專利名稱：水稻白葉枯病菌快速分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻白葉枯病菌快速分離方法。
背景技術(shù)：
水稻白葉枯病是亞洲和太平洋地區(qū)水稻生產(chǎn)上最重要的細(xì)菌性病害之一。水稻白葉枯病是由病原細(xì)菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)侵染而引發(fā)的一種主要水稻病害，不但嚴(yán)重發(fā)生在東南亞各國(guó)，而且已經(jīng)蔓延到澳洲，美洲和非洲。我國(guó)目前除新疆外，全國(guó)都有不同程度的發(fā)生，是水稻上僅次于稻瘟病的重要病害。水稻受害后，一般減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重的減產(chǎn)50％甚至顆粒無(wú)收。水稻抗病品種的培育、利用和病害的流行學(xué)研究，以及病原菌的小種分化、群體遺傳多樣性研究，都離不開快速獲得具有致病性的病原細(xì)菌分離物。植物病原細(xì)菌快速分離和純培養(yǎng)，無(wú)論是在科學(xué)試驗(yàn)或是生產(chǎn)實(shí)踐中都有著重大的理論張實(shí)踐意義，純培養(yǎng)意味著從自然界中將特定的微生物分離出來(lái)，在人工培養(yǎng)基上增殖。特別是病原細(xì)菌，如何有效地去除病組織表面或其內(nèi)部的其它微生物，快速獲得目標(biāo)病原菌，一直都是植物病理學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)。
目前，用于水稻白葉枯病菌分離方法多采用沙培法，主要機(jī)理為通過(guò)對(duì)病組織進(jìn)行保濕，使菌膿從病組織切出口產(chǎn)生，將后將菌膿放在適當(dāng)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)。病組織破碎稀釋涂板分離法，該方法主要機(jī)理為首先破碎病組織，用無(wú)菌水浸提適量含菌液，然后經(jīng)倍比稀釋后，將稀釋液置于適當(dāng)培基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，上述兩種方法預(yù)處理時(shí)間均較長(zhǎng)，前者高達(dá)20小時(shí)，后者分離一個(gè)樣品也需5小時(shí)；操作占用空間大，使用耗材和消耗樣品多，另外破碎病組織，使得大量?jī)?nèi)生細(xì)菌或腐生菌浸提出病組織，造成污染率高，上述方法已不適用于水稻白葉枯病菌快速分離的需要，其分離速度太慢，所用空間大，在一定時(shí)間內(nèi)處理的樣本量偏少，分離效率低，污染程度高，常因病組織樣品處理不及時(shí)，使得樣品難以處理，浪費(fèi)了大量的標(biāo)本。達(dá)不到實(shí)驗(yàn)中理想病原物快速分離和分離物選擇、致病性需求的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服現(xiàn)有水稻白葉枯病菌分離方法的不足，提供了一種能夠及時(shí)處理水稻白葉枯病害標(biāo)樣，高效、快速、準(zhǔn)確獲得目標(biāo)病原物菌分離的方法。
本發(fā)明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.采用載玻片噴菌法快速分離水稻白葉枯病菌(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取0.5-1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒60-90秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無(wú)菌水，室溫靜止5-15min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)沾含菌液在普通NA或SX培養(yǎng)基劃線；(4)細(xì)菌培養(yǎng)24-28℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)48-72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
其中步驟1中(4)細(xì)菌培養(yǎng)用NA，SX培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基配方牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白胨5g、蔗糖10g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，pH調(diào)至7.0；SX培養(yǎng)基配方可溶性淀粉10g，氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17-20g、加水定容至1000ml、調(diào)pH至7.0。分裝300ml，高壓鍋滅菌，滅菌條件溫度121℃，壓力0.15Mpa，滅菌時(shí)間20-25min，待冷卻到50-55℃，倒平板，供分離用。
2.液體冷凍法保存將長(zhǎng)好的單菌落，用滅菌芽簽挑取少許，直接放入盛有NB液體培養(yǎng)液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗(yàn)證采用剪葉法接種，接種前，以無(wú)菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑒別品種等，接種2周和3周后分別測(cè)量病斑長(zhǎng)度和該葉片的全長(zhǎng)，每個(gè)菌株測(cè)量10張葉片。以三周后調(diào)查的病斑長(zhǎng)度小于接種葉長(zhǎng)的四分之一為抗病(R)，反之大于或等于接種葉長(zhǎng)的四分之一為感病(S)。
