專利名稱：16SrⅡ組植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植原體(phytoplasma)(原稱類菌原體Mycoplasma-like Organism，簡稱MLO)是一類無細(xì)胞壁，存在于植物篩管細(xì)胞內(nèi)的原核生物。植原體自1967年被日本學(xué)者土居養(yǎng)二首次發(fā)現(xiàn)后，迄今為止，世界上報道的植物植原體病害多達(dá)300余種。由于植原體嚴(yán)格寄生于寄主植物韌皮部，不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，因而對其遺傳本質(zhì)、生化特性、營養(yǎng)要求等都無從得知，同時對其檢測及鑒定技術(shù)的發(fā)展也受到阻礙。早期對植原體的鑒定主要是通過生物學(xué)特性，如癥狀特征、與昆蟲介體的相互關(guān)系等進(jìn)行的。這些方法費(fèi)時費(fèi)力，結(jié)果往往也不是很可靠。80年代，隨著血清學(xué)、分子探針以及PCR技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，為植原體的檢測提供了一種相對簡單、靈敏、可靠的方法。通過對植原體進(jìn)化過程中相對保守基因(16SrRNA基因或核糖體蛋白基因)的序列分析或擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析，可對植原體進(jìn)行鑒定和分類，同時也建立了植原體的分類體系。
根據(jù)植原體16SrRNA基因及核糖體蛋白基因的RFLP分析，已將植原體分為14個確定組，即16SrI，16SrII……16SrXIV。其中16SrII組以花生叢枝病為代表，主要包括花生叢枝、甘薯叢枝、酸橙叢枝、蠶豆變?nèi)~、甘薯小葉及仙人掌叢枝等。
根據(jù)植原體16SrRNA基因序列，目前已設(shè)計(jì)出很多針對植原體組的特異引物，其中包括16SrI組、16SrIII組、16SrV組、16SrVI組、16SrVII組、16SrX組等，這些組的特異引物是根據(jù)組成各個組的植原體成員的16SrRNA基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，顯然特異引物就不能對16SrII組的植原體進(jìn)行直接鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性高、操作方便的專門用于16SrII組植原體的檢測試劑盒和使用方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒，包括以下成分(1)植原體16SrRNA基因通用引物序列R16mF25’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’R16mR15’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’(2)16SrII組植原體的特異引物序列
R16(II)F15’-AGTGGCGAACCATTTGTT-3’；R16(II)R15’-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3’(3)試劑盒反應(yīng)體系含有10×PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
試劑盒反應(yīng)體系各試劑終濃度為1×PCR反應(yīng)緩沖液，2.0mM MgCl2，0.2mMdNTPs，0.6μM R16mF2/R1引物(或R16(II)F1/R1)及4-5個單位的Taq DNA聚合酶。
16SrII組植原體的PCR檢測方法(1)PCR反應(yīng)在上述檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA后，再加入超純水使反應(yīng)總體積為50μl。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應(yīng)循環(huán)后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10個循環(huán)后72℃保溫10min，4℃冰箱中保存。
(2)電泳檢測取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有16SrII組植原體的樣品電泳檢測結(jié)果可觀察到1500bp和990bp的二條特異擴(kuò)增條帶，而非16SrII組植原體的樣品電泳檢測結(jié)果只能觀察到1500bp的擴(kuò)增條帶。
本發(fā)明提供的16SrII組植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果(1)具有較高的檢測靈敏度。在第一次PCR反應(yīng)中，使用植原體16SrRNA基因通用引物經(jīng)10次循環(huán)可擴(kuò)增出植原體特異大片段，這些產(chǎn)物為第二次擴(kuò)增提供了足夠的模板，這樣便大大提高了檢測的靈敏度。在加入了16SrII組的特異引物后，經(jīng)10次反應(yīng)循環(huán)便可通過電泳檢測是否有16SrII組的特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
(2)具有較高的擴(kuò)增特異性。通常在PCR反應(yīng)過程中，退火溫度高，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性便會提高。在本試劑盒的使用方法中，使用植原體通用引物(R16mF2/R1)的第一次擴(kuò)增反應(yīng)中，為了提高植原體特異大片段的特異性，采用了較高的退火溫度(60℃)；而在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中，則采用了較低的退火溫度(40℃)，但仍只擴(kuò)增出了和引物設(shè)計(jì)相符的990bp的擴(kuò)增小片段，這足以說明該反應(yīng)試劑盒具有較高的特異性。
(3)能快速檢測植原體病害樣品，同時又可對屬于16SrII組的植原體進(jìn)行分類鑒定。本試劑盒根據(jù)6種16SrII組和其它16Sr組植原體株系的16SrDNA序列比較結(jié)果，設(shè)計(jì)了一對針對16SrII組植原體PCR檢測的特異引物，經(jīng)過二次PCR反應(yīng)，即可同時檢測并鑒定16SrII組植原體。


圖1 16SrII組植原體特異引物循環(huán)PCR擴(kuò)增條帶MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1CK；2-3分別為泡桐叢枝和桑樹黃萎，均為非16SrII組植原體樣品；4-5分別為花生叢枝和仙人掌叢枝，為16SrII組植原體樣品。
具體實(shí)施例方式
1、植原體16SrRNA基因通用引物序列的合成及配制參照Lee等人所報道的植原體16SrRNA基因通用引物對R16mF2/R16mR1序列合成引物，擴(kuò)增長度約為1500bp。引物溶解于適量滅菌水中至終濃度為10μM。
