專利名稱：一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及參與了對內酯類化合物碳碳雙鍵新的還原方式——一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，即利用微生物中產生的一類還原酶作為生物催化劑將內酯類化合物的α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵還原，其中所述的微生物選自曲霉屬。
背景技術：
生物催化(Biocatalysis)，是指利用酶或有機體(細胞、細胞器等)作為催化劑實現化學轉化的過程，又稱生物轉化(Biotransformation)。生物催化中常用的有機體主要是微生物，其本質是利用微生物細胞內的酶催化外源化合物的生物轉化，又稱微生物生物轉化(Microbial biotransformation)[1]。根據酶催化的反應類型，將酶分為六類氧化還原酶(EC 1)，轉移酶(EC 2)，水解酶(EC 3)，裂解酶(EC 4)，異構酶(EC 5)，and連接酶(EC 6)，其中氧化還原酶和水解酶在生物催化的手性合成中應用最多，約占生物催化用酶的90％[1]。廣泛用于醛或酮羰基以及烯烴碳-碳雙鍵的還原，可使?jié)撌中缘孜镛D化為手性產物，這種還原反應具有立體選擇性，可產生特定構型的化合物，例如面包酵母的烯酸還原酶。是常規(guī)化學還原法無法實現的[1]。因此，生物轉化中的還原反應在手性藥物合成中有著重要的應用。
生物轉化中的還原反應在手性藥物合成中的應用主要涉及對映選擇性地將酮還原為相應的醇，例如在Eli Lilly公司的LY300164[2]、Bristol-MyersSquibb公司的SQ31765[3]和Merck公司的MK0507[4]等藥物的合成路線中，關鍵性的中間體的合成均涉及到對映選擇性地將酮還原為相應的醇的反應。所使用的微生物分別為酵母菌、鮭色諾卡氏菌(Nocardia salmonicolor)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。Patel等人通過Hansenula polymorpha ATCC26012、Hansenula fabiannii ATCC 58045完整細胞及其破碎細胞后的粗酶液、純化的還原酶立體選擇性催化的還原反應將紫杉醇合成中含酮基化合物生物轉化為含羥基的手性中間體[5]。生物轉化烯烴還原方面的研究中，發(fā)現主要酵母菌細胞具有催化α，β-不飽和酯、烯丙醇和α，β-不飽和酮等化合物中α，β雙鍵的的還原[1]。
生物催化的還原反應能使分子內的羰基或碳-碳雙鍵立體選擇性地還原，產生特定構型的化合物，這種生物催化反應可使?jié)撌中缘孜镛D化為手性產物，而常規(guī)化學法還原酮和烯烴則產生消旋體。
生物催化劑是生物催化的核心，并在精細化工和制藥工業(yè)等化學合成領域有著傳統的催化劑不可比擬的優(yōu)勢。與化學催化劑相比，生物催化劑具有以下優(yōu)點高效性 體現在反應速度快，生物催化劑用量小，反應條件溫和，不必要的副反應少，如分解、異構、消旋和重排等反應，而這些反應正是傳統化學催化反應常會發(fā)生的副反應。
選擇性 由于酶對底物的嚴格的專一性識別而具有高度的對映選擇性、區(qū)域選擇性和化學選擇性。
安全性 通常生物催化劑比較安全，反應條件溫和，溶劑通常為水，不需要危險的試劑。例如利用乙醇和葡萄糖等提供氫以替代易爆炸的氫氣。
天然的催化劑 生物催化劑，例如微生物、植物、動物及其酶都是可再生的，并且使用后易被降解。避免了化學催化反應中大量有機溶劑的使用和大量重金屬污染物的污染。因此，生物催化劑是一種環(huán)境友好的催化劑，生物催化是一種可以持續(xù)發(fā)展的技術，是綠色化學研究的重要組成內容。
