專利名稱：一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，該技術(shù)可在生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等方法中應(yīng)用，檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為了診斷疾病、篩查新藥、科學(xué)研究等目的，需要對目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白進(jìn)行測定分析。在目前的檢測技術(shù)中，有的直接以標(biāo)示物的強度或濃度顯示所獲得的結(jié)果(如生物芯片的熒光強度、放射免疫中的放射強度、免疫檢驗中的膠體金濃度等)，有的則間接以其它方式顯示所獲得的結(jié)果(如免疫檢驗和免疫組化中的被酶催化轉(zhuǎn)變的底物顏色等)。從實驗手段來看，有的需要昂貴的設(shè)備(如生物芯片檢測等)，有的則基本不需要設(shè)備(如免疫膠體金檢測等)。
所有的實驗，檢驗結(jié)果的敏感性等指標(biāo)與檢驗方法和檢驗成本有密切的關(guān)系，是一對客觀存在的矛盾。一般來說，敏感性等指標(biāo)要求越高的分析檢驗方法，需要的技術(shù)條件較高，儀器設(shè)備和試劑成本昂貴，步驟繁瑣，耗時冗長；而檢驗成本低廉、檢驗方法簡單的分析檢驗方法往往又存在敏感性不足等缺陷。
為了達(dá)到用低成本、方法簡單的分析檢驗方法實現(xiàn)高指標(biāo)的檢驗?zāi)康?，許多人進(jìn)行了積極的探索研究，包括各種新的標(biāo)記技術(shù)、新材料的使用和新的實驗方法等。
采用納米金屬(如金納米顆粒)、彩色微球和染料標(biāo)記微球等作為直接標(biāo)示物的分析檢驗方法簡單，反應(yīng)時間短，成本較低，可以肉眼觀察結(jié)果，已被許多實驗采用，是目前主要的快速分析檢驗方法之一。但是，敏感性不足等缺陷限制了其應(yīng)用。因此，許多研究由此出發(fā)，探索實現(xiàn)高敏感性等指標(biāo)的目的，取得一定的進(jìn)展。
以對納米金作為標(biāo)示物的研究為例納米級金顆粒具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，可標(biāo)記特定的蛋白和核酸等生物材料，用于分析檢驗中的示蹤技術(shù)已有較長的歷史。在以前和目前的應(yīng)用中，多采用膠體金作標(biāo)示物。膠體金顆粒是單一分子，結(jié)構(gòu)不固定，由于其分子表面在生理pH下帶有正電荷，因此，無需特別處理就可以與帶負(fù)電荷的生物材料形成離子結(jié)合。為了提高這一方法的敏感性，有的采用了滲濾富集技術(shù)，有的采用了層析富集技術(shù)，有的采用了金—銀放大顯色技術(shù)。近年來，發(fā)展了一種不具備吸附能力離散的納米金顆粒作為生物檢測中的信號報告分子，這種由不同數(shù)量的金原子通過鹵化物離子形成的立體構(gòu)型的大分子復(fù)合體，表面不帶電荷，對其進(jìn)行修飾后，可與特定的生物材料形成共價結(jié)合，作為信號報告分子使用。1996年，Nature雜志發(fā)表了兩篇將DNA作為連接分子使納米金自組裝成納米結(jié)晶的報道；1997年，Zehbe報道了用納米金作為信號報告分子的原位雜交技術(shù)，在結(jié)合銀顯影的情況下，對組織中核酸的檢測靈敏度已達(dá)到1個拷貝。同年，Mirl CA等人利用納米金在DNA片段作為組裝分子的引導(dǎo)下可形成超分子結(jié)構(gòu)的特點，建立了用巰基化寡核苷酸探針標(biāo)記納米金并檢測特定多核苷酸序列的新方法，為特定DNA序列檢測的研究和應(yīng)用開辟了一個新領(lǐng)域，在DNA芯片乃至DNA傳感器的制作方面都有廣闊的應(yīng)用前景。
但是，這些研究基本上還未達(dá)到理想指標(biāo)，有的敏感性不夠，有的信噪比過高，還有的技術(shù)問題還沒有解決，或者過于復(fù)雜，尚未達(dá)到實際應(yīng)用，等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，該技術(shù)可在生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等方法中應(yīng)用，檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白，敏感性高，成本低廉，方便快速。
一種三維網(wǎng)格檢測的技術(shù)，其技術(shù)方案是合成兩種不互補的核苷酸序列，以及兩種與之配對的核苷酸序列，分別以納米級顆粒為核心形成網(wǎng)格組件。當(dāng)兩種網(wǎng)格組件處于同一體系中時，在滿足其反應(yīng)條件的情況下，其核苷酸序列將互補配對，形成三維網(wǎng)格，實現(xiàn)信號放大，可被肉眼識別。在檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白時，需要在其中一種網(wǎng)格組件上加上雜交蛋白或雜交探針，配合固相化的捕獲蛋白或捕獲探針，以實現(xiàn)對目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白的特異性捕獲。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的合成兩種不互補的核苷酸序列，以納米級顆粒為核心，形成基礎(chǔ)網(wǎng)格組件；再合成兩種與基礎(chǔ)網(wǎng)格組件的核苷酸序列配對的核苷酸序列，與納米級顆粒形成擴展網(wǎng)格組件。當(dāng)兩種網(wǎng)格組件處于同一體系中，并滿足其反應(yīng)條件的情況下，其核苷酸序列將互補配對，形成三維網(wǎng)格，實現(xiàn)信號放大，可用肉眼識別。
