專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種通過(guò)免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
李壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)為雀麥花葉病毒科等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬成員，可以通過(guò)機(jī)械摩擦、昆蟲(chóng)介體、芽接和嫁接等方式傳播。植株感染李壞死環(huán)斑病毒后，整株帶毒，終生危害。李壞死環(huán)斑病毒寄主范圍廣，能侵染雙子葉植物中的21個(gè)科，引起許多植物產(chǎn)生壞死和環(huán)斑。李壞死環(huán)斑病毒侵染果樹(shù)后引起產(chǎn)量和品質(zhì)下降。據(jù)報(bào)道，感染李壞死環(huán)斑病毒的櫻桃的萌芽率大大降低，再如，素有“花中皇后”的美稱(chēng)的月季歷來(lái)受到各國(guó)人民的喜愛(ài)，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是一旦感染李壞死環(huán)斑病毒后，植株矮化，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后幾乎不開(kāi)花或是開(kāi)花過(guò)小以及畸形等，嚴(yán)重地降低了植株的商品性和觀賞性。到目前為止，國(guó)際上尚無(wú)治療病毒病害的特效藥劑，因此對(duì)感染病毒病的植株進(jìn)行病原檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，對(duì)于識(shí)別病毒病害和防治其病害的傳播具有重要的實(shí)際意義，是生產(chǎn)上對(duì)病毒病害進(jìn)行綜合治理的重要措施之一。
通常檢測(cè)病毒的方法有指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。相比較而言，指示植物法雖然簡(jiǎn)單，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，最短也要10～20天，而且靈敏度非常低，有些植物體內(nèi)含有病毒，還受到季節(jié)、環(huán)境以及病毒性質(zhì)等方面的影響，因此已經(jīng)很少用于病毒的檢測(cè)。免疫電鏡的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了電鏡技術(shù)在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用，但是電子顯微鏡價(jià)格昂貴，制樣技術(shù)復(fù)雜，不易掌握，不適合作為病毒檢測(cè)的普通方法。目前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)病毒的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和分子生物學(xué)技術(shù)。較之指示植物法和電鏡技術(shù)，ELISA方法檢測(cè)周期較短，靈敏度高，可以檢測(cè)到納克(ng)級(jí)水平的病害，但是對(duì)于植株體內(nèi)含量較低的病毒，往往會(huì)發(fā)生漏檢的現(xiàn)象。分子生物學(xué)技術(shù)，特別是RT-PCR技術(shù)不但操作簡(jiǎn)單，而且特異性、靈敏度較ELISA方法高，可以檢測(cè)到飛克(fg)級(jí)水平的病毒。李壞死環(huán)斑病毒多感染木本植物，植株體內(nèi)病毒含量低，而且植物組織富含多糖和酚類(lèi)，嚴(yán)重影響了普通RT-PCR的靈敏度和特異性，很容易發(fā)生漏檢的情況。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)方法在檢測(cè)植物上李壞死環(huán)斑病毒的不足，提供了一種靈敏、特異的檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法。
本發(fā)明的步驟是1.設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的引物
2.免疫捕獲1)取100mg感病組織，加1mL研磨緩沖液充分研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中，4000rpm離心4min，上清液即為病組織粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被緩沖液稀釋200倍的李壞死環(huán)斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃過(guò)夜；3)棄PCR管中包被液，用PBST洗滌3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃過(guò)夜；4)用PBST洗滌PCR管3次，ddH2O洗滌1次，低速離心15sec，棄殘余液體；3.RT-PCR1)在包被過(guò)的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，輕微振蕩混勻后于70℃溫育10min，之后迅速冰浴5min；2)反轉(zhuǎn)錄向上述PCR管中按以下體系加入試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表體系加入各試劑
設(shè)置PCR程序?yàn)?4℃4min，94℃1min、50℃～56℃1min、72℃2min，擴(kuò)增30～38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4.電泳檢測(cè)配制0.8％～2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5.結(jié)果分析根據(jù)電泳膠上擴(kuò)增條帶的有無(wú)及其大小判定所檢測(cè)的植物中是否感染李壞死環(huán)斑病毒，即如果凝膠中存在483bp的核酸片段則說(shuō)明樣品中含有李壞死環(huán)斑病毒。
其中，所述的PCR循環(huán)可以為30～38個(gè)循環(huán)，也可以為31～34個(gè)循環(huán)；所述的PCR退火溫度可以為50℃～56℃，也可以為51℃～54℃；所述的的瓊脂糖濃度可以為0.8％～2％，也可以為0.9％～1.2％。
本發(fā)明的有益效果是將免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，可應(yīng)用于感病植株低濃度病毒的檢測(cè)。一方面節(jié)省了普通RT-PCR中提取總RNA的煩瑣步驟，降低了檢測(cè)成本；另一方面由于抗體與抗原的特異性結(jié)合，提高了檢測(cè)的特異性。同時(shí)可以直接從病毒汁液中捕獲病毒粒子，起到濃縮和純化病毒的作用，又利用PCR技術(shù)放大了檢測(cè)的靈敏度，能有效的防止病毒漏檢的情況。此外，利用免疫捕獲PCR還可以避免雙子葉植物中多糖和酚類(lèi)對(duì)RT-PCR的干擾，降低漏檢發(fā)生的幾率。