生物催化的不對稱還原是在脫氫酶或還原酶作用下進行的，反應時需要輔酶作為反應過程中氫或電子的傳遞體，將氫傳遞到底物的羰基碳或碳碳雙鍵上。常用輔酶有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和以及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)他們是氧化還原酶的主要輔酶。80％的氧化還原酶以NADH作為輔酶，10％的氧化還原酶以NADPH為輔酶。少數氧化還原酶以黃素單核苷酸(FMN)和黃素二核苷酸(FAD)作為輔酶。輔酶在參與還原反應過程中需要添加或再生以達到反應所需的化學劑量[1]。其反應機理如附圖1所示，近幾年來有關利用微生物和植物培養(yǎng)細胞進行天然或非天然羰基化合物的不對稱還原反應的報道很多[6，7-10]，廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)、香料、農用化學品和特殊材料等領域中及手性化合物的大規(guī)模生產中，例如在Eli Lilly公司的(-)-LY300164、Bristol-Myers Squibb公司的SQ31765和Merck公司的MK0507等產品的制備中，生物催化的還原反應起著重要作用[11-13]。
碳碳雙鍵的不對稱還原反應，同樣可以在潛手性化合物中引入手性中心，由于整體細胞不對稱還原烯酮的高度對映異構性，使其在α-手性酮的制備中非常有效而且令人注目，因此，同樣應用于手性藥物、精細化工產品合成中的中間體的不對稱合成。但有關碳碳雙鍵的不對稱還原的報道較少，下面就近幾年所報道的生物催化碳碳雙鍵的還原反應進行總結，如表1所示。
表1不對稱還原的生物催化

YYield in the reference20世紀50年代末期發(fā)生在歐洲的“反應?！笔录袐D因服用酞胺哌啶酮(俗稱“反應?！?而導致海豹畸形兒的慘劇[14]。這一事件使人們意識到兩個異構體表現出來的生物活性往往是不同的，甚至是截然相反的。這主要是由于手性是自然界的普遍特征，在生命的產生和演變過程中，自然界往往對一種手性有所偏愛，如自然界存在的糖為D-構型，氨基酸為L-構型，蛋白質和DNA的螺旋構象都是右旋的。當手性藥物、農藥等化合物作用于這個不對稱的生物界時，不同的異構體表現出來的生物活性往往是不同的，甚至是有毒，現在，人們已經較全面地認識到了手性化合物在醫(yī)藥、農藥及其它生物功能材料等多方面都具有重要的作用。例如，左旋抗壞血酸(即維生素C)可用于治療壞血病，而其右旋對應體則無效；R-天冬酰胺是甜的，而S-天冬酰胺是苦的；L-四咪唑是驅蟲劑，D-四咪唑有毒且不能驅蟲。實際上，兩個互為對映異構體的化合物在生物活性、運轉機制以及可能的代謝途徑等方面往往都是不同的。
1992年美國FDA開始要求手性藥物以單一對映體(對映體純)形式上市，同樣食品和農藥也存在著手性要求。這樣就能降低給藥量，簡化劑量-效應的曲線關系，減少副作用。
日益意識到不同旋光異構體的不同活性和逐漸增加的管制的壓力加速了純手性可治療化合物的制造和上市。生物催化的還原反應在催化手性化合物合成的應用中顯示出傳統的化學催化無法比擬的優(yōu)勢，因此生物催化的還原反應在手性化合物的合成中日益顯示出巨大的潛力和重要性[15]。
近年來，手性藥物氨基酸、手性醇、手性環(huán)氧化合物、手性胺等手性化合物已廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)、香料、農用化學品和特殊材料等領域。根據Frost Sullivan的調查，在2002年，全世界手性產品收入已達到70億美元，2004年超過87.5億，預計2009年將會達到149.4億美元，每年將以11.4％的速度增長，手性化合物合成一直是化學家和生物工程專家最關注的研究領域之一[16]。尋找新型生物催化劑也成為手性化合物生物合成的研究熱點之一。
所以在本發(fā)明中成功地利用微生物作為生物催化劑，實現了對內酯類化合物碳碳雙鍵專一性的不對稱還原，在潛手性化合物中引入手性中心使之轉化為手性產物，高效安全且專一性高，是一種新型的綠色的還原方式，并且對于手性藥物或中間體的合成具有重要的意義。以上一些內容在下述參考文獻中有所表述。
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發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種新的對內酯類化合物的還原方式，一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，即利用微生物中的一類還原酶作為生物催化劑將內酯類化合物的α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵還原，有效地實現了對內酯類化合物碳碳不飽和雙鍵專一性的還原，將潛手性化合物生物轉化為手性化合物，能廣泛應用于手性藥物及藥物合成過程中手性中間體的制備，和化學催化劑相比具有高效，安全且專一性高的特點，有效得解決了化學方法較難實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的不對稱還原問題。