當(dāng)需要檢測核酸時，合成兩條與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列，稱為捕獲探針和雜交探針，捕獲探針和雜交探針與目標(biāo)核酸的互補位置不同，但是相鄰。將捕獲探針固相化，將雜交探針與基礎(chǔ)網(wǎng)格組件交聯(lián)，形成檢測網(wǎng)格組件。實際檢測時，先將待測標(biāo)本加入預(yù)先已固定有捕獲探針的固相支持物中，再順序加入檢測網(wǎng)格組件和擴展網(wǎng)格組件，待反應(yīng)完成，洗滌后，即可被肉眼識別，有色斑者為陽性，無色斑者為陰性。
當(dāng)需要檢測蛋白時，應(yīng)事先取得針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料，如果目標(biāo)蛋白是抗原，應(yīng)取得兩種相應(yīng)抗體；如果目標(biāo)蛋白是抗體，應(yīng)取得相應(yīng)抗原，必要時還應(yīng)取得相應(yīng)抗抗體。檢測抗原用的兩種相應(yīng)抗體，或者檢測抗體用的相應(yīng)抗原以及相應(yīng)抗抗體，其中一種固相化，另一種與基礎(chǔ)網(wǎng)格組件交聯(lián)，形成檢測網(wǎng)格組件。實際檢測時，先將待測標(biāo)本加入預(yù)先已固定有抗體(或抗原)的固相支持物中，再順序加入檢測網(wǎng)格組件和擴展網(wǎng)格組件，待反應(yīng)完成，洗滌后，即可被肉眼識別，有色斑者為陽性，無色斑者為陰性。
在本發(fā)明中，目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白是指需要對其進(jìn)行檢測的核酸或蛋白質(zhì)；組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列是人工合成的不互補以及互補的核苷酸序列，其目的是在形成三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的組成、裝配過程中，自身不發(fā)生結(jié)合，而與另一網(wǎng)格組件發(fā)生特異性結(jié)合；納米級顆粒是指在可見光區(qū)具有一定色澤的納米級金屬和納米級非金屬，包括金、銀、硒、硅、碳、塑料等材料；捕獲探針和雜交探針是指與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列；針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料，是與目標(biāo)蛋白相對應(yīng)的抗原或抗體；捕獲探針的固相化和免疫學(xué)材料的固相化，是指將其與固相支持物的結(jié)合的處理過程，常用的固相支持物包括玻璃片、硅片、塑料片、纖維素膜等材料；同一體系是指共同進(jìn)行反應(yīng)的實驗體系，這個體系包括液—液和固—液等狀態(tài)；反應(yīng)條件是指滿足核苷酸序列發(fā)生互補結(jié)合的實驗條件。
本發(fā)明中使用的組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列均為人工合成，包括A序列、B序列、A’序列和B’序列。所使用的A序列與A’序列互補，但與B序列和B’序列不互補；B序列與B’序列互補，但與A序列和A’序列不互補。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用①A序列5’-aca caa cca cac act cta ctc a-3’；②B序列5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’；③A’序列5’-tga gta gag tgtgtg gtt gtg t-3’；④B’序列5’-gag ttg atg aga gga gaa gag a-3’。上述核苷酸序列的末端(3’端或5’端)均用巰基丙烷、巰基己烷、巰基丁烷等修飾，優(yōu)選地，本發(fā)明中使用巰基丙烷。
本發(fā)明按以下步驟進(jìn)行①人工合成組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列，包括A序列、B序列、A’序列和B’序列，并對其末端進(jìn)行修飾。將核苷酸序列末端進(jìn)行修飾的目的，是使其末端與納米級顆粒結(jié)合，“站立”在納米顆粒上，而不是整體“躺”在納米顆粒上。
采用巰基丙烷修飾3’端的方法是合成和修飾均在DNA合成儀上完成，3’端烷巰基化核苷酸序列采用1-巰基丙烷修飾的C3 S-S CPG固相合成柱，用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)合成法合成，為了純化，不要脫去DMT保護(hù)基團(tuán)。合成結(jié)束后，將反應(yīng)柱置55℃濃氨水中孵育16h，用量按每μmol合成物加入1ml濃氨水，以從反應(yīng)柱上切割核苷酸序列，同時除去堿基上的保護(hù)基團(tuán)。通過琥珀酰乙酯的作用可得到修飾有巰基丙烷的核苷酸序列和巰基丙烷連接臂的混合物，蒸發(fā)除去氨水后，采用反向HPLC進(jìn)行純化，最后在80％的乙酸中溶解30min除去DMT，測定濃度后備用。
