-PAGE電泳圖，其中1為誘導(dǎo)的融合免疫毒素的全細(xì)胞表達(dá)，2為誘導(dǎo)的融合免疫毒素的可溶性表達(dá)，3為誘導(dǎo)的融合免疫毒素的包涵體表達(dá)，4為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由上至下分別為116，66，45，35，25，18，14KD)，5為誘導(dǎo)的pET-32a空載體；圖5為表達(dá)的融合免疫毒素的蛋白免疫印記檢測圖，其中1為預(yù)染的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為融合免疫毒素的蛋白免疫印記檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9具有序列表SEQ ID No3中堿基序列。
ATGGCCCAGG TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GCAGAGGTGA AAAAGCCCGG 50GGAGTCTCTG AAGATCTCCT GTAAGGGTTC TGGATACAGC TTTACCAGCT 100ACTGGATCGC CTGGGTGCGC CAGATGCCCG GGAAAGGCCT GGAGTACATG 150GGGCTCATCT ATCCTGGTGA CTCTGACACC AAATACAGCC CGTCCTTCCA 200AGGCCAGGTC ACCATCTCAG TCGACAAGTC CGTCAGCACT GCCTACTTGC 250AATGGAGCAG TCTGAAGCCC TCGGACAGCG CCGTGTATTT TTGTGCGAGA 300CATGACGTGG GATATTGCAG TAGTTCCAAC TGCGCAAAGT GGCCTGAATA 350CTTCCAGCAT TGGGGCCAGG GCACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG 400GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC TCTGGCGGTG GCGGATCGCA GTCTGTGTTG 450ACGCAGCCGC CCTCAGTGTC TGCGGCCCCA GGACAGAAGG TCACCATCTC 500CTGCTCTGGA AGCAGCTCCA ACATTGGGAA TAATTATGTA TCCTGGTACC 550AGCAGCTCCC AGGAACAGCC CCCAAACTCC TCATCTATGA TCACACCAAT 600CGGCCCGCAG GGGTCCCTGA CCGATTCTCT GGCTCCAAGT CTGGCACCTC 650AGCCTCCCTG GCCATCAGTG GGTTCCGGTC CGAGGATGAG GCTGATTATT 700ACTGTGCCTC CTGGGACTAC ACCCTCTCGG GCTGGGTGTT CGGCGGAGGA 750ACCAAGCTGA CCGTCCTAGG TGCG 774(1)SEQ ID No3的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度774堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9。
(2)人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9的制備上游引物V-F5’-TTA TCCATGGCC CAG GTG CAG CTG GTG CAGTCT-3’；下游引物V-R5’-TTC TGCGGCCGCACC TAG GAC GGT GAC CTTGGTC-3’，橫線所示為添加的酶切位點(diǎn)，上下游分別為NcoI和NotI。
PCR反應(yīng)體系為10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板含scFv-ml的質(zhì)粒DNA 0.1μg、Pyrobest DNA聚合酶2U，無菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。
PCR反應(yīng)條件為第一階段95℃，5分鐘；
第二階段94℃，50秒；55℃，50秒；72℃，90秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，10分鐘；(3)PCR產(chǎn)物的回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見附圖1所示)，切下大小為770bp的目的帶，按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；(4)回收后產(chǎn)物的雙酶切回收后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和NotI充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，再次膠回收。
實(shí)施例2金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)基因sec2，源于金黃色葡萄球菌，具有序列表SEQ ID No5中堿基序列。
GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGCACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAATATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAGCAACTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTATAACATTAGTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTAAATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAACTGCTATTTTTCATCCAAAGATAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTAAAACTTGTATGTATGGAGGAATAACAAAACATGAAGGAAACCACTTTGATAATGGGAACTTACAAAATGTACTTATAAGAGTTTATGAAAATAAAAGAAACACAATTTCTTTTGAAGTGCAAACTGATAAGAAAAGTGTAACAGCTCAAGAACTAGACATAAAAGCTAGGAATTTTTTAATTAATAAAAAAAATTTGTATGAGTTTAACAGTTCACCATATGAAACAGGATATATAAAATTTATTGAAAATAACGGCAATACTTTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACCAATCTAAATATTTAATGATGTACAACGACAATAAAACGGTTGATTCTAAAAGTGTGAAGATAGAAGTCCACCTTACAACAAAGAATGGA(1)SEQ ID No5的信息(參見序列表)(A)序列特征*長度717堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(2)SEC2基因sec2的制備上游引物sec2-F5’-TCTGAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’下游引物sec2-R5’-ATACTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’橫線所示為添加的酶切位點(diǎn)，上下游分別為EcoRI和XhoI。
PCR反應(yīng)體系為10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板含sec2的質(zhì)粒DNA 0.1μg、PyrobestDNA聚合酶2U，無菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。
PCR反應(yīng)條件為第一階段95℃，5分鐘；第二階段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，90秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，10分鐘；(3)PCR產(chǎn)物的回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見附圖2所示)，切下大小為720bp的目的帶，按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；(4)回收后產(chǎn)物的雙酶切回收后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XhoI充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，再次膠回收。
實(shí)施例3編碼連接短肽的DNA Linker序列，具有如下堿基序列(寡聚核苷酸鏈)GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC(1)DNA Linker序列基因的制備1)DNA Linker序列基因的設(shè)計(jì)合成設(shè)計(jì)并合成兩條寡聚核苷酸鏈正向鏈L-F5’-GGCCGCA AGC GGC TCA GGA TCT GGA TCA GGA TCTGGC G-3’；反向鏈L-R5’-AATTCGCC AGA TCC TGA TCC AGA TCC TGA GCCGCT TGC-3’上下游分別添加NotI和EcoRI粘末端，所編碼的甘氨酸絲氨酸短肽為(GS)2序列。