本發(fā)明的技術說明1、本發(fā)明所述的微生物
本發(fā)明可以實現對內酯類化合物α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵進行專一性還原反應的可在適宜生產所述還原酶的任何適宜微生物中實現，所述微生物包括但不限于真菌中的酵母菌屬(Saccharomyces)、根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、曲霉屬(Aspergillus)、連格孢霉屬和小克銀漢霉屬(Cunninghamella)等菌株。上述微生物也包括它們按照國際原核生物命名代碼所限定的具有相同物化性質的同物異體或基元異名體名其中曲霉屬雜色組的雜色曲霉原變種(Aspergillus versicolor)及其相關的變種或亞種對本發(fā)明所述的內酯類化合物的α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵還原非常有效。本發(fā)明實施方案中，有效得實現了對內酯類化合物碳碳雙鍵專一性還原的微生物經反復平板劃線分離法得到菌落形態(tài)均勻一致的純培養(yǎng)?，F保藏于本實驗室。采用傳統的形態(tài)學分類鑒定方法對分離株進行鑒定，利用電鏡掃描技術觀察其分生孢子的表面文飾特征，初步將本發(fā)明所述的菌株歸屬于曲霉屬巢狀亞屬雜色組。并在此基礎上，利用ITS-5.8S序列(見圖2)作為分子標記對分離株在分子水平上進行菌種鑒定，即將本發(fā)明所述菌株的ITS-5.8S序列與Genbank中的11個菌株的ITS-5.8S序列進行Clustal W對準，利用DANMAN5.2.2軟件比較本發(fā)明所述菌株的ITS-5.8S序列與Genbank中的A.versicolor和A.sydowii等2個形態(tài)學種共11株菌的ITS-5.8S序列，發(fā)現本菌株的ITS-5.8S與A.versicolor的EPA229、SRRC153、ATCC9577、DAOM222010、NRRL227等5個菌株的ITS-5.8S的同源性分別為99.5％、99.6％、95.7％、95.7％、89.9％，與A.sidowii中的NRRL 250和NRRL 254的ITS-5.8S序列，同源性分別為90.4％、90.5％。進一步用Mega 3.0軟件進行鄰接法聚類得到系統發(fā)育樹(見圖3)對菌種進行歸屬。12個菌株被劃分到了三個獨立的分支中，其中A.sydowii的AJ12221單獨處于一個聚類組中，A.versicolor中的所有的菌株同處一個聚類組中，A.sydowii中的所有的菌株同處一個聚類組中。所以根據進化發(fā)育樹的分析，本發(fā)明所述菌株與A.versicolor同處于一個聚類群中。故將其歸屬于A.versicolor，并將其命名為A.versicolor D-1，經過鑒定發(fā)現本發(fā)明所述的菌種為曲霉屬雜色組的雜色曲霉原變種(A.versicolor)或其相關的變種或亞種。本發(fā)明也可用所述微生物的功能等效物，傳代培養(yǎng)物，突變體和變種。
本發(fā)明所述的實現對內酯類化合物α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵進行專一性的還原反應主要利用的是所述菌種A.versicolor D-1產生的NADPH依賴性還原酶，它是一類存在于胞漿中的可溶性蛋白，而不是一種膜結合的蛋白。
本發(fā)明所述還原酶中胞漿中可溶性蛋白的證明實驗第一階段發(fā)酵培養(yǎng)(Stage I)加入約5ml無菌生理鹽水或無菌的培養(yǎng)基或無菌水于成熟的新鮮斜面制備孢子懸液，將孢子懸液接種到無菌的裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在150-250rpm，28℃條件下振蕩培養(yǎng)48-72小時。將菌體培養(yǎng)物真空抽濾，得到菌絲體和培養(yǎng)液。菌絲體(2g，濕重)經水洗后懸浮于裝有50mL新鮮的轉化培養(yǎng)基的三角瓶中，同時加入適量底物溶液(即內酯類化合物，由適當的溶劑溶解，例如乙醇、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺)。同樣向50mL培養(yǎng)液中加入等量的底物溶液。將二者同時于28℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)8h。采用HPLC分析，在菌絲體的培養(yǎng)液中檢測到還原產物，卻未檢測到底物；相反，在培養(yǎng)液中只檢測到底物，卻未檢測到還原產物。結果說明菌絲體參與了還原反應，推測還原酶存在于細胞內。