采用巰基丙烷修飾5’端的方法是采用CPG固相支持柱，在DNA合成儀上合成設(shè)計的堿基序列后，取下反應(yīng)柱，在反應(yīng)柱的兩端分別固定一個注射器，其中一個注射器中灌注一定濃度的5’巰基修飾磷酸亞酰胺的無水乙氰溶液和一定量標(biāo)準(zhǔn)“四唑激活劑”溶液的混合液，將兩個注射器來回推壓混合溶液約10min，最后用無水乙氰清洗反應(yīng)柱，脫去所有的保護(hù)基團(tuán)，并用反向HPLC進(jìn)行純化，測定濃度后備用。
②納米級顆粒的制備采用的彩色微球等納米級顆?？梢詮氖惺鄄牧现羞x取(如15.0μm DIA彩色微球，1千萬/ml，美國E-Z Trac公司)。自行制作時，現(xiàn)在運用較多的是由Sutherland發(fā)展，經(jīng)Natan改良的化學(xué)合成法制作金納米微粒。以下敘述采用檸檬酸三鈉還原法的合成過程取0.01％氯金酸水溶液100ml在圓底燒瓶中劇烈攪拌，加熱至微沸騰時，攪動下快速將1％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml加入溶液的漩渦處，金黃色的溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸10分鐘，移除加熱器之后再攪拌15分鐘。冷卻后以重蒸水恢復(fù)至原體積，0.4μm濾紙過濾，制備的金溶膠可見光區(qū)最高吸收峰在535nm，A 1cm/535＝1.12。由于這些納米微粒均帶有負(fù)電荷，相互間的斥力可使其穩(wěn)定地懸浮于溶液中。
調(diào)整金離子與還原劑的比例可以獲得不同粒徑的納米微粒。金離子比例愈高，得到的納米微粒粒徑愈大。
③當(dāng)需要檢測核酸時，人工合成兩條與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列，分別稱為捕獲探針和雜交探針，捕獲探針和雜交探針在目標(biāo)核酸上的互補位置不同，但是相鄰。
④當(dāng)需要檢測蛋白時，應(yīng)事先取得針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料，如果目標(biāo)蛋白是抗原，應(yīng)取得兩種相應(yīng)抗體；如果目標(biāo)蛋白是抗體，應(yīng)取得相應(yīng)抗原，必要時還應(yīng)取得相應(yīng)的抗抗體。
⑤捕獲探針和雜交探針的末端修飾在合成捕獲探針和雜交探針時，在其末端(3’末端或者5’末端)加入10-50個堿基的臂，也可以不加入堿基臂，其目的是克服可能存在的空間位阻。
⑥擴展網(wǎng)格組件和檢測網(wǎng)格組件的制備對合成的核苷酸序列的末端進(jìn)行修飾后，以A序列和B序列為一組，A’序列和B’序列為另一組，分別與納米級顆粒反應(yīng)，可制備擴展網(wǎng)格組件和檢測網(wǎng)格組件。兩組網(wǎng)格組件中，增加了雜交探針或針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料連接的稱為檢測網(wǎng)格組件，另一組則稱為擴展網(wǎng)格組件。
以3’端烷巰基化核苷酸序列、末端修飾后雜交探針與金納米顆粒形成檢測網(wǎng)格組件的反應(yīng)為例，敘述如下取末端修飾后雜交探針5’-aga acc aac aag aag atg agg cat ttt tttttt ttt ttt t-3’，以及3’端烷巰基化核苷酸序列A5’-aca caa cca cacact cta ctc a-3’、序列B5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’共3OD(終濃度均為1.5uM)，與5ml納米金溶液混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
以3’端烷巰基化核苷酸序列、羊抗人IgM抗體與金納米顆粒形成檢測網(wǎng)格組件的反應(yīng)為例，敘述如下取納米金溶液10ml，以0.1Mol/L K2CO3調(diào)整pH值至9，攪拌下加入羊抗人IgM抗體100ug左右，調(diào)整終濃度至10ug/ml。繼續(xù)攪拌10min，加入1％聚乙二醇(20KD)至總?cè)芤旱?/10。1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀用PBS緩沖液重懸至5ml，4℃保存?zhèn)溆谩⒁呀?jīng)標(biāo)上羊抗人IgM抗體的納米金溶液5ml加入3’端烷巰基化核苷酸序列A5’-aca caa cca cacact cta ctc a-3’、序列B5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’共3OD(終濃度均為1.5uM)，混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/LNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
以3’端烷巰基化核苷酸序列與金納米顆粒形成擴展網(wǎng)格組件的反應(yīng)為例，敘述如下取3’端烷巰基化核苷酸序列A’5’-tga gta gag tgt gtg gtt gtg t-3’、序列B’5’-gag ttg atg aga gga gaa gag a-3’共3OD(終濃度均為2.0uM)，與5ml納米金溶液混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/LNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
