專利名稱：一種構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞組織工程領(lǐng)域，具體地說是一種構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)是一類源于囊胚時期內(nèi)細胞團的特定細胞群，兼具有自我更新及全向分化的潛能，即在合適的體內(nèi)或體外條件下，能夠分化為內(nèi)、中、外三個不同胚層的細胞。1981年，小鼠ES細胞的成功分離建系揭開了干細胞研究的序幕[文獻1Evans MJ，Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouseembryos.Nature，1981；292(5819)154-156.]。繼之，ESC定向誘導(dǎo)分化成為國內(nèi)外共同關(guān)注的熱點。目前有關(guān)ES細胞定向誘導(dǎo)分化的研究日趨深入橫向擴展至向神經(jīng)元、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞、肝前體細胞以及胰島素分泌細胞等多種細胞的誘導(dǎo)分化，縱向已深入至基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的機制探討。該領(lǐng)域成果不但為發(fā)育生物學(xué)提供了寶貴的體外研究模型，而且還可能為細胞治療提供理想的種子細胞。盡管如此，若要將ES細胞真正應(yīng)用于臨床治療，尚存在諸多不可回避的難題。包括(一)如何實現(xiàn)ES細胞在體外培養(yǎng)擴增的同時仍維持其最佳的未分化狀態(tài)即多向分化潛能？(二)如何標(biāo)準(zhǔn)化ES細胞定向誘導(dǎo)分化操作規(guī)則；如何提高定向分化率以及如何實現(xiàn)ES源目的細胞的分離純化？可以說，上述兩個方面的研究相輔相承，而前者又在很大程度上制約著后者的深入，因此問題(一)已成為干細胞相關(guān)研究中的重要瓶頸問題。
目前，在體外培養(yǎng)過程中維持ES細胞進行自我更新的途徑包括[文獻2Smith AG，Heath JK，Donaldson DD，et al.Inhibition of pluripotentialembryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.Nature，1988，336688-690](1)添加細胞因子-LIF，即白血病抑制因子；(2)將具有分泌LIF功能的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層細胞，與ES細胞共同培養(yǎng)；(3)建立轉(zhuǎn)染有未分化維持基因(Oct-3/4)的ES細胞株。但上述途徑分別存在如下問題(1)細胞因子LIF的商品價格昂貴，不但增加了ES細胞維持培養(yǎng)條件的苛刻性，而且也大大限制了ES細胞規(guī)?；瘮U增的廣泛開展。(2)飼養(yǎng)層細胞的制備對取材來源要求較高(孕13.5天的孕鼠)，操作復(fù)雜，且每次傳代均需要經(jīng)絲裂霉素預(yù)處理的飼養(yǎng)層細胞。(3)真核細胞轉(zhuǎn)基因操作較為復(fù)雜，且外源基因的表達不穩(wěn)定易于在增殖傳代過程中發(fā)生丟失。因此，國內(nèi)外學(xué)者仍在努力探索其他途徑以期實現(xiàn)ES細胞在體外培養(yǎng)擴增的同時仍維持其最佳分化潛能[文獻3Magyar JP，NemirM，Ehler E，Suter N，Perriard JC，Eppenberger H.Mass production of embryoidbodies in microbeads.Ann N Y Acad Sci，2003，944135-143]。2004年3月，《cell》曾發(fā)表文章強調(diào)在干細胞的增殖與分化的動態(tài)調(diào)節(jié)過程中，所有外源性和內(nèi)源性的影響因素共同構(gòu)建了干細胞所處的微環(huán)境。微環(huán)境因素間復(fù)雜的相互作用在決定干細胞的命運方面起著重要作用[文獻4Fuchs E，Tumbar T，Guasch G.Socializing with the neighborsstem cells and their niche.Cell，2004，116769-778；文獻5Spradling A，Drummond-Barbosa D，Kai T.Stem cells find their niche.Nature，2001，41498-104]。但近年相關(guān)報道多集中于成體干細胞的體內(nèi)誘導(dǎo)分化方面，有關(guān)ES細胞的研究甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單的構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其既能實現(xiàn)ES細胞體外的高密度培養(yǎng)和規(guī)?；瘮U增，同時又能抑制或者延緩ES細胞走向自發(fā)性分化的實驗方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，將小鼠胚胎干細胞與少量飼養(yǎng)層細胞進行微囊化共培養(yǎng)，這樣既能實現(xiàn)ES細胞體外的高密度培養(yǎng)和規(guī)?；瘮U增，同時又利用APA(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微膠囊所特有的理化性質(zhì)及其營造的特殊培養(yǎng)環(huán)境，最大限度的抑制或者延緩ES細胞走向分化。