圖1是檢測(cè)木本植物月季上的李壞死環(huán)斑病毒的電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一以已知的感染了李壞死環(huán)斑病毒的月季葉片為材料，分別用本方法和普通RT-PCR方法對(duì)李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行檢測(cè)，以健康月季葉片為陰性對(duì)照，且設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
1.設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的引物
2.免疫捕獲1)取100mg感病組織，加1mL研磨緩沖液充分研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中，4000rpm離心4min，上清液即為病組織粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被緩沖液稀釋200倍的李壞死環(huán)斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃過(guò)夜；3)棄PCR管中包被液，用PBST洗滌3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃過(guò)夜；4)用PBST洗滌PCR管3次，ddH2O洗滌1次，低速離心15sec，棄殘余液體；3.RT-PCR1)在包被過(guò)的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，輕微振蕩混勻后于70℃溫育10min，之后迅速置冰浴5min；2)反轉(zhuǎn)錄向上述PCR管中按以下體系加入試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表體系加入各試劑
設(shè)置PCR程序?yàn)?4℃4min，94℃1min、50℃1min、72℃2min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4.電泳檢測(cè)配制0.8％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5.結(jié)果分析用本方法檢測(cè)李壞死環(huán)狀病毒，在凝膠上存在483bp的核酸條帶，條帶清晰特異，與陽(yáng)性對(duì)照的條帶大小一致，說(shuō)明本方法可以用于李壞死環(huán)斑病毒的檢測(cè)；陰性對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到任何核酸條帶，說(shuō)明陰性對(duì)照中不含李壞死環(huán)斑病毒。用普通的RT-PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有時(shí)可以檢測(cè)到483bp的核酸條帶，但是條帶亮度微弱，有時(shí)則不能檢測(cè)到核酸條帶，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。
實(shí)施例二以已知的感染了李壞死環(huán)斑病毒的月季葉片為材料，分別用本方法和普通RT-PCR方法對(duì)李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行檢測(cè)，以健康月季葉片為陰性對(duì)照，且設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
1.設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的引物
2.免疫捕獲1)取100mg感病組織，加1mL研磨緩沖液充分研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中，4000rpm離心4min，上清液即為病組織粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被緩沖液稀釋200倍的李壞死環(huán)斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃過(guò)夜；3)棄PCR管中包被液，用PBST洗滌3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃過(guò)夜；4)用PBST洗滌PCR管3次，ddH2O洗滌1次，低速離心15sec，棄殘余液體；3.RT-PCR1)在包被過(guò)的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，輕微振蕩混勻后于70℃溫育10min，之后迅速冰浴5min；2)反轉(zhuǎn)錄向上述PCR管中按以下體系加入試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表體系加入各試劑
設(shè)置PCR程序?yàn)?4℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃2min，擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4.電泳檢測(cè)配制2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5.結(jié)果分析用本方法檢測(cè)李壞死環(huán)狀病毒，在凝膠上存在483bp的核酸條帶，條帶清晰特異，與陽(yáng)性對(duì)照的條帶大小一致，說(shuō)明本方法可以用于PNRSV的檢測(cè)；陰性對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到任何核酸條帶，說(shuō)明陰性對(duì)照中不含PNRSV。用普通的RT-PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有時(shí)可以檢測(cè)到483bp的核酸條帶，但是條帶亮度微弱，有時(shí)則不能檢測(cè)到核酸條帶，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。
實(shí)施例三以已知的感染了李壞死環(huán)狀病毒的月季葉片為材料，分別用本方法和普通RT-PCR方法對(duì)李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行檢測(cè)，以健康月季葉片為陰性對(duì)照，且設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
1.設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的引物