2)寡聚核苷酸鏈的退火10×退火雜交緩沖液(SSC)成分1.5mol/L NaCl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，以HCl調(diào)pH至7.0；退火反應(yīng)體系10×SSC buffer 1μl，正反寡聚核苷酸鏈各5pmol，無菌超純水補(bǔ)齊體積至10μl；退火反應(yīng)條件94℃ 10min；0℃ 10min；72℃ 20min實(shí)施例4融合免疫毒素基因具有序列表SEQ ID No1的堿基序列。
ATGGCCCAGG TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GCAGAGGTGA AAAAGCCCGG 50GGAGTCTCTG AAGATCTCCT GTAAGGGTTC TGGATACAGC TTTACCAGCT 100ACTGGATCGC CTGGGTGCGC CAGATGCCCG GGAAAGGCCT GGAGTACATG 150GGGCTCATCT ATCCTGGTGA CTCTGACACC AAATACAGCC CGTCCTTCCA 200AGGCCAGGTC ACCATCTCAG TCGACAAGTC CGTCAGCACT GCCTACTTGC 250AATGGAGCAG TCTGAAGCCC TCGGACAGCG CCGTGTATTT TTGTGCGAGA 300CATGACGTGG GATATTGCAG TAGTTCCAAC TGCGCAAAGT GGCCTGAATA 350CTTCCAGCAT TGGGGCCAGG GCACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG 400GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC TCTGGCGGTG GCGGATCGCA GTCTGTGTTG 450ACGCAGCCGC CCTCAGTGTC TGCGGCCCCA GGACAGAAGG TCACCATCTC 500
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(3)融合基因的驗(yàn)證將挑選的陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培，提取質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒DNA提取方法按J.薩姆布魯克，E.F.費(fèi)里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》美國紐約冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，經(jīng)雙酶切鑒定(參見附圖3所示)，并以鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒為模板，用T7啟動子和終止子為引物，以Sanger雙脫氧末端終止法測序證實(shí)。
實(shí)施例5融合免疫毒素的表達(dá)及活性鑒定(1)融合免疫毒素的表達(dá)接種轉(zhuǎn)化了pET-32a-ml-l-sec2質(zhì)粒的AD494(DE3)單菌落于含100μg/ml的氨卞青霉素和15μg/ml的卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活化培養(yǎng)，以1％接種量轉(zhuǎn)接下一級，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度1.0mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時。離心收集菌體，以5×上樣緩沖液處理(緩沖液配方和處理方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》科學(xué)出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析表達(dá)產(chǎn)物。
(2)融合免疫毒素的生物學(xué)活性以蛋白免疫印記法鑒定表達(dá)的融合免疫毒素的免疫原性將異源表達(dá)的融合免疫毒素蛋白以SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，2％脫脂牛奶封閉，以兔抗SEC2抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體依次處理，NBT/BCIP顯色試劑盒顯色。(所用緩沖液和具體操作方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》科學(xué)出版社2002第一版P166)。
結(jié)果在工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳中有一條明顯的表達(dá)帶，誘導(dǎo)蛋白分子量約為72kD(參見附圖4所示)。該融合免疫毒素可被抗SEC2抗體特異性識別結(jié)合(參見附圖5所示)，保持了原SEC2蛋白的免疫原性。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>融合免疫毒素ML-L-SEC2和基因及其制備<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1533<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1533)<223>
<400>1atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc48Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc96Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag144Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg192Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro50 55 60tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act240Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr65 70 75 80gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat288Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca336Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala100 105 110aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc384Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc432
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1.融合免疫毒素ML-L-SEC2，其特征在于具有序列表SEQ ID No2中蛋白序列。
2.融合免疫毒素ML-L-SEC2基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNo1中堿基序列。
3.一種權(quán)利要求2所述融合免疫毒素ML-L-SEC2基因的制備，其特征在于人源性抗HER-2的單鏈抗體基因ml3.9和金黃色葡萄球菌腸毒素C2基因sec2通過編碼連接短肽的DNA Linker以限制性核酸內(nèi)切酶連接技術(shù)連接，所得到的融合免疫毒素基因具有序列表SEQ ID No1中堿基序列；所述連接短肽DNA Linker的堿基序列為，GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC；所述金黃色葡萄球菌腸毒素C2具有序列表SEQ ID No5中堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程制藥，具體的說是一種新型的抗人類表皮生長因子受體HER－2－金黃色葡萄球菌腸毒素C2融合免疫毒素ML－L－SEC2基因ml－l－sec2及其制備。其具有序列表SEQ ID No1中堿基序列和序列表SEQID No2中蛋白序列。本發(fā)明以抗HER－2單鏈抗體作為靶向分子，以SEC2作為效應(yīng)分子，經(jīng)短肽連接構(gòu)建成融合免疫毒素B－L－SEC2，并以表達(dá)載體pET－32a在大腸桿菌中高效表達(dá)融合免疫毒素蛋白。該融合免疫毒素可特異性識別結(jié)合HER－2受體過表達(dá)的癌細(xì)胞，并對其產(chǎn)生特異性細(xì)胞抑制作用。
文檔編號C12N15/62GK1891718SQ200510046819
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者徐明愷, 張成剛 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所