一種構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化ES細胞；將微囊化ES細胞加入到ES生長培養(yǎng)基中，置37℃，空氣中含體積5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基；其以APA微膠囊內(nèi)部的海藻酸鈉凝膠作為干細胞生長的良好基質(zhì)，促進ES細胞增殖。并利用APA微膠囊所提供的限制性生長空間，將與干細胞共培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞共同包被入APA微囊。由此，在微囊微環(huán)境下，ES細胞與飼養(yǎng)層細胞呈三維直接接觸，可能延遲ES細胞在體外的自發(fā)性分化進程，同時也可以實現(xiàn)采用規(guī)模化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行干細胞的規(guī)?；瘮U增。
所述制備APA微囊化ES細胞的方法為靜電液滴發(fā)生法，具體步驟如下，①通過微膠囊制備儀，將均勻混合有ES細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入鈣溶液中，得到海藻酸鈣凝膠珠；②將海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，反應(yīng)成膜時間為8-15分鐘，膜厚在5-50μm范圍內(nèi)；再與海藻酸鈉溶液反應(yīng)；最后用檸檬酸鈉液化，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊；所述海藻酸鈉的w/v濃度為1.5％-1.8％；鈣溶液中鈣離子濃度為0.05-0.3mol/L；聚賴氨酸濃度(W/V)為0.05-0.1％，海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸溶液的體積比為1∶10；檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L；ES細胞存活率＞96％，ES細胞含量150-200 cells/個微膠囊，微膠囊粒徑可在400-600μm精確可控。
微膠囊粒徑是通過控制微膠囊制備儀的操作條件來調(diào)整的，其操作條件為電壓50-75V、頻率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、針頭孔徑4#-7#。
所述干細胞(細胞類型)為多來源胚胎干細胞或各種成體干細胞。
所述培養(yǎng)的培養(yǎng)時間3-10天，培養(yǎng)基的種類根據(jù)所選定的ES細胞確定，例如小鼠來源ES細胞采用H-DMEM培養(yǎng)基(含15％FCS+1％非必需氨基酸UAA+0.1mmol/L β-Me+103U/ml LIF)，人源ES細胞采用KnockOutDMEM培養(yǎng)基(含20 KnockOut SR+1mmol/L glutamine+1％UAA+0.1mmol/Lβ-Me+103U/ml LIF+4ng/ml bFGF)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.操作簡單，實現(xiàn)ES細胞體外的高密度培養(yǎng)和規(guī)?；瘮U增。本發(fā)明基于APA微膠囊內(nèi)部的海藻酸鈉凝膠是動物細胞的良好生長基質(zhì)，利用APA微膠囊所提供的特殊微環(huán)境，不但能夠維持干細胞的生物活性，而且可促進ES細胞在微囊內(nèi)顯著增殖，本發(fā)明利用微囊化細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢，將小鼠ES細胞進行APA微囊化培養(yǎng)并體外擴增，以獲得足夠數(shù)量的ES細胞進行相應(yīng)的下游研究與應(yīng)用；2.抑制或者延緩ES細胞走向分化。本發(fā)明在微囊化制備的過程中，將與干細胞共培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞共同包被，可以延緩或限制ES細胞在擴增過程中所發(fā)生的自發(fā)性分化。ES細胞與少量飼養(yǎng)層細胞在APA微囊所提供的特殊微環(huán)境內(nèi)實現(xiàn)共培養(yǎng)，二者在三維空間內(nèi)充分接觸，由飼養(yǎng)層細胞分泌LIF因子既可直接作用于ES細胞，又可在局部實現(xiàn)濃度的暫態(tài)富集，加之APA微膠囊膜的控釋性，上述因素均可加強飼養(yǎng)層對ES細胞的生物學(xué)作用，延長LIF對ES細胞的作用時間，最終達到抑制或減少小鼠ES細胞走向分化的目的；即APA微膠囊為ES細胞提供了一個限制性的生長空間和特殊的生長微環(huán)境，使該過程中ES細胞仍持續(xù)表達干細胞未分化標(biāo)志蛋白及相關(guān)基因，表明微囊化ES在擴增過程中仍維持其未分化狀態(tài)，或是ES細胞走向自發(fā)性分化的進程得以延緩。