這一步驟利用偶聯(lián)臂或硫原子與金顆粒之間的有很強作用力的特點，取代金顆粒原來吸附的陰離子，調(diào)整溶液的pH和離子強度后，以離心方式純化連接了核苷酸的金納米顆粒。金納米顆粒在溶液中的濃度的估算如下先以TEM(transmission electron microscope)測量粒徑的平均大小，假設(shè)金原子的堆積方式與單晶相同，估算出每顆納米微粒所含的金原子數(shù)目，再使用ICP-AES(inductively coupled plasma coupled with atomic emissionspectroscopy)測得溶液中金元素的濃度，換算后可得納米粒子的濃度。
⑦固相支持物和固相化固相支持物可以選用玻璃片、硅片、塑料片、纖維素膜等材料，以玻璃片的醛基化為例，說明其處理和固相化過程取載玻片，用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25％氨水中過夜，Milli-Q水洗。玻璃片浸入5％氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5)中，室溫處理20分鐘，95％乙醇超聲清洗，Milli-Q水超聲清洗，160℃烘干4小時。將玻片浸入5％戊二醛溶液中50分鐘，Milli-Q水超聲清洗兩次，干燥后備用。
捕獲探針的固相化取末端加入修飾基團(tuán)的捕獲探針，以15μM的濃度溶解于3×SSC溶液中，設(shè)定適當(dāng)?shù)狞c間距，用PixySys 5500芯片制備儀將溶液噴到醛基化的玻片上，室溫放置過夜。使用前0.2％SDS和Milli-Q水各洗兩次，空氣干燥后，1％NaBH4溶液還原10min，0.2％SDS和Milli-Q水各洗一次，空氣干燥后用待用。
基因工程病毒分型抗原的固相化取基因工程病毒分型抗原，用0.5×SSC溶液稀釋至終濃度1mg/ml，設(shè)定適當(dāng)?shù)狞c間距，用PixySys 5500芯片制備儀將溶液噴到醛基化的玻片上，37℃孵育2h，PBS-T(0.01mol/L pH7.2，0.05％Tween20)洗4次。使用含有10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.2)37℃封閉1h，雙蒸水清洗兩次，空氣干燥后待用。
⑧檢測和結(jié)果判斷在所有的材料都準(zhǔn)備好后，可以進(jìn)行檢測工作。檢測步驟是取已固相化捕獲探針或針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料的固相支持物，加入待測標(biāo)本，42℃孵育15min，0.01mol pH 7.4 PBS-T洗滌3次，順序加入5×SSC和檢測網(wǎng)格組件，42℃孵育5min，再加入擴展網(wǎng)格組件，42℃孵育10min，0.01mol pH 7.4 PBS-T洗滌3次，目測或鏡下判斷結(jié)果，有色斑者為陽性，無色斑者為陰性。
本發(fā)明的基本原理是首先在固相支持物上通過捕獲探針或針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料捕獲目標(biāo)，讓同時攜帶有基礎(chǔ)網(wǎng)格組件并與目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白能夠特異性結(jié)合的檢測網(wǎng)格組件與目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白結(jié)合，形成類似“夾心”的結(jié)構(gòu)，再將擴展網(wǎng)格組件覆蓋于其上，檢測網(wǎng)格組件與擴展網(wǎng)格組件的反復(fù)結(jié)合，形成肉眼可見的三維網(wǎng)格。如果被檢測標(biāo)本不含有目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白，就不能形成類似“夾心”的結(jié)構(gòu)，無“根”的三維網(wǎng)格將通過洗滌除去，沒有顏色。相反，如果被檢測標(biāo)本含有目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白，形成了類似“夾心”的結(jié)構(gòu)，三維網(wǎng)格就有“根”，洗滌后，仍然存在肉眼可見的目標(biāo)。
本發(fā)明的積極效果本發(fā)明提供的三維網(wǎng)格檢測技術(shù)除了具有一般膠體金標(biāo)記檢測的快速、簡單的優(yōu)點外，除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備，可用肉眼觀察結(jié)果等特點。檢測靈敏度可達(dá)幾個核酸拷貝或蛋白分子。由于網(wǎng)格組件可以方便地連接各種捕獲探針或針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料，因此可以適用于多種檢測方法，如生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等方法。