采用超速離心法對還原酶進行亞細胞水平定位。利用上述具有還原能力的菌絲體，稱取2g(濕重)水洗菌絲體加入裝有50mL轉化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，同時加入底物溶液，使其終濃度為100-200mg/L。于28℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)2～4h后停止培養(yǎng)，真空抽濾收集菌絲體。以下操作在0-10℃下進行。稱取1g菌絲體(濕重)加入玻璃勻漿器中，同時加入1.5mL Tris-HCl緩沖液和0.5g石英沙進行研磨。將勻漿液于14000×g離心30min，取上清液(14000g)用于制備轉化產物，并貯存于-70℃。
將14000g上清液超速離心(110000×g，60min)，得到110000g上清液和沉淀。將110000g沉淀重新懸浮于緩沖液B中，同110000g上清液同時進行酶活力的測定。結果表明100％的還原酶活力保留在110000g上清液中，而在110000g沉淀懸浮液中未檢測到酶活力。由此說明還原酶是一種存在于胞漿中的可溶性蛋白，而不是一種膜結合的蛋白。
2、本發(fā)明所述的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件本發(fā)明中微生物的生長及其對內酯類化合物的生物轉化需要適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。適合的培養(yǎng)基是指微生物生長和生物轉化所需的必要的營養(yǎng)物質，包括必要的碳源、氮源和微量元素以及添加誘導物。其中誘導物是指可以誘導微生物產生相應酶的化合物，例如在本發(fā)明中內酯類化合物左旋一葉萩堿，將其加入到培養(yǎng)基中，可誘導微生物在細胞內產生相應的酶。培養(yǎng)基的組成成分及其含量的改變均會影響轉化產物的產量和轉化速率。
本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)基包含三種培養(yǎng)基A.斜面培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基由新鮮馬鈴薯及瓊脂組成。
馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過濾，再加瓊脂，融化后補足水至一定體積，121℃蒸汽滅菌30分鐘B.發(fā)酵培養(yǎng)基I蛋白胨(Peptone)1g牛肉膏(Beef extract) 1g酵母膏(Yeast extract) 1g葡萄糖(Glucose)5g蒸餾水(H2O) 1000mlPH 5-.8115℃蒸汽滅菌30分鐘。
C.發(fā)酵培養(yǎng)基II聚蛋白胨(PolyPeptone) 5g
蔗糖(sucrose)15g葡萄糖(Glucose) 15g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 0.01g硫酸鎂(MgSO4)0.5g氯化鉀(KCl)0.5g蒸餾水 1000mlPH 5-8115℃蒸汽滅菌30分鐘培養(yǎng)基的pH范圍在5-8之間，最適pH為7。在培養(yǎng)基滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調至6.5-7.5。在微生物生長和生物轉化的過程中，將pH維持在6-8之間。
適當的培養(yǎng)溫度是微生物生長和生物轉化順利進行的保證。在本發(fā)明中，培養(yǎng)溫度范圍為18-40℃，最適培養(yǎng)溫度為20-30℃。
培養(yǎng)基中的溶氧量也是微生物生長和生物轉化順利進行的保證。在本發(fā)明中，振蕩培養(yǎng)的轉速范圍為150-300rpm，最適的轉速范圍為200-250rpm。