3.實驗操作溫和、可控。本發(fā)明利用靜電液滴法在生理條件下制備APA微囊化的小鼠胚胎干細胞，制備過程中對小鼠ES細胞的活性沒有損害(對小鼠ES細胞活性沒有影響)；通過調(diào)整電壓、頻率、泵速及針頭孔徑，控制微囊直徑大小在400-600μm之間，可以保證APA微囊內(nèi)ES細胞的營養(yǎng)供應(yīng)。
4.操作條件較為優(yōu)化。①本發(fā)明采用的培養(yǎng)體系為具有良好生物相容性和培養(yǎng)基質(zhì)作用的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微膠囊，包括液化型與非液化型；通過比較不同微囊類型(包括液化型和非液化型)對ES細胞生長及代謝活性的影響，以篩選在體外培養(yǎng)的過程中更有利于ES細胞保持良好生長狀態(tài)并顯著增殖的微囊類型；②本發(fā)明選擇液化型APA微囊作為該發(fā)明的理想培養(yǎng)體系，檢測微囊化ES細胞在體外培養(yǎng)的過程中，在不添力LIF因子的情況下，囊內(nèi)ES細胞未分化狀態(tài)的蛋白(階段特異性抗原SSEA-1，堿性磷酸酶AP)及基因(Oct-4)的表達情況；③明確微囊內(nèi)ES細胞在體外長期培養(yǎng)過程中(近2-3周)持續(xù)保持其未分化潛能。
5.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明方法可用于胚胎干細胞的體外規(guī)?；瘮U增；APA微囊膜具有免疫隔離效用，可應(yīng)用于干細胞體內(nèi)定位移植及相關(guān)的誘導(dǎo)分化研究，而無需應(yīng)用價格昂貴的裸鼠；本發(fā)明培養(yǎng)體系可用于干細胞與其它細胞(包括基因工程化細胞)的共培養(yǎng)研究；本發(fā)明APA微囊化干細胞還為研究體內(nèi)微環(huán)境對干細胞增殖及分化及相互作用的影響提供了理想的模型。
總之，本發(fā)明既能實現(xiàn)ES細胞體外的高密度培養(yǎng)和規(guī)?；瘮U增，同時又能抑制或者廷緩ES細胞走向分化，即在體外培養(yǎng)擴增過程中最大限度的維持ES細胞未分化潛能。在APA微囊化ES細胞的制備過程中，不需要去除飼養(yǎng)層細胞，使之以干細胞共培養(yǎng)于微囊內(nèi)。由于具備上述優(yōu)點，使得該實驗方法在基礎(chǔ)發(fā)育生物學(xué)和下游的臨床應(yīng)用研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1為不同類型APA微囊內(nèi)小鼠胚胎干細胞的體外生長曲線；APA微囊化ES細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)后，每個微囊內(nèi)細胞可增殖至初始接種數(shù)量的數(shù)十至數(shù)百倍。比較非液化型，液化型APA微膠囊更適合ES細胞的生長增殖。
圖2為APA微囊化小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)2周(100×，OLYMPUS)；APA微囊化ES細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)1.5-2周后，ES細胞增殖為細胞球，每個微囊內(nèi)細胞數(shù)量約為初始接種密度的數(shù)十至數(shù)百倍(附圖2)；圖3為H&E染色顯示APA微囊內(nèi)小鼠胚胎干細胞的生長形態(tài)(200×)；APA微囊化小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)樣品制備為石蠟切片，經(jīng)H&E染色進行初步形態(tài)學(xué)觀察，APA微囊內(nèi)ES細胞增殖良好，中央未出現(xiàn)因養(yǎng)分傳質(zhì)障礙所導(dǎo)致的細胞壞死區(qū)；圖4為免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的APA微囊化ES表達AP蛋白；APA微囊化小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)3周，免疫組織化學(xué)檢測AP表達陽性(200×，OLYMPUS)，微囊化ES細胞經(jīng)體外培養(yǎng)22天后，在不添力LIF因子的條件下，微囊內(nèi)ES細胞仍能不同程度的表達標(biāo)志性蛋白---AP蛋白；圖5為免疫熒光檢測體外培養(yǎng)的APA微囊化ES細胞表達SSEA-1蛋白；微囊化ES細胞經(jīng)體外培養(yǎng)22天后，在不添加LIF因子的條件下，微囊內(nèi)ES細胞仍能不同程度的表達標(biāo)志性蛋白---SSEA-1，APA微囊化小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)3周，免疫熒光檢測SSEA-1表達陽性(Leica)紅色為PI復(fù)染細胞核；圖6為RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4在體外培養(yǎng)的微囊化ES細胞中的表達情況；RT-PCR檢測體外培養(yǎng)的APA微囊化ES細胞表達Oct-4基因，β-actin作為內(nèi)參基因，Marker為DL2000；微囊化ES細胞經(jīng)體外培養(yǎng)的第14和第22天，在不添力LIF因子的條件下，微囊內(nèi)ES細胞仍能不同程度的表達標(biāo)志性基因---Oct-4。