2、16SrII組植原體PCR引物的設(shè)計(jì)、合成與配制根據(jù)6種16SrII組和其它16Sr組植原體株系的16SrDNA序列比較結(jié)果(圖1)，設(shè)計(jì)并合成與仙人掌叢枝病植原體CWB株系16SrDNA第416-433區(qū)段堿基序列同源的上游引物R16(II)F1及與第1387-1405區(qū)段堿基序列互補(bǔ)的下游引物R16(II)R1，擴(kuò)增長度為990bp。引物溶解于適量滅菌水中至終濃度為10μM。
416 433 1387 1405↓ ↓ ↓↓CWBAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGFBPAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWBDL AGTGGTGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTA.TCGAGPnWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSUNHP AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSPWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWX AGT.G.GAAAAACTCCCT………………CCTAACTTCGCAAGA..AGLY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTGCGTAAGC..AGPPWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTTCGTTAGA..AGEY1AGTGG.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGCP AGT.G.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGAshY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAACTTCGCAAGA..CGLfWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAATTTCGTAAGA..AASAYGAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTCGCAAG..AAGSTOL GGT.G.GAAAAACCATTA………………CCTAACTTGAGCAATCAAGAT GAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTGCAA....AAG3、PCR試劑盒的組裝PCR反應(yīng)各試劑按試劑盒反應(yīng)體系配制。
4、16SrII組植原體PCR檢測試劑盒的檢測方法(1)PCR反應(yīng)在上述PCR檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA后，再加入超純水使反應(yīng)總體積為50μl。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應(yīng)循環(huán)后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，進(jìn)行10個循環(huán)后于72℃保溫10min。
(2)電泳檢測取5μl反應(yīng)產(chǎn)物與1μl 6倍電泳上樣緩沖液混勻，在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下以泡桐叢枝病、桑樹黃萎病等2個非16SrII組植原體的總DNA為對照，按照試劑盒的使用方法檢測該試劑盒的特異性，結(jié)果表明以泡桐叢枝病、桑樹黃萎病等2個非16SrII組植原體的總DNA為模板的PCR，只擴(kuò)增出約1.5kb的特異帶，而以花生叢枝及仙人掌叢枝等2個16SrII組植原體的總DNA為模板的PCR卻擴(kuò)增出約1.5kb和約小于1.0kb的兩條混合條帶，其中約小于1.0k條帶與引物設(shè)計(jì)相符。說明該試劑盒有較高的特異性。
權(quán)利要求
1.一種16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其檢測方法，其特征是試劑盒包括以下成分(1)植原體16S rRNA基因通用引物序列R16mF25’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’R16mR15’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’(2)16SrII組植原體的特異引物序列R16(II)F15’-AGTGGCGAACCATTTGTT-3’；R16(II)R15’-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3’(3)試劑盒反應(yīng)體系含有10×PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其檢測方法，其特征在于所述的試劑盒反應(yīng)體系各試劑終濃度為1×PCR反應(yīng)緩沖液，2.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.6μM R16mF2/R1(或R16(II)F1/R1)引物及4-5個單位的Taq DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其方法，其檢測步驟為(1)PCR反應(yīng)在上述檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA后，再加入超純水使反應(yīng)總體積為50μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應(yīng)循環(huán)后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10個循環(huán)后72℃保溫10min，4℃冰箱中保存；(2)電泳檢測取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察含有16SrII組植原體的樣品電泳檢測結(jié)果可觀察到1500bp和990bp的二條特異擴(kuò)增條帶，而非16SrII組植原體的樣品電泳檢測結(jié)果只能觀察到1500bp的擴(kuò)增條帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用于16SrII組植原體的檢測。試劑盒包括PCR常用反應(yīng)試劑，主要有PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl
文檔編號C12Q1/68GK1824798SQ200510048729
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者蔡紅, 陳海如, 孔寶華, 范靜華, 李凡, 和志嬌, 劉濤, 楊根華 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)