專利名稱：一種實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域，具體地說是一項利用體內(nèi)組織微環(huán)境實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的新技術(shù)。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)是一類源于囊胚時期內(nèi)細(xì)胞團的特定細(xì)胞群，兼具有自我更新及全向分化的潛能。1981年，小鼠ES細(xì)胞的成功分離建系揭開了干細(xì)胞研究的序幕[文獻(xiàn)1.Evans MJ，Kaufman MH.Establishment inculture of pluripotential cells from mouse embryos.Nature，1981；292(5819)154-156.]。繼之，ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成為國內(nèi)外共同關(guān)注的熱點。目前有關(guān)ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究日趨深入橫向擴展至向神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝前體細(xì)胞以及胰島素分泌細(xì)胞等多種細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，縱向已深入至基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的機制探討[文獻(xiàn)2.Kahan BW，Jacobson LM，Hullett DA，Ochoada JM，Oberley TD，Lang KM，Odorico JS.Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonicstem cellsAn in vitro model to study islet differentiation.Diabetes，2003；52(8)2016-2024.]。盡管如此，若要將ES細(xì)胞真正應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療，尚存在諸多問題。其中，如何標(biāo)準(zhǔn)化ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化操作規(guī)則；如何提高定向分化率以及如何實現(xiàn)ES源目的細(xì)胞的分離純化等---這些問題一直是制約干細(xì)胞相關(guān)研究的重要“瓶頸”之一。
歸納近年來發(fā)表的有關(guān)ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化報道，其中所采用的實驗手段很有限。包括(1)添加化學(xué)性誘導(dǎo)劑，促進ES細(xì)胞向某一胚層細(xì)胞的定向分化。例如一定濃度的二甲基亞砜可以促進小鼠ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞；(2)添加生物細(xì)胞因子。例如培養(yǎng)基內(nèi)添加細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β能促進ES細(xì)胞向成骨細(xì)胞(或骨細(xì)胞)方向分化；(3)生物細(xì)胞因子和化學(xué)性誘導(dǎo)劑階段性結(jié)合應(yīng)用。例如誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞時，需要將細(xì)胞因子bFGF及fibronectin與尼克酰胺、亞硒酸鈉、葡萄糖等試劑進行階段性添加。但是，較低的定向誘導(dǎo)分化率和昂貴的細(xì)胞因子費用—這兩個方面成為上述方法的主要缺陷。因此國內(nèi)外學(xué)者仍在努力探索實現(xiàn)ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化其它理想途徑。2004年3月，《cell》曾發(fā)表文章強調(diào)在干細(xì)胞的增殖與分化的動態(tài)調(diào)節(jié)過程中，所有外源性和內(nèi)源性的影響因素共同構(gòu)建了干細(xì)胞所處的微環(huán)境[文獻(xiàn)3.Fuchs E，Tumbar T，Guasch G.Socializing with the neighborsstem cells and their niche.Cell，2004，116769-778]。微環(huán)境因素間復(fù)雜的相互作用在決定干細(xì)胞的命運方面起著重要作用[文獻(xiàn)4.Spradling A，Drummond-Barbosa D，Kai T.Stem cells find their niche.Nature，2001，41498-104；文獻(xiàn)5.Levenberg S，Huang NF，Lavik E，Rogers AB，Itskovitz-Eldor J，Langer R.Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds.Proc Natl AcadSci USA，2002，100(22)12741-12746]。新近研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)輸注入胎羊體內(nèi)后，能夠在體內(nèi)多種組織內(nèi)歸巢并向所在組織的終末細(xì)胞類型分化，表明組織環(huán)境影響了干細(xì)胞的分化狀態(tài)。但有關(guān)體內(nèi)微環(huán)境與干細(xì)胞分化的報道多集中于成體干細(xì)胞，而相關(guān)ES細(xì)胞的研究尚未見報道，分析可能主要是由于成體干細(xì)胞的體內(nèi)植入毋需受到免疫排斥的制約。