具體實施例方式
試劑海藻酸鈉(Sigma)，聚賴氨酸(Sigma)，單克隆抗體SSEA-1(SantaCruz)，堿性磷酸酶AP(Zhongshan)，RI-PCR試劑盒(Takara)；ES細胞生長培養(yǎng)基H-DMEM培養(yǎng)基(Gibico)+15％胎牛血清+1％非必需氨基酸+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇(β-Me)+103U/ml LIF；儀器CO2細胞培養(yǎng)箱，相差顯微鏡，靜電液滴發(fā)生器，酶標(biāo)儀，紫外分光光度計，激光共聚焦顯微鏡，攪拌式生物反應(yīng)器(B.Braun)；細胞模型小鼠胚胎干細胞系ES-D3(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供)；具體方法1.ES-D3細胞以生長培養(yǎng)基在體外進行維持培養(yǎng)。經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化并收集后，調(diào)整細胞密度4×106cells/ml。利用靜電液滴發(fā)生法，在生理條件下制備出APA微囊化小鼠ES細胞，具體制備條件為5#國產(chǎn)注射器針頭，電壓70V，頻率120Hz，泵速8.9ml/h，pH6.0-7.4，20-37℃，1個大氣壓，無震蕩及剪切。操作過程為將ES細胞與1.5％(W/V)海藻酸鈉溶液混合后，將該細胞懸液經(jīng)注射器泵滴入100mmol/L Cacl2溶液中鈣化20min，得到海藻酸鈣凝膠珠。將海藻酸鈉凝膠珠與0.05％(W/V)的聚賴氨酸(PLL)反應(yīng)成膜12min，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，再與0.15％(W/V)海藻酸鈉溶液反應(yīng)3min，最后用55mmol/L檸檬酸鈉液化5min，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊。
2.將上述制備的微囊化ES細胞用培養(yǎng)基洗滌3次，然后按1∶10的體積比(微膠囊∶培養(yǎng)基)加入ES生長培養(yǎng)基(不含有LIF)，置37℃，空氣中含體積5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基。體外培養(yǎng)試驗分組i)液化微囊組ii)非液化微囊組，對比不同微囊環(huán)境對干細胞生長的影響，篩選ES細胞生長的理想條件。
3.APA微囊化ES細胞在體外培養(yǎng)的過程中，定期觀察細胞生長情況，并每隔24小時取樣，利用MTT方法檢測微囊內(nèi)細胞的活性，繪制細胞活性曲線。
4.收集上述微囊化ES細胞的樣品，PBS溶液清洗2遍，4％甲醛室溫下固定。經(jīng)梯度脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片。經(jīng)H&E染色進行初步形態(tài)學(xué)觀察，明確ES細胞在APA微囊內(nèi)增殖情況。
5.將上述制備的石蠟切片進行脫蠟處理，利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測分別與抗小鼠單克隆抗體AP及SSEA-1孵育，檢測其未分化標(biāo)志蛋白的表達情況。
6.收集微囊化干細胞樣品，機械法破碎微囊并分離細胞，Trizol裂解也提取細胞樣品總RNA，利用RT-PCR方法檢測樣品內(nèi)未分化基因Oct-4的表達情況。
7.將上述制備的微囊化ES細胞在攪拌式細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中擴增培養(yǎng)2周，計算機控制并實時監(jiān)測細胞生長情況，計算細胞活性率。
實驗結(jié)果①APA微囊化小鼠ES細胞是利用靜電液滴發(fā)生器在生理條件下制備，制備過程中對ES細胞活性損害＜4％；②ES細胞含量150-200 cells/個微膠囊，微膠囊粒徑可在400-600μm精確可控。
③APA微囊化ES細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)后，每個微囊內(nèi)細胞可增殖至初始接種數(shù)量的數(shù)十至數(shù)百倍。比較非液化型，液化型APA微膠囊更適合ES細胞的生長增殖(附圖1)。