3、本發(fā)明涉及的微生物發(fā)酵和生物轉化的方法，即發(fā)酵轉化法、靜息細胞轉化法和粗酶液轉化法。
A.發(fā)酵轉化法一步發(fā)酵法(single-stage process)微生物在適當的培養(yǎng)基中生長，當獲得大量的微生物培養(yǎng)物后，將反應底物加到微生物培養(yǎng)物中，隨著發(fā)酵的進行，微生物開始進行生物轉化，直至生物轉化結束。
二步發(fā)酵法(two-stage process)1)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)(Stage I)加入約5ml無菌生理鹽水或無菌的培養(yǎng)基或無菌水于成熟的新鮮斜面制備孢子懸液，將孢子懸液接種到無菌的裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在150-250rpm，28℃條件下振蕩培養(yǎng)24-48小時。
2)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)(Stage II)將Stag I發(fā)酵培養(yǎng)物，接種到無菌的新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成成分與第一階段的培養(yǎng)基的組成成分相同，接種量為3％-15％(以菌絲體濕重計，w/v)，200rpm，28℃振蕩培養(yǎng)24-72小時。加入底物溶液(底物由適當的溶劑溶解，例如乙醇、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺，經無菌的0.2μm的過濾器過濾除菌)，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.1-2g/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8-120小時。
B.靜息細胞轉化法將菌株接種到PDA斜面上25℃培養(yǎng)7-14天，產生豐富的分生孢子后，加入約5ml無菌的培養(yǎng)基于成熟的新鮮斜面中制備孢子懸液，將孢子懸液接種到無菌的裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在150-250rpm，28℃條件下振蕩培養(yǎng)24-48小時。通過真空過濾收獲菌絲體，用無菌的50mmol/L、pH7.0磷酸鉀緩沖液洗滌菌絲體后，將菌絲體加入到無菌的裝有30ml磷酸鉀緩沖液(50mmol/L、pH7.0)的三角瓶中，接種量為3-15％(以菌絲體的濕重計，w/v)。同時加入底物溶液(底物由適當的溶劑溶解，例如乙醇、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺，經無菌的0.2μm的過濾器過濾除菌)，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.1-2g/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6-48小時。
C.粗酶液轉化法粗酶液制備方法由新鮮、成熟的本發(fā)明所述菌種斜面培養(yǎng)物制備適當濃度的孢子懸液。將孢子懸液接種到盛有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于20-40℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)48-72h后，將菌體培養(yǎng)物真空抽濾收集菌絲體。菌絲體經無菌水洗滌。稱取2g(濕重)水洗菌絲體加入裝有50mL轉化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，同時加入底物溶液，使其終濃度為100-200mg/L。于20-40℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)2～4h后停止培養(yǎng)，真空抽濾收集菌絲體。以下操作在0-10℃下進行。稱取1g菌絲體(濕重)加入玻璃勻漿器中，同時加入1.5mL Tris-HCl緩沖液和0.5g石英沙進行研磨。將勻漿液于14000×g離心30min，取上清液用于制備轉化產物，并貯存于-70℃。酶法制備轉化產物4.0mL的酶(0.4mg/mL)反應體系包括Tris-HCl緩沖液，pH6.0-10.0、1.0mmol/L NADPH、10mmol/L共軛雙鍵內酯類化合物和粗酶液。酶反應在20-30℃下保溫過夜。對照樣品采用失活的酶液(沸水浴中加熱5min)平行進行。酶反應15min后，從酶反應液中取樣0.2mL，進行適當稀釋，用已知方法如高效液相色譜法，薄層色譜法，氣相色譜法分析轉化產物，利用UV-1575紫外檢測器對酶催化的產物進行在線紫外掃描。