本方法的有益效果利用細(xì)菌的噴菌現(xiàn)象原理，以載玻片為分離載體，按照本發(fā)明的描述的白葉枯病菌快速分離方法，由于本方法分離病原細(xì)菌，使用病組織體積小，并且未破壞病組織原始結(jié)構(gòu)，病菌從病組織切口處噴出，含菌液中細(xì)菌單一，活力強(qiáng)，與國(guó)內(nèi)同類分離方法相比優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)用該方法分離的水稻白葉枯病菌，能保持原野生型的活性，變異程度極低。解決了其它分離方法污染率高，不易得到目標(biāo)病原細(xì)菌的問(wèn)題；(2)分離速度快，主要原因是縮短了樣品處理時(shí)間，由傳統(tǒng)沙培法的20小時(shí)，縮短為2-3h，該方法與沙培法相比處理樣本數(shù)量大，減少了病標(biāo)本使用量，而且分離獲得的病原物純度高；(3)操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便易行，成本低，應(yīng)用廣泛。該方法除用于分離水稻白葉枯病菌外，還已用于分離水稻細(xì)菌性條斑病菌、紅掌細(xì)菌性疫病等葉斑類植物病原細(xì)菌。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一本發(fā)明水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離，具體步驟如下(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取0.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒60秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無(wú)菌水，室溫靜止5min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)沾取含菌液在普通NA培養(yǎng)基劃線；(4)細(xì)菌培養(yǎng)24℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)48h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
2.液體冷凍法保存將長(zhǎng)好的單菌落，用滅菌芽簽挑取少許，直接放入盛有NB液體培養(yǎng)液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗(yàn)證采用剪葉法接種，接種前，以無(wú)菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑒別品種等，接種2周和3周后分別測(cè)量病斑長(zhǎng)度和該葉片的全長(zhǎng)，每個(gè)菌株測(cè)量10張葉片。以三周后調(diào)查的病斑長(zhǎng)度小于接種葉長(zhǎng)的四分之一為抗病(R)，反之大于或等于接種葉長(zhǎng)的四分之一為感病(S)。
沙培法分離水稻白葉枯病菌方法如下首先要切取水稻白葉枯病病葉子3-5cm，每份標(biāo)本至少需3片葉，仍采用75％酒精進(jìn)行表面消毒，然后將病葉插入裝有滅菌沙子的瓷缸(直徑8cm)中，用無(wú)菌水將沙子濕潤(rùn)，然后用兩層砂布封口，室溫下擺放，20小時(shí)后，揭開砂布，用移菌粘取病葉切口處的菌膿，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用普通NA培養(yǎng)基，根據(jù)菌落形態(tài)等培養(yǎng)性狀，進(jìn)行選擇，即可獲得大量水稻白葉枯病菌。同樣采用液體冷凍法保存和分離菌株的致病性驗(yàn)證。
4.實(shí)施效果從表1可知，采用本發(fā)明的快速分離方法，在處理同樣病樣時(shí)，與采用通用的沙培法分離相比，分離所需時(shí)間由48h縮短為4h，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用砂布和瓷缸，減少了無(wú)菌水的用量和占用空間體積由10m2減為0.5m2。病葉數(shù)使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為96％，而沙培法僅為40％，污染率顯著降低。
表1.本發(fā)明與沙培法分離水稻白葉枯病菌的比較

實(shí)施例二本發(fā)明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟如下(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒90秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無(wú)菌水，室溫靜止15min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)劃線于普通SX培養(yǎng)基上，SX培養(yǎng)基配方可溶性淀粉10g，氯化銨5g，牛肉浸膏1g，磷酸二氫鉀2g，瓊脂17g，加水定容至1000ml，調(diào)pH至7.0；(4)細(xì)菌培養(yǎng)28℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
2.液體冷凍法保存同實(shí)施例一。
3.分離菌株的致病性驗(yàn)證同實(shí)施例一。