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單的實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，該技術(shù)的建立是通過體外制備APA微囊化小鼠ES細(xì)胞后再行腹腔內(nèi)移植、回收，并進一步檢測回收細(xì)胞的分化狀態(tài)來實現(xiàn)的；其既結(jié)合APA微膠囊的免疫隔離及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，同時又能夠考察體內(nèi)微環(huán)境(或組織環(huán)境)對干細(xì)胞增殖及分化的影響的實驗方法。而通過該實驗方法所建立的APA微囊化干細(xì)胞模型可廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞體內(nèi)定位移植、回收及體內(nèi)定向誘導(dǎo)分化的相關(guān)研究。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，靜電液滴法制備微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞。然后，定向植入體內(nèi)不同解剖學(xué)部位(腹腔，腎被膜下，蛛網(wǎng)膜下腔，骨髓腔，肝臟等)，定期回收體內(nèi)微囊化ES細(xì)胞，考察體內(nèi)微環(huán)境(或組織環(huán)境)對干細(xì)胞增殖及分化的影響。
一種實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞；將微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞定向植入生物體內(nèi)不同解剖學(xué)部位，即可實現(xiàn)干細(xì)胞的定向增殖分化。
所述制備APA微囊化ES細(xì)胞的方法為靜電液滴發(fā)生法，具體步驟如下，①通過微膠囊制備儀，將均勻混合有ES細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入鈣溶液中，得到海藻酸鈣凝膠珠；②將海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，反應(yīng)成-膜時間為8-15分鐘，膜厚在5-50μm范圍內(nèi)；再與海藻酸鈉溶液反應(yīng)；最后用檸檬酸鈉液化，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊；所述海藻酸鈉的w/v濃度為1.5％-1.8％；鈣溶液中鈣離子濃度為0.05-0.3mol/L；聚賴氨酸重量濃度為0.05-0.1％，海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸溶液的體積比為1∶10；檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L；在生理條件下制備APA微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞，ES細(xì)胞存活率＞96％，調(diào)整ES細(xì)胞初始密度為100-150細(xì)胞/個微膠囊，微膠囊粒徑可在400-600μm精確可控。
微膠囊粒徑是通過控制微膠囊制備儀的操作條件(電壓、頻率、泵速以及針頭孔徑的大小)來調(diào)整的，其操作條件為電壓50-75V、頻率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、針頭孔徑4#-7#，控制微囊直徑大小在400-600μm之間，保證APA微膠囊的傳質(zhì)性能、機械強度，同時利于體內(nèi)移植及回收操作；干細(xì)胞類型為多來源胚胎干細(xì)胞或各種成體干細(xì)胞；生物體為多種品系的成年鼠、豬或兔等實驗動物；生物體內(nèi)不同解剖學(xué)部位為腹腔，腎臟(腎被膜下)，蛛網(wǎng)膜下腔，骨髓(骨髓腔)，肝臟等；植入方式包括腹腔注射、手術(shù)包埋或血管介入等。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.操作方法簡單。本發(fā)明利用APA(海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉)微膠囊內(nèi)部的海藻酸鈉凝膠是動物細(xì)胞的良好生長基質(zhì)，具有良好生物相容性，不但能夠維持干細(xì)胞的生物活性，而且可促進ES細(xì)胞在微囊內(nèi)顯著增殖；利用APA微膠囊所提供的特殊微環(huán)境，應(yīng)用APA微囊化培養(yǎng)(包括液化型與非液化型)實現(xiàn)干細(xì)胞體內(nèi)定向組織植入、擴增、并利于其定向分化；發(fā)揮APA微膠囊的免疫隔離及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，能夠考察體內(nèi)微環(huán)境對ES細(xì)胞增殖分化的影響，建立一種應(yīng)用于干細(xì)胞體內(nèi)定位移植研究的新模型。
2.制備過程條件溫和，對小鼠ES細(xì)胞活性沒有影響。同時，APA微膠囊免疫隔離的生物學(xué)特性及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，使ES細(xì)胞能夠在異種或異體內(nèi)植入并增殖。此外，APA微囊化ES細(xì)胞的體內(nèi)定位植入還充分利用了組織環(huán)境中所特有的營養(yǎng)組分和生物因子，為考察體內(nèi)微環(huán)境(或組織環(huán)境)與干細(xì)胞增殖及定向誘導(dǎo)分化之間的相互作用提供了一個理想的研究手段。在APA微囊化ES細(xì)胞的制備過程中，毋需去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，在體內(nèi)培養(yǎng)過程中并不影響干細(xì)胞走向分化。
3.本發(fā)明所提供的實驗方法為基礎(chǔ)發(fā)育生物學(xué)以及下游的臨床細(xì)胞治療研究提供了非常有價值的技術(shù)手段。本發(fā)明以小鼠胚胎干細(xì)胞ES-D3為細(xì)胞模型，以海藻酸鈉和聚賴氨酸為材料制備APA(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微囊化ES細(xì)胞，并將其進行體內(nèi)定位移植研究。由此既結(jié)合了APA微膠囊的免疫隔離及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，同時又能夠考察體內(nèi)微環(huán)境對ES細(xì)胞增殖分化的影響，以建立一種應(yīng)用于干細(xì)胞體內(nèi)定位移植研究的新模型。由于具備上述優(yōu)點，使得該實驗方法在基礎(chǔ)發(fā)育生物學(xué)以及下游的臨床細(xì)胞治療中都將發(fā)揮重要作用。