④APA微囊化ES細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)1.5-2周后，ES細胞增殖為細胞球，每個微囊內(nèi)細胞數(shù)量約為初始接種密度的數(shù)十至數(shù)百倍(附圖2)。
⑤收集上述微囊化ES細胞的樣品，制備為石蠟切片，經(jīng)H&E染色進行初步形態(tài)學(xué)觀察，APA微囊內(nèi)ES細胞增殖良好(附圖3)。
⑥利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測其未分化標(biāo)志蛋白的表達情況，結(jié)果表明體外培養(yǎng)22天后，微囊內(nèi)ES細胞仍能不同程度的表達SSEA-1，AP(附圖4，附圖5)。
⑦在APA微囊化ES細胞體外培養(yǎng)的過程中，通過機械法破囊收獲囊內(nèi)細胞標(biāo)本，利用RT-PCR方法檢測到未分化基因Oct-4的表達水平在整個培養(yǎng)擴增的過程中未發(fā)生顯著下調(diào)(附圖6)。
⑧微囊化ES細胞可以在細胞培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)規(guī)?；囵B(yǎng)，擴增，細胞生長狀態(tài)理想。培養(yǎng)2周后，細胞存活率＞85％。
⑨上述結(jié)果表明小鼠ES細胞經(jīng)APA微囊化培養(yǎng)后能夠?qū)崿F(xiàn)一定規(guī)模的體外擴增，而在該增殖過程中，ES細胞仍能維持其未分化狀態(tài)，或者也可以說是ES細胞走向自發(fā)性分化的進程得以延緩。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其特征在于以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化ES細胞；將微囊化ES細胞加入到ES生長培養(yǎng)基中，置37℃，空氣中含體積5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基，即為干細胞體外增殖分化的微環(huán)境。
2.按照權(quán)利要求1所述構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其特征在于所述制備APA微囊化ES細胞的方法為靜電液滴發(fā)生法，具體步驟如下，①通過微膠囊制備儀，將均勻混合有ES細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入鈣溶液中，得到海藻酸鈣凝膠珠；②將海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，反應(yīng)成膜時間為8-15分鐘，膜厚在5-50μm范圍內(nèi)；再與海藻酸鈉溶液反應(yīng)；最后用檸檬酸鈉液化，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊；所述海藻酸鈉的w/v濃度為1.5％-1.8％；鈣溶液中鈣離子濃度為0.05-0.3mol/L；聚賴氨酸的W/V濃度為0.05-0.1％，海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸溶液的體積比為1∶10；檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L；ES細胞存活率＞96％，ES細胞含量150-200cells/個微膠囊，微膠囊粒徑可在400-600μm精確可控。
3.按照權(quán)利要求1所述構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其特征在于微膠囊粒徑是通過控制微膠囊制備儀的操作條件來調(diào)整的，其操作條件為電壓50-75V、頻率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、針頭孔徑4#-7#。
4.按照權(quán)利要求1所述構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其特征在于所述干細胞為多來源胚胎干細胞或各種成體干細胞。
5.按照權(quán)利要求1所述構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)時間3-10天，培養(yǎng)基的種類根據(jù)所選定的ES細胞確定。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細胞組織工程領(lǐng)域，具體地說是一種構(gòu)建干細胞體外增殖分化微環(huán)境的方法，以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化ES細胞；將微囊化ES細胞加入到ES生長培養(yǎng)基中，置37℃，空氣中含體積5％CO
文檔編號C12N5/071GK1962855SQ200510047689
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者馬小軍, 王秀麗, 王為 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所