病組織破碎稀釋涂板法，具體步驟為首先將病組織消毒，采用0.1％升汞進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，然后再用選用75％灑精消毒90秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然后加入3-5ml無(wú)菌水，室溫靜止20min，然后用移液管洗取1ml含菌浸出液，進(jìn)行10x系列稀釋，選取10-3，10-4，10-5三個(gè)梯度，每皿涂0.1ml，用自制玻璃涂棒在SX培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，28℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
4.實(shí)施效果從表2可知，采用本發(fā)明的快速分離方法，在處理同樣病樣時(shí)，與采用通用的沙培法分離相比，分離每個(gè)樣品所需時(shí)間由30min縮短為10min，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用培養(yǎng)皿，顯著減少了無(wú)菌水的用量由每個(gè)樣品需200ml至30ml和占用空間體積由5m2減為0.1m2。病葉數(shù)使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為95％，而沙培法僅為50％，污染率顯著降低。
表2.本發(fā)明與病組織破碎稀釋涂板分離法的比較

實(shí)施例三本發(fā)明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟如下(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取1.0cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒75秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無(wú)菌水，室溫靜止10min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)劃線于普通SX培養(yǎng)基上，SX培養(yǎng)基配方可溶性淀粉10g、氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，調(diào)pH至7.0；(4)細(xì)菌培養(yǎng)25℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)56h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
2.液體冷凍法保存同實(shí)施例一。
3.分離菌株的致病性驗(yàn)證同實(shí)施例一。
沙培法分離水稻白葉枯病菌方法如下首先要切取水稻白葉枯病病葉子3-5cm，每份標(biāo)本至少需3片葉，仍采用75％酒精進(jìn)行表面消毒，然后將病葉插入裝有滅菌沙子的瓷缸(直徑8cm)中，用無(wú)菌水將沙子濕潤(rùn)，然后用兩層砂布封口，室溫下擺放，20小時(shí)后，揭開砂布，用移菌粘取病葉切口處的菌膿，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用普通NA培養(yǎng)基，根據(jù)菌落形態(tài)等培養(yǎng)性狀，進(jìn)行選擇，即可獲得大量水稻白葉枯病菌。同樣采用液體冷凍法保存和分離菌株的致病性驗(yàn)證。
病組織破碎稀釋涂板法，具體步驟為首先將病組織消毒，采用0.1％升汞進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，然后再用選用75％灑精消毒90秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然后加入3-5ml無(wú)菌水，室溫靜止20min，然后用移液管洗取1ml含菌浸出液，進(jìn)行10x系列稀釋，選取10-3，10-4，10-5三個(gè)梯度，每皿涂0.1ml，用自制玻璃涂棒在SX培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，28℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
4.實(shí)施效果從表3可知，采用本發(fā)明的快速分離方法，在處理同樣病樣時(shí)，與采用通用的沙培法和病組織破碎稀釋涂板分離法分離相比，分離每個(gè)樣品所需時(shí)間分別由1h和30min縮短為10min，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用紗布、試管、涂棒、培養(yǎng)皿，顯著減少了無(wú)菌水的用量由每個(gè)樣品需100ml和200ml至30ml和占用空間體積由25m2和4.7m2減為0.09m2。病葉數(shù)使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為93％，而沙培法和病組織破碎稀釋涂板分離法僅為40％和47％，污染率顯著降低。
表3.本發(fā)明與沙培法和病組織破碎稀釋涂板分離法的比較

實(shí)施例四本發(fā)明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離，具體步驟如下(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取0.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒80秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上3滴無(wú)菌水，室溫靜止15min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)劃線于普通NA培養(yǎng)基上；(4)細(xì)菌培養(yǎng)25℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)56h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)進(jìn)行保存或和病性驗(yàn)證。