圖1為比較APA微囊內(nèi)小鼠胚胎干細(xì)胞在體外、體內(nèi)培養(yǎng)條件下的增殖情況圖；A為體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞(7天，100×，OLYMPUS)；B為體內(nèi)回收的微囊化ES細(xì)胞(7天，100×，OLYMPUS)，APA微囊化ES細(xì)胞經(jīng)過腹腔內(nèi)植入并培養(yǎng)2-7天后，每個微囊內(nèi)細(xì)胞可增殖至初始接種數(shù)量的數(shù)十至數(shù)百倍。比較微囊化ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)，腹腔內(nèi)能大大增加ES細(xì)胞的增殖速度。
圖2為H&E染色顯示體內(nèi)培養(yǎng)7天后APA微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞的生長形態(tài)圖(H&E染色，200×，OLYMPUS)；收集上述微囊化ES細(xì)胞的樣品，制備為石蠟切片，經(jīng)H&E染色進行初步形態(tài)學(xué)觀察，APA微囊內(nèi)ES細(xì)胞增殖良好，但細(xì)胞分布較為分散，不同于體外培養(yǎng)條件下所形成的細(xì)胞團結(jié)構(gòu)。
圖3免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測體內(nèi)回收樣品內(nèi)AP蛋白的表達(dá)情況圖；對照體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞(22天，A)，腹腔內(nèi)培養(yǎng)7天，免疫組織化學(xué)檢測體內(nèi)回收的ES細(xì)胞中僅有少量細(xì)胞AP表達(dá)陽性(B，箭頭示，200×，OLYMPUS)，對比同期體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞，樣品經(jīng)體內(nèi)植入一周后，所表達(dá)的AP蛋白水平迅速降低，僅有少量細(xì)胞表達(dá)陽性。
圖4免疫熒光檢測檢測體內(nèi)回收樣品內(nèi)SSEA-1蛋白的表達(dá)情況圖；對照體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞(14天，A)，微囊化ES細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)7天，免疫熒光檢測顯示僅有少量SSEA-1的表達(dá)。(綠色為SSEA-1蛋白，紅色為PI復(fù)染細(xì)胞核)，對比同期體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞，樣品經(jīng)體內(nèi)植入一周后，所表達(dá)的SSEA-1蛋白水平迅速降低，僅有少量細(xì)胞表達(dá)陽性。
圖5RT-PCR檢測體內(nèi)回收的微囊化ES細(xì)胞表達(dá)Oct-4mRNA，同時對比體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞和平面培養(yǎng)的未分化ES細(xì)胞。β-actin為內(nèi)參基因；對比同期體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞，微囊化ES細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)一周后，僅低水平表達(dá)甚至檢測不到相關(guān)基因的表達(dá)---Oct-4。表明APA微囊化小鼠ES細(xì)胞經(jīng)腹腔植入后，體內(nèi)組織微環(huán)境能夠促進干細(xì)胞走向增殖分化。
具體實施例方式
APA微膠囊的制備ES-D3細(xì)胞以生長培養(yǎng)基在體外進行維持培養(yǎng)。經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化并收集后，調(diào)整細(xì)胞密度4×106cells/ml。利用靜電液滴發(fā)生法，在生理條件下制備出APA微囊化小鼠ES細(xì)胞，具體制備條件為5#國產(chǎn)注射器針頭，電壓70V，頻率120Hz，泵速8.9ml/h，pH6.0-7.4，20-37℃，1個大氣壓，無震蕩及剪切。操作過程為將ES細(xì)胞與1.5％(W/V)海藻酸鈉溶液混合后，將該細(xì)胞懸液經(jīng)注射器泵滴入100mmol/L Cacl2溶液中鈣化20min，得到海藻酸鈣凝膠珠。將海藻酸鈉凝膠珠與0.05％(W/V)的聚賴氨酸(PLL)反應(yīng)成膜12min，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，再與0.15％(W/V)海藻酸鈉溶液反應(yīng)3min，最后用55mmol/L檸檬酸鈉液化5min，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊。
1.經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化并收集平面培養(yǎng)的ES-D3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1.0×106-5.0×106cells/ml。利用靜電液滴發(fā)生法，在生理條件下制備出APA微囊化小鼠ES細(xì)胞，制備過程中海藻酸鈉的配制濃度為1.5％-1.8％(w/v)，聚賴氨酸濃度為0.05％。
2.采用局部注射方式移植APA微囊化小鼠ES細(xì)胞至昆明種小白鼠腹腔，定期回收APA微囊化ES細(xì)胞。
經(jīng)生理鹽水洗滌后，采用腹腔注射的方式將微囊化ES細(xì)胞移植入昆明種小鼠腹腔12只?？瞻讓φ战M為腹腔注射空微囊，以明確微囊化ES細(xì)胞移植是否對動物生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。