由于網(wǎng)格組件可以方便地連接多種捕獲探針或針對目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)材料，在固相化過程中設(shè)定適當(dāng)?shù)狞c間距，譬如0.5mm/個，就可以對多個檢測目標(biāo)同時檢測。這對于檢測某些具有聯(lián)檢意義的檢測目標(biāo)具有很大的應(yīng)用價值，如國家規(guī)定對獻(xiàn)血員的必檢項目包括HbsAg、抗HCV抗體、HIV I/II病毒和抗體、梅毒抗體等，聯(lián)合檢測較為方便。本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，具有以下優(yōu)點1.簡便快捷蛋白樣品不需處理，核酸樣品經(jīng)過一般裂解、提取處理，無需標(biāo)記和擴增等過程，耗時30-40min；2.靈敏度高靈敏度可達(dá)幾個核酸拷貝或蛋白分子；3.特異性強對于核酸檢測，可以免除檢測前的擴增，避免了擴增帶來的產(chǎn)物污染問題，消除了可能存在的假陽性。
4.信噪比好顯示的結(jié)果以“全”或“無”的形式出現(xiàn)；5.結(jié)果判斷容易直接讀取放大的網(wǎng)格信號；6.適應(yīng)面廣廣泛適用于生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等多種檢測方法，既可以檢測蛋白(抗原/抗體)也可以檢測核酸(DNA/RNA)；7.組合性好根據(jù)需求可以對多個檢測目標(biāo)進(jìn)行同時檢測；8.對設(shè)備和檢測技術(shù)要求低不需昂貴的設(shè)備，普通實驗室技術(shù)人員即可操作；9.成本低廉試劑成本低。
以下面結(jié)合附圖和實例詳細(xì)解釋本發(fā)明的實施。


圖1.在對目標(biāo)核酸的檢測中形成的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)(圖解)1擴展網(wǎng)格組件 2核酸檢測網(wǎng)格組件3目標(biāo)核酸 4固相化捕獲探針5形成的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)圖2.擴展網(wǎng)格組件的形成(圖解)6納米級顆粒7一末端烷巰基化核苷酸序列A’8一末端烷巰基化核苷酸序列B’ 9擴展網(wǎng)格組件圖3.核酸檢測網(wǎng)格組件的形成(圖解)10一末端修飾后雜交探針 11一末端烷巰基化核苷酸序列A12一末端烷巰基化核苷酸序列B13內(nèi)米級顆粒14核酸檢測網(wǎng)格組件圖4.固相化捕獲探針的形成(圖解)15捕獲探針 16固相支持物17固相化捕獲探針圖5.在對目標(biāo)蛋白的檢測中形成的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)(圖解)18擴展網(wǎng)格組件 19蛋白檢測網(wǎng)格組件20目標(biāo)蛋白 21固相化捕獲蛋白222形成的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)圖6.蛋白檢測網(wǎng)格組件的形成(圖解)23雜交蛋白 24一末端烷巰基化核苷酸序列A25一末端烷巰基化核苷酸序列B26納米級顆粒27蛋白檢測網(wǎng)格組件圖7.固相化捕獲蛋白2的形成(圖解)28捕獲蛋白 29固相支持物30固相化捕獲蛋白2實施例一乙型肝炎病毒基因分型1.合成組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列人工合成組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列，包括A序列(5’-aca caa cca cacact cta ctc a-3’)、B序列(5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’)、A’序列(5’-tga gta gag tgt gtg gtt gtg t-3’)和B’序列(5’-gag ttgatg aga gga gaa gag a-3’)，并對其3’末端進(jìn)行巰基丙烷修飾，方法是合成和修飾均在DNA合成儀上完成，3’端烷巰基化核苷酸序列采用1-巰基丙烷修飾的C3 S-S CPG固相合成柱，用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)合成法合成，為了純化，不要脫去DMT保護(hù)基團(tuán)。合成結(jié)束后，將反應(yīng)柱置55℃濃氨水中孵育16h，用量按每mol合成物加入1ml濃氨水，以從反應(yīng)柱上切割核苷酸序列，同時除去堿基上的保護(hù)基團(tuán)。通過琥珀酰乙酯的作用可得到修飾有巰基丙烷的核苷酸序列和巰基丙烷連接臂的混合物，蒸發(fā)除去氨水后，采用反向HPLC進(jìn)行純化，最后在80％的乙酸中溶解30min除去DMT，測定濃度后備用。
2.合成雜交探針設(shè)計的雜交探針序列為5’-aga acc aac aag aag atg agg cat ttt tttttt ttt ttt t-3’，其3’端烷巰基化修飾。方法是合成和修飾均在DNA合成儀上完成，3’端烷巰基化核苷酸序列采用1-巰基丙烷修飾的C3 S-S CPG固相合成柱，用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)合成法合成，為了純化，不要脫去DMT保護(hù)基團(tuán)。合成結(jié)束后，將反應(yīng)柱置55℃濃氨水中孵育16h，用量按每μmol合成物加入1ml濃氨水，以從反應(yīng)柱上切割核苷酸序列，同時除去堿基上的保護(hù)基團(tuán)。通過琥珀酰乙酯的作用可得到修飾有巰基丙烷的核苷酸序列和巰基丙烷連接臂的混合物，蒸發(fā)除去氨水后，采用反向HPLC進(jìn)行純化，最后在80％的乙酸中溶解30min除去DMT，測定濃度后備用。