所述酶反應在15-35℃，pH6.0-10.0進行，并有NADPH存在的溶劑中進行所選溶劑為Tris-HCl緩沖液，磷酸緩沖液等，所述的酶反應溫度優(yōu)選20-30℃，pH7.0-9.0。
4.本發(fā)明涉及的轉化產物的分離純化的方法本發(fā)明所使用的分離純化轉化產物的方法包含過濾、抽提、樹脂吸附、硅膠或氧化鋁柱層析、薄層層析、HPLC以及上述方法的適當的任意組合。
5.本發(fā)明涉及的轉化產物的結構鑒定本發(fā)明利用UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS等方法對轉化產物進行結構鑒定。
鑒定比較后發(fā)現本發(fā)明中所述的利用微生物A.versicolor D-1作為生物催化劑對內酯類化合物α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵的還原反應，將潛手性化合物生物轉化為手性化合物


圖1脫氫酶催化的還原反應圖2利用ITS-5.8S序列作為分子標記對分離株在分子水平上進行菌種鑒定
圖3以Aspergillus sp.D-1的ITS-5.8S序列檢索的基因進化樹圖4a左旋一葉萩堿還原反應圖5-a一葉萩堿和14，15-二氫一葉萩堿的HPLC檢測圖5-b一葉萩堿和14，15-二氫一葉萩堿的HPLC檢測圖5-c一葉萩堿和14，15-二氫一葉萩堿的HPLC檢測圖6堿的1H-NMR譜圖7轉化產物的1H-NMR譜圖8堿的13C-NMR譜圖9轉化產物的13C-NMR譜圖10HGT的1H-NMR圖11HGD的1H-NMR圖12HGT的13C-NMR譜圖13HGD的13C-NMR譜圖14NOESY譜。
具體實施例方式實施例1利用從所述微生物A.versicolor D-1采用二步發(fā)酵法可以根據下列方式將左旋一葉萩堿還原為14，15-二氫一葉萩堿(見附圖4)1、培養(yǎng)基A.斜面培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)馬鈴薯200g瓊脂 20g蒸餾水1000mlPH自然馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過濾，再加瓊脂，融化后補足水至1000ml，121℃蒸汽滅菌30分鐘B.發(fā)酵培養(yǎng)基II聚蛋白胨(PolyPeptone) 5g蔗糖(sucrose) 15g葡萄糖(Glucose) 15g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 0.01g硫酸鎂(MgSO4)0.5g氯化鉀(KCl) 0.5g蒸餾水1000mlPH5-8115℃蒸汽滅菌30分鐘2、生物轉化的過程二步發(fā)酵法(two-stage process)
1)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)(Stage I)將菌株接種到PDA斜面上25℃培養(yǎng)7-14天，產生豐富的分生孢子后，加入約5ml無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基II于成熟的新鮮斜面中制備孢子懸液，將孢子懸液接種到無菌的裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基II的250ml三角瓶中，在200rpm，28℃條件下振蕩培養(yǎng)24小時。