2.免疫捕獲1)取100mg感病組織，加1mL研磨緩沖液充分研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中，4000rpm離心4min，上清液即為病組織粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被緩沖液稀釋200倍的李壞死環(huán)斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃過(guò)夜；3)棄PCR管中包被液，用PBST洗滌3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃過(guò)夜；4)用PBST洗滌PCR管3次，ddH2O洗滌1次，低速離心15sec，棄殘余液體；3.RT-PCR1)在包被過(guò)的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，輕微振蕩混勻后于70℃溫育10min，之后迅速冰浴5min；2)反轉(zhuǎn)錄向上述PCR管中按以下體系加入試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表體系加入各試劑
設(shè)置PCR程序?yàn)?4℃4min，94℃1min、53℃1min、72℃2min，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4.電泳檢測(cè)配制1％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5.結(jié)果分析用本方法檢測(cè)李壞死環(huán)狀病毒，在凝膠上存在483bp的核酸條帶，條帶清晰特異，與陽(yáng)性對(duì)照的條帶大小一致，說(shuō)明本方法可以用于PNRSV的檢測(cè)；陰性對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到任何核酸條帶，說(shuō)明陰性對(duì)照中不含PNRSV。用普通的RT-PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有時(shí)可以檢測(cè)到483bp的核酸條帶，但是條帶亮度微弱，有時(shí)則不能檢測(cè)到核酸條帶，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。
利用該方法在不同反應(yīng)條件下對(duì)植物中李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行檢測(cè)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，通過(guò)本方法均能從含有李壞死環(huán)斑病毒的植株中特異的擴(kuò)增出483bp的核酸條帶，而且陰性對(duì)照無(wú)非特異性結(jié)果發(fā)生。并且相比普通RT-PCR，本方法檢測(cè)的靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性好，很少出現(xiàn)漏檢的情況。因此該方法可以被應(yīng)用于植物上發(fā)生的李壞死環(huán)斑病毒的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法，其步驟如下1)設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的引物
2)免疫捕獲(a)取100mg感病組織，加1mL研磨緩沖液充分研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，4000rpm離心4min，上清液即為病組織粗汁液；(b)0.5mL PCR管中加入150μL以包被緩沖液稀釋200倍的李壞死環(huán)斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃過(guò)夜；(c)棄去包被液，用PBST洗滌3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃過(guò)夜；(d)用PBST洗滌PCR管3次，ddH2O洗滌1次，低速離心15sec，棄殘余液體；3)RT-PCR(a)在包被過(guò)的PCR管中加入下游引物PNRSV-R1μL，9.5μL ddH2O，輕微振蕩混勻后于70℃溫育10min，之后迅速冰浴5min；(b)反轉(zhuǎn)錄向上述PCR管中按以下體系加入試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新的PCR管，按下表體系加入各試劑
設(shè)置PCR程序?yàn)?4℃4min，94℃1min、50℃～56℃1min、72℃2min，擴(kuò)增30～38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測(cè)配制0.8％～2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)結(jié)果分析根據(jù)電泳膠上擴(kuò)增條帶的有無(wú)及其大小判定所檢測(cè)的植物中是否感染李壞死環(huán)斑病毒，即如果凝膠中存在483bp的核酸片段則說(shuō)明樣品中含有李壞死環(huán)斑病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法，其特征是退火溫度為51℃～54℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法，其特征是擴(kuò)增31～34個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒的方法，其特征是配制的瓊脂糖凝膠的濃度為0.9％～1.2％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)李壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。其方案是，通過(guò)抗體特異捕獲抗原、RT－PCR以及電泳檢測(cè)等步驟，對(duì)植物中感染的李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測(cè)。該方法除了具有普通RT－PCR所具有的快速、特異的優(yōu)點(diǎn)外，主要是實(shí)現(xiàn)了血清學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，先通過(guò)病毒抗體對(duì)抗原病毒的特異吸附，將植物中低濃度的病毒進(jìn)行富集，再通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從而使檢測(cè)的靈敏度和特異性得到極大的提高，并降低了病毒的漏檢率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1824800SQ20051004877
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者李凡, 陳精蘭, 陳海如, 李正躍, 孫健, 王鈺麗, 劉云龍, 范靜華, 王揚(yáng), 姬廣海, 孔寶華, 蔡紅, 楊斌, 蔣小龍, 白松 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)