3.納米金的制備(檸檬酸三鈉還原法)取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸10分鐘，移除加熱器之后再攪拌15分鐘。冷卻后以重蒸水恢復(fù)至原體積，0.4μm濾紙過濾，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在535nm，A 1cm/535＝1.12。
4.檢測網(wǎng)格組件的制備取3’端烷巰基化修飾雜交探針，以及3’端烷巰基化核苷酸序列A和序列B共3OD(終濃度均為1.5uM)，與5ml納米金溶液混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
5.擴展網(wǎng)格組件的制備取3’端烷巰基化核苷酸序列A’和序列B’共3OD(終濃度均為2.0uM)，與5ml納米金溶液混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/LNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
6.捕獲探針的設(shè)計和合成乙肝病毒各型捕獲探針的設(shè)計A5’-acc act ggc cag cag cca act ttt ttt ttt ttt ttt-3’B5’-aac tgg ccg gac gcc(c/a)ac aagttt ttt ttt ttt ttt-3’C5’-tcc tac ctg att tgc ctc tgg cct ttt ttt ttt ttt ttt-3’D5’-tcc caa caa gga cac ctg gcc agt ttt ttt ttt ttt ttt-3’E5’-acc aca atc cca aca aag acc act gtt ttt ttt ttt ttt tt-3’G5’-acc cgg gtc cat agg ctc caa ctc ttt ttt ttt ttt ttt tt-3’F5’-tcc agc agt ccc gac tgg gac tct ttt ttt ttt ttt ttt t-3’ttt ttt ttt ttt部分為偶聯(lián)臂，3’端連接上氨基。
探針的合成用DNA合成儀自動合成，3’端引入相應(yīng)的氨基修飾基團(tuán)，探針用反向HPLC純化后，測定濃度，備用。
7.醛基化玻片的制備取載玻片，用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25％氨水中過夜，Milli-Q水洗。載玻片浸入5％氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5)中，室溫處理20分鐘，95％乙醇超聲清洗，Milli-Q水超聲清洗，160℃烘干4小時。將玻片浸入5％戊二醛溶液中50分鐘，Milli-Q水超聲清洗兩次，干燥后備用。
8.點樣乙肝病毒各型捕獲探針均以15μM的濃度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制備儀將捕獲探針噴到醛基化的玻片上，點間距為0.5mm。點樣完畢后，室溫放置過夜。使用前0.2％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后1％NaBH4溶液還原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用。
9.雜交檢測按常規(guī)的水飽和酚/氯仿/異戊醇法提取樣本核酸。適量水復(fù)溶后，取12ul樣本DNA/RNA與等量的0.1N氫氧化鈉溶液混合，再與100ul雜交緩沖液(5×SSC)混合后，與已固相化乙肝病毒各型捕獲探針的載玻片在42℃雜交15min后，分別用1×SSC、0.2％SDS，0.2×SSC，0.1×SSC清洗，甩干。加入100ul雜交緩沖液(5×SSC)和檢測網(wǎng)格組件5ul在42℃雜交5min，再加入擴展網(wǎng)格組件5ul在42℃孵育10min，用0.01mol pH 7.4PBS-T洗滌3次，目測或鏡下判斷結(jié)果，有色斑者為陽性，無色斑者為陰性。
實施例二柯薩奇B組病毒分型蛋白芯片1.合成組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列人工合成組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列，包括A序列(5’-aca caa cca cacact cta ctc a-3’)、B序列(5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’)、A’序列(5’-tga gta gag tgt gtg gtt gtg t-3’)和B’序列(5’-gag ttgatg aga gga gaa gag a-3’)，并對其3’末端進(jìn)行巰基丙烷修飾，方法是合成和修飾均在DNA合成儀上完成，3’端烷巰基化核苷酸序列采用1-巰基丙烷修飾的C3 S-S CPG固相合成柱，用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)合成法合成，為了純化，不要脫去DMT保護(hù)基團(tuán)。合成結(jié)束后，將反應(yīng)柱置55℃濃氨水中孵育16h，用量按每μmol合成物加入1ml濃氨水，以從反應(yīng)柱上切割核苷酸序列，同時除去堿基上的保護(hù)基團(tuán)。通過琥珀酰乙酯的作用可得到修飾有巰基丙烷的核苷酸序列和巰基丙烷連接臂的混合物，蒸發(fā)除去氨水后，采用反向HPLC進(jìn)行純化，最后在80％的乙酸中溶解30min除去DMT，測定濃度后備用。