3.考察回收樣品內(nèi)ES細(xì)胞的增殖活性，并對照同期體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞。
定期(每隔2天)斷頸處死動物，通過腹腔沖洗回收微囊，相差顯微鏡下觀察，拍照。激光共聚焦顯微鏡下定性檢測細(xì)胞存活情況，并與微囊化ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果相比較。
4.通過免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù)檢測回收樣品，考察體內(nèi)植入后細(xì)胞未分化表型的改變，并對照同期體外培養(yǎng)的微囊化ES細(xì)胞，明確體內(nèi)微環(huán)境對ES細(xì)胞命運的調(diào)控。
收集上述微囊化ES細(xì)胞的樣品，PBS溶液清洗2遍，4％甲醛室溫下固定。經(jīng)脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片。經(jīng)H&E染色進行初步形態(tài)學(xué)觀察，明確ES細(xì)胞在APA微囊內(nèi)增殖情況。
5.將上述制備的石蠟切片進行脫蠟處理，利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測分別與抗小鼠單克隆抗體SSEA-1及AP孵育，檢測其未分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明體外培養(yǎng)22天后，微囊內(nèi)ES細(xì)胞仍能不同程度的表達(dá)SSEA-1，AP。
6.回收微囊化ES細(xì)胞樣品，機械法破碎微囊并分離細(xì)胞，Trizol裂解也提取細(xì)胞樣品總RNA，利用RT-PCR方法檢測樣品內(nèi)未分化基因Oct-4的表達(dá)情況。
權(quán)利要求
1.一種實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞；將微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞定向植入生物體內(nèi)不同解剖學(xué)部位，即可實現(xiàn)干細(xì)胞的定向增殖分化。
2.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于所述制備APA微囊化ES細(xì)胞的方法為靜電液滴發(fā)生法，具體步驟如下，①通過微膠囊制備儀，將均勻混合有ES細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入鈣溶液中，得到海藻酸鈣凝膠珠；②將海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微囊膜，反應(yīng)成-膜時間為8-15分鐘，膜厚在5-50μm范圍內(nèi)；再與海藻酸鈉溶液反應(yīng)；最后用檸檬酸鈉液化，于是便得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的APA微膠囊；所述海藻酸鈉的w/v濃度為1.5％-1.8％；鈣溶液中鈣離子濃度為0.05-0.3mol/L；聚賴氨酸重量濃度為0.05-0.1％，海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸溶液的體積比為1∶10；檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L；ES細(xì)胞存活率＞96％，ES細(xì)胞含量100-150cells/microcapsule，微膠囊粒徑可在400-600μm精確可控。
3.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于微膠囊粒徑是通過控制微膠囊制備儀的操作條件來調(diào)整的，其操作條件為電壓50-75V、頻率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、針頭孔徑4#-7#。
4.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于所述干細(xì)胞為多來源胚胎干細(xì)胞或各種成體干細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于所述生物體為鼠、豬或兔。
6.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于所述生物體內(nèi)不同解剖學(xué)部位為腹腔、腎臟、蛛網(wǎng)膜下腔、骨髓或肝臟。
7.按照權(quán)利要求1所述實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，其特征在于所述植入方式包括腹腔注射、手術(shù)包埋或血管介入。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域，具體地說是一種實現(xiàn)干細(xì)胞定向增殖分化的方法，以海藻酸鈉，聚賴氨酸為材料，制備APA微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞；將微囊化小鼠胚胎干細(xì)胞定向植入生物體內(nèi)不同解剖學(xué)部位，即可實現(xiàn)干細(xì)胞的定向增殖分化。本發(fā)明建立了一種操作簡單，并可廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞體內(nèi)定位移植、回收及體內(nèi)定向誘導(dǎo)分化研究的新技術(shù)。其通過體外制備APA微囊化小鼠ES細(xì)胞后再行腹腔內(nèi)移植、回收，并進一步檢測回收細(xì)胞的分化狀態(tài)來實現(xiàn)的；該方法既結(jié)合了APA微膠囊免疫隔離的生物學(xué)特性及易于定向植入、回收的優(yōu)勢，同時又能夠詳實考察體內(nèi)微環(huán)境(或組織環(huán)境)對干細(xì)胞增殖及分化的影響。
文檔編號C12N5/0735GK1962856SQ200510047690
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者馬小軍, 王為, 王秀麗 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所