2.液體冷凍法保存將長(zhǎng)好的單菌落，用滅菌芽簽挑取少許，直接放入盛有NB液體培養(yǎng)液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗(yàn)證采用剪葉法接種，接種前，以無(wú)菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑒別品種等，接種2周和3周后分別測(cè)量病斑長(zhǎng)度和該葉片的全長(zhǎng)，每個(gè)菌株測(cè)量10張葉片。以三周后調(diào)查的病斑長(zhǎng)度小于接種葉長(zhǎng)的四分之一為抗病(R)，反之大于或等于接種葉長(zhǎng)的四分之一為感病(S)。
4.實(shí)施效果詳見(jiàn)表3、4。采用本發(fā)明從云南省9個(gè)地州約40個(gè)縣市120點(diǎn)，分離獲得和保存菌株約200株，其中40個(gè)代表代表菌株的致病性測(cè)定表明菌株純度高，致病性差異明顯，能保持菌株的野生型，基本上接自然菌株存在的狀態(tài)，由強(qiáng)毒性和弱毒性菌株組成，病斑長(zhǎng)度從1.9到24.2cm。利用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB4、IRBB3、IRBB14、IRBB1和IR24作為鑒別品種，根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作反應(yīng)，將采用本發(fā)明分離的白葉枯菌株劃分為相應(yīng)的11個(gè)小種。對(duì)應(yīng)11個(gè)小種互作模式為，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R7抗感感抗感感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感；R10抗感抗抗感感；R12抗抗感抗感感；R13抗感抗感感感。
表4.采用本發(fā)明分離獲得的代表性菌株的致病性測(cè)定

續(xù)表4.采用本發(fā)明分離獲得的代表性菌株的致病性測(cè)定

表5.云南水稻白葉枯代表菌株小種分化

權(quán)利要求
1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是(1)標(biāo)樣選擇選取具有典型癥狀的水稻白葉枯病標(biāo)本，在發(fā)病擴(kuò)展前沿病鍵交界處，剪取0.5-1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來(lái)水沖洗，選用75％灑精消毒60-90秒，然后用無(wú)菌水沖洗3次，稍涼干后用剪刀修剪，去除多余的健康組織；(3)先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，在酒精燈火上輕燒，將消毒過(guò)的組織塊放在滅菌的載玻片上，兩端滴上1滴無(wú)菌水，室溫靜置5-15min，待噴菌現(xiàn)象出現(xiàn)后，用移菌環(huán)沾含菌液劃線于普通NA或SX培養(yǎng)基上；(4)細(xì)菌培養(yǎng)24-28℃培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)48-72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細(xì)菌培養(yǎng)性狀，進(jìn)行挑選，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的水稻白葉枯病菌分離方法，其特征是，所述NA培養(yǎng)基的配方為牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白胨5g、蔗糖10g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，調(diào)pH至7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求所述的水稻白葉枯病菌分離方法，其特征是，所述SX培養(yǎng)基配方可溶性淀粉10g、氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17-20g，加水定容至1000ml，調(diào)pH至7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻白葉枯病菌快速分離方法，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。將含目標(biāo)病原細(xì)菌的水稻病組織，經(jīng)用75％灑精消毒60－90秒后，用無(wú)菌水沖洗，將病組織置于無(wú)菌載玻片上，滴加無(wú)菌水，室溫?cái)[放5－15min，待病原菌從病組織中噴出到切口處的水中，用移菌環(huán)沾取含菌液劃線于適于水稻白葉枯病菌生長(zhǎng)的NA或SX培養(yǎng)基上，25－28℃培養(yǎng)，即可得到相應(yīng)的目標(biāo)細(xì)菌。本發(fā)明分離細(xì)菌快速、準(zhǔn)確、污染率低、純度高、菌株變異極小，保持了病原菌野生型的特性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1807587SQ20051004873
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者姬廣海, 張世光, 陳興全, 何月秋 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)