2.納米金的制備(檸檬酸三鈉還原法)取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸10分鐘，移除加熱器之后再攪拌15分鐘。冷卻后以重蒸水恢復(fù)至原體積，0.4μm濾紙過濾，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在535nm，A 1cm/535＝1.12。
3.檢測網(wǎng)格組件的制備取納米金溶液10ml，以0.1Mol/L K2CO3調(diào)整pH值至9，攪拌下加入成品羊抗人IgM抗體100ug左右，調(diào)整終濃度至10ug/ml。繼續(xù)攪拌10min，加入1％聚乙二醇(20KD)至總?cè)芤旱?/10(V/V)。1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀用PBS緩沖液重懸至5ml，4℃保存?zhèn)溆谩⒁呀?jīng)標(biāo)上羊抗人IgM抗體的納米金溶液5ml加入3’端烷巰基化核苷酸序列Ah和序列B共3OD(終濃度均為1.5uM)，混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心后保存于0.3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
4.擴展網(wǎng)格組件的制備取3’端烷巰基化核苷酸序列A’和序列B’共3OD(終濃度均為2.0uM)，與5ml納米金溶液混合，孵育16h左右，然后將混合溶液置0.1mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液中，保持40h后，1400r/min離心30min。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，1400r/min離心30min后保存于0.3mol/LNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，探針終濃度為10p mol/μl。
5.分型抗原制備以基因工程方法制得的柯薩奇B組病毒1-6型VP1蛋白作為分型抗原。
6.醛基化玻片的制備取載玻片，用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25％氨水中過夜，Milli-Q水洗。玻片浸入5％氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5)中，室溫處理20分鐘，95％乙醇超聲清洗，Milli-Q水超聲清洗，160℃烘干4小時。將玻片浸入5％戊二醛溶液中50分鐘，Milli-Q水超聲清洗兩次，干燥后備用。
7.點樣將1-6型VP1蛋白稀釋到終濃度為1mg/ml，用PixySys5500芯片制備儀將其噴到醛基化的玻片上，點間距為0.5mm。點樣完畢后，37℃孵育2h，PBS-T(0.01mol/L pH 7.2，0.05％Tween 20)洗4次。用含有10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.2)37℃封閉1h。雙蒸水清洗兩次，干燥后待用。
8.雜交檢測取50ul待測血清，與等量的PBS(0.01mol/L pH7.2)混合，加入至已固相化1-6型VP1蛋白的載玻片上，37℃孵育30min后，分別用1×SSC、0.2％SDS，0.2×SSC，0.1×SSC清洗，甩干。加入100ul雜交緩沖液(5×SSC)和檢測網(wǎng)格組件5ul在42℃雜交5min，再加入擴展網(wǎng)格組件5ul，42℃孵育10min，用0.01mol pH 7.4PBS-T洗滌3次，目測或鏡下判斷結(jié)果，有色斑者為陽性，無色斑者為陰性。
權(quán)利要求
1.一種三維網(wǎng)格(2)檢測技術(shù)，其特征是采用了兩種網(wǎng)格組件(3)以形成三維網(wǎng)格。通過合成兩種不互補的核苷酸序列，以及兩種與之配對的核苷酸序列(4)，對其末端進(jìn)行修飾后(5)，分別以納米級顆粒(6)為核心形成網(wǎng)格組件。在檢測目標(biāo)蛋白或目標(biāo)核酸時，需要在其中一種網(wǎng)格組件上加上雜交蛋白或雜交探針(7)，配合固相化(8)的捕獲蛋白(7)或捕獲探針(7)，以實現(xiàn)對目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白的特異性捕獲。當(dāng)兩種網(wǎng)格組件處于同一體系(9)中時，在滿足其反應(yīng)條件的情況下，其核苷酸序列將互補配對，形成三維網(wǎng)格，實現(xiàn)信號放大，可被肉眼識別。這種檢測技術(shù)可應(yīng)用于多種生物檢測的方法(10)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，三維網(wǎng)格是立體的，在檢測實驗中形成。