2)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)(Stage II)將Stage I發(fā)酵培養(yǎng)物，接種到無菌的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基II中，接種量為5％(以菌絲體濕重計，w/v)，200rpm，28℃振蕩培養(yǎng)24小時。加入左旋一葉萩堿(由有機溶劑溶解，經無菌的0.2μm的過濾器過濾除菌)，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.2g/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-3天。
5.轉化產物的分離純化生物轉化過程中，分0小時，4小時，8小時三個時間定時取樣，將三角瓶從搖床上取下并過濾，濾液經反相吸附樹脂柱，除去水溶性雜質，再用醇水洗脫，得到洗脫液。洗脫液經濃縮，真空干燥，得到干粉I。干粉I經硅膠拌樣，硅膠柱層析，有機溶劑洗脫，洗脫液濃縮，真空干燥，得到干粉II。干粉II經氧化鋁拌樣，氧化鋁柱層析，有機溶劑洗脫，洗脫液濃縮，真空干燥，得到左旋一葉萩堿的轉化產物14，15-二氫一葉萩堿。經HPLC檢測左旋一葉萩堿0，4，8小時逐漸轉化為14，15-二氫一葉萩堿的過程，如附圖5-a，5-b，5-c所示，8小時左旋一葉萩堿幾乎被完全轉化為14，15-二氫一葉萩堿。
6.轉化產物的結構鑒定轉化產物為褐色油狀物，EI-MS顯示強的[M+1]+峰為220，提示分子量為219，已知左旋一葉萩堿的分子量為217。根據轉化產物的1H-NMR譜(見圖7)與左旋一葉萩堿的1H-NMR譜比較(表2)(見圖6)，轉化產物含有17H，14-H與15-H的化學位移發(fā)生了明顯的變化；轉化產物的13C-NMR譜(見圖9)與左旋一葉萩堿的13C-NMR譜比較(表3)(見圖8)，C-14與C15化學位移明顯移至高場。由此確定分子式為C13H17NO2。UV光譜顯示轉化產物的最大吸收峰在224nm處，左旋一葉萩堿在254nm處的最大吸收峰消失，說明左旋一葉萩堿的共軛雙鍵消失。IR(KBr)cm-1左旋一葉萩堿不飽和內酯環(huán)a-上H的吸收峰為1790，內酯羰基的吸收峰為1730，環(huán)己烯中雙鍵的吸收峰為1620，轉化產物的特征峰為1820，1758，1642。綜上所述，推測轉化產物為14，15-二氫一葉萩堿。
表2左旋一葉萩堿與轉化產物1H-NMR化學位移(δ)的比較


表3左旋一葉萩堿與轉化產物13C-NMR化學位移(δ)的比較


注權利要求不限于所舉實例。
實施例2利用本發(fā)明所述微生物A.versicolor D-1可以根據下列方式催化3-羥基1(10)，3，11(13)愈創(chuàng)木三烯-12，6-內酯-2-酮的不對稱還原反應(圖4b)利用所述微生物A.versicolor D-1的靜息細胞催化3-羥基1(10)，3，11(13)愈創(chuàng)木三烯-12，6-內酯-2-酮(縮寫為HGT)的不對稱還原反應，產物為(5S，6S，7S，11S)-3-羥基-1(10)，3-愈創(chuàng)木二烯-12，6-內酯-2-酮(縮寫為HGD)可以以下列條件為一種實施方案靜息細胞生物轉化法將24g水洗菌絲體和12mL HGT溶液平均加入到12瓶裝有50mL 60mmol/L磷酸鹽緩沖液的250mL三角瓶中，于20-40℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)。經HPLC檢測HGT轉化完全后，將轉化培養(yǎng)物過濾得到轉化液，用于轉化產物的制備。
用已知方法如硅膠柱層析法，大孔樹脂法，半制備高效液相色譜法對轉化產物進行制備得到轉化產物HGD。通過UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS等方法對轉化產物進行結構鑒定，利用所述微生物的靜息細胞可以不對稱還原HGT為(5S，6S，7S，11S)-3-羥基-1(10)，3，11(13)-愈創(chuàng)木二烯-12，6-內酯-2-酮。