形成的時間，可以是在目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白被捕獲前，也可以是在目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白被捕獲后。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，網(wǎng)格組件可以有兩個或兩個以上，檢測時，不同的網(wǎng)格組件間通過互補配對的核苷酸序列雜交連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，組成網(wǎng)格組件的核苷酸序列均為人工合成，組成同一個網(wǎng)格組件的核苷酸序列可以有兩種或兩種以上，它們之間是不互補的。設(shè)計了A序列、B序列、A’序列和B’序列。其中A序列與A’序列互補，但與B序列和B’序列不互補；B序列與B’序列互補，但與A序列和A’序列不互補。設(shè)計的序列為A序列5’-aca caa cca cac act cta ctc a-3’；B序列5’-tct ctt ctc ctc tca tca act c-3’；A’序列5’-tga gta gag tgt gtg gtt gtg t-3’；B’序列5’-gag ttg atg aga gga gaa gag a-3’。其中A序列與B序列用于組成一個網(wǎng)格組件，A’序列B’序列用于組成另一個網(wǎng)格組件。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，所用的核苷酸序列，無論是應(yīng)用于組件的核苷酸序列，還是應(yīng)用于檢測的核苷酸序列，均對其某一個末端進(jìn)行修飾。應(yīng)用于組件的核苷酸序列，無論是修飾3’端，還是修飾5’端，均采用烷巰基修飾，試劑可以是巰基丙烷、巰基己烷、巰基丁烷等。對核苷酸序列末端進(jìn)行修飾的目的是使其利用修飾基團(tuán)“站立”在納米顆?；蚬滔嘀С治锷?，而不是整體“躺倒”在納米顆?；蚬滔嘀С治锷?。應(yīng)用于檢測的核苷酸序列，選擇在其3’末端，或5’末端加入10-50個堿基的臂，也可以不加入堿基臂。末端加入堿基臂的目的是避免可能存在的空間位阻。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，納米級顆?？梢允墙稹y等金屬材料，也可以是硒、硅、碳、塑料等非金屬材料，直徑在1nm-100nm之間，在可見光區(qū)具有一定的色澤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，固相化的捕獲探針和檢測網(wǎng)格組件上的雜交探針與被檢測的目標(biāo)核酸之間存在互補配對關(guān)系，互補的位置不能重疊，但是相鄰。固相化的捕獲蛋白和檢測網(wǎng)格組件上的雜交蛋白與被檢測的目標(biāo)蛋白之間存在免疫學(xué)配對關(guān)系，并且捕獲蛋白與雜交蛋白間不能競爭目標(biāo)蛋白的同一位點。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，捕獲探針的固相化和免疫學(xué)材料的固相化，是指將其與固相支持物的結(jié)合的處理過程，采用的固相支持物可以是玻璃片，也可以是硅片、塑料片、纖維素膜等其他材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，檢測實驗應(yīng)在同一體系中完成，這是一個共同進(jìn)行反應(yīng)的實驗體系，這個體系包括液-液和固-液等狀態(tài)，而在此前，各種試劑成分是彼此孤立的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，其特征在于，在實驗中形成三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，可在生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等方法中應(yīng)用，檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三維網(wǎng)格檢測技術(shù)，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。該技術(shù)可在生物芯片、免疫檢驗和免疫組化、轉(zhuǎn)膜雜交等方法中應(yīng)用，檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白。通過合成兩種不互補的核苷酸序列，以及兩種與之配對的核苷酸序列，分別以納米級顆粒為核心形成網(wǎng)格組件。當(dāng)兩種網(wǎng)格組件處于同一體系中時，在滿足其反應(yīng)條件的情況下，其核苷酸序列將互補配對，形成三維網(wǎng)格，實現(xiàn)信號放大，可被肉眼識別。在檢測目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白時，需要在其中一種網(wǎng)格組件上加上雜交蛋白或雜交探針，配合固相化的捕獲蛋白或捕獲探針，以實現(xiàn)對目標(biāo)核酸或目標(biāo)蛋白的特異性捕獲。該技術(shù)敏感性高，成本低廉，方便快速。
文檔編號C12Q1/68GK1959384SQ20051004847
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月1日
發(fā)明者李智濤, 王云龍, 陳小科, 李晨陽, 李玉林 申請人:河南省生物工程技術(shù)研究中心