HGD結構鑒定譜圖分析如下HGD為白色針狀結晶，[α]D25+66.7(c 0.52，MeOH)。UVλmax(MeOH)270nm。與HGT的紫外最大吸收波長相同。說明A和B環(huán)上的共軛體系沒有發(fā)生改變。IR(KBr)3331，1774，1679，cm-1；表明酮羰基和五元內酯環(huán)上羰基沒有發(fā)生改變。(+)ESI-MS給出準分子離子峰為263[M+H]+，提示相對分子質量為262，則HGD分子比HGT多2H。HGD的1H-NMR(見圖11)與HGT的1H-NMR(見圖10)(見表4)比較，發(fā)現在HGD的1H-NMR譜圖上HGT的α-甲烯基-γ-內酯的兩個典型氫信號峰(δ6.19和δ5.19)消失，而在1.28(3H，d)處出現氫信號，被歸屬為CH3-13；同時在δ2.24(1H，m)處出現氫信號，被歸屬為H-11質子。比較HGD的13C-NMR譜(見圖13)與HGT的13C-NMR譜(見圖12)(見表5)，同樣發(fā)現HGD的C11和C13的化學位移由139.5和117.9移至高場，分別為41.4和12.4。此結果說明HGD的C11為次甲基碳，C-13為甲基碳。綜上所述，HGT分子中C11(13)碳碳雙鍵被所述菌株還原為HGD，并確定其分子式為C15H18O4。HGD的光譜數據與文獻報道相同。在NOESY譜中(見圖14)，可觀測到H-6質子信號δ3.56(1H，t)與H-11質子信號2.24(1H，m)有相關，H-7質子信號δ1.95(1H，m)與CH3-13氫信號δ1.28(3H，d)有相關，說明H-6質子與H-11質子是位于同側直立鍵，H-7質子和CH3-13位于同側。根據HGT中H-6質子和H-7質子分別為α構型和β構型，則H-11質子和CH3-13分別為α構型和β構型，綜上所述，根據HGT的絕對構型，確定HGD的絕對構型為(5S，6S，7S，11S)-3-羥基-1(10)，3-愈創(chuàng)木二烯-12，6-內酯-2-酮。
表4 HGT及其產物的1H-NMR化學位移(δ)的比較

表5 HGT及其產物的13C-NMR化學位移(δ)的比較


權利要求
1.一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，其特征在于利用微生物中存在的一類還原酶作為生物催化劑對內酯類化合物的α，β-碳碳雙鍵或γ，δ-碳碳雙鍵進行的還原反應，此還原反應具有高度的立體選擇性。
2.根據權利要求1所述的一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，其特征在于所述的微生物是選自可以實現對內酯類化合物的碳碳雙鍵進行專一性還原反應的的任何適宜微生物，包括但不限于真菌中的酵母菌屬(Saccharomyces)、根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、曲霉屬(Aspergillus)、連格孢霉屬和小克銀漢霉屬(Cunninghamella)等菌株。
3.根據權利要求1所述的一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，其特征在于所述的微生物選自曲霉屬。
4.根據權利要求1所述的一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，其特征在于所述的微生物屬為曲霉屬巢狀亞屬雜色組，并且屬雜色組中的雜色曲霉原變種(Aspergillus versicolor)及其相關的變種或亞種，或其功能等效物，傳代培養(yǎng)物，突變體和變種。
5.根據權利要求1所述的一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，其特征在于所述的方法主要是利用所述菌種產生的NADPH依賴性還原酶，它是一類存在于胞漿中的可溶性蛋白，而不是一種膜結合的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的還原反應，即利用微生物中產生的一類還原酶作為生物催化劑將內酯類化合物的α，β－碳碳雙鍵或γ，δ－碳碳雙鍵還原，其中所述的微生物選自曲霉屬。此還原反應具有高度的立體選擇性。本發(fā)明有效地實現了對內酯類化合物碳碳不飽和雙鍵專一性的還原，將潛手性化合物生物轉化為手性化合物，能廣泛應用于手性藥物及藥物合成過程中手性中間體的制備，和化學催化劑相比具有高效，安全且專一性高的特點，有效地解決了化學方法較難實現的內酯類化合物碳碳雙鍵的不對稱還原問題。
文檔編號C12R1/845GK1908179SQ200510047190
公開日2007年2月7日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權日2005年9月14日
發(fā)明者游松, 關宏, 楊莉, 王旭, 倪銳, 賈嫻 申請人:沈陽藥科大學