專利名稱：腸出血性大腸桿菌o157核酸檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸出血性大腸桿菌的檢測(cè)，尤其是涉及一種采用等長(zhǎng)雙鏈熒光探針技術(shù)對(duì)腸出血性大腸桿菌0157進(jìn)行檢測(cè)的方法及其檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌0157(E.coli 0157)是致瀉性大腸桿菌的一種主要的血清型，它可引起出血性腸炎，伴有劇烈腹痛、發(fā)熱，嚴(yán)重的可造成腎功能不全、溶血性尿毒綜合癥(HUS)、溶血性貧血、血小板減少性紫癜，甚至因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。E.coli 0157引發(fā)的食物中毒在美國(guó)、日本、英國(guó)、加拿大、澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家接連不斷發(fā)生。1993年，美國(guó)發(fā)生了一次涉及到4個(gè)州700余名兒童感染的暴發(fā)流行，其中51例發(fā)生了溶血性尿毒綜合癥(HUS)，4例死亡，至1995年底，美國(guó)共暴發(fā)流行近50起，每年約2萬(wàn)人感染。特別是1996年5～8月份，日本發(fā)生由0157污染蘿卜苗及牛肉而導(dǎo)致的集體食物中毒事件，波及東京、大阪、京都等40多個(gè)都府縣，患者累計(jì)達(dá)9000余人，7人死亡。我國(guó)于1987年首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到0157型大腸桿菌，目前尚未發(fā)現(xiàn)暴發(fā)流行，但多次于山東、江蘇、河北、河南等地的腹瀉患者中檢測(cè)出0157。因此對(duì)于E.coli 0157的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)對(duì)于我國(guó)人民的飲食衛(wèi)生安全具有重要意義。
傳統(tǒng)的病原微生物分離、培養(yǎng)與鑒定需時(shí)較長(zhǎng)，難以適應(yīng)E.coli 0157流行時(shí)診斷、治療的需要，其鑒定慢、靈敏度低的缺點(diǎn)向微生物檢驗(yàn)提出了更高的要求——更準(zhǔn)確、更快速、更安全地檢出與監(jiān)測(cè)病原體。雖然各類PCR技術(shù)的應(yīng)用已明顯加快了微生物檢驗(yàn)的速度，但是由于PCR過(guò)程中操作易造成污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果和樣品中PCR抑制物的存在而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，這又限制了PCR技術(shù)對(duì)E.coli 0157檢測(cè)的應(yīng)用。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的產(chǎn)生不但很好地解決了PCR的定量問(wèn)題，同時(shí)其閉管操作、實(shí)時(shí)檢測(cè)解決了PCR產(chǎn)物瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳等后續(xù)工作，簡(jiǎn)化了步驟，很好地避免了PCR產(chǎn)物的交叉污染，提高了檢測(cè)的特異性。
目前，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)腸出血性大腸桿菌0157進(jìn)行檢測(cè)有分子信標(biāo)(NathalieY.Fortin，Ashok Mulchandani，and Wilfred Chen.Use of Real-time Polymerase ChainReaction and Molecular Beacons for the detection of Escherichia coli0157H7.Analytical Biochemiotry.2001，289281-288)和Taqman探針(A.Mark Ibckwc，Pamela M.Watt，Catherine M.Grieve，Vijay K.Sharma，and Steven R.Lyons.MultiplexFluorogenic Real-time PCR for Detection and Quantification of Escherichia coli0157H7 in Dairy Wastewater Wetlands.Applied And Environmental Microbiology.2002，4853-4862；Vijay K.Sharma，Evelyn A.Dean-Nystrom.Detection of enterohemorrhagicEscherichia coli 0157H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encodingintimin and Shiga toxins.Veterinary Microbiology.2003，93247-260)等。探針的識(shí)別增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的可靠性，但是存在探針和實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過(guò)于復(fù)雜和實(shí)驗(yàn)成本過(guò)高的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)行的E.coli 0157檢測(cè)方法鑒定慢，靈敏度低，特異性差，難以適應(yīng)流行時(shí)診斷、治療的問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)可靠性高、可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)、靈敏度高、特異性好、周期短的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法及其試劑盒。為此，本發(fā)明采用等長(zhǎng)雙鏈熒光探針進(jìn)行核酸檢測(cè)的技術(shù)方案。
本發(fā)明所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法如下1)將腸出血性大腸桿菌0157特有的保守序列作為待測(cè)靶基因，長(zhǎng)度為100-350bp，優(yōu)選100-250bp。
2)根據(jù)待測(cè)靶基因合成一對(duì)與待測(cè)靶基因相應(yīng)的特異性引物，引物長(zhǎng)度為18-30bp，退火溫度為45-60℃，優(yōu)選50℃。
3)根據(jù)待測(cè)靶序列中位于兩個(gè)引物之間的序列合成一對(duì)等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，具體要求如下a.所說(shuō)的一對(duì)等長(zhǎng)雙鏈特開(kāi)性探針的長(zhǎng)度為18-30bp，探針的退火溫度為50-70℃；b.標(biāo)記熒光劑的鏈與待測(cè)靶基因序列完全匹配，另一條鏈標(biāo)記淬滅劑；c.兩條鏈的3’端封閉；d.兩條鏈的一個(gè)末端存在堿基完全不匹配，不匹配的堿基長(zhǎng)度為2-10bp，優(yōu)選5bp。
4)使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)溶液混合物，所說(shuō)的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說(shuō)的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說(shuō)的探針為熒光劑標(biāo)記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標(biāo)記探針0.06-0.36μM。
5.陽(yáng)性對(duì)照模板包含待測(cè)靶基因的被檢測(cè)DNA。
6.陰性對(duì)照模板滅菌后的無(wú)離子水。
7.實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件最好為 在步驟1)中，所說(shuō)的序列優(yōu)選如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT長(zhǎng)度為142bp。
另外，腸出血性大腸桿菌0157特異性引物的反應(yīng)濃度優(yōu)選0.4μM。
在步驟2)中，所說(shuō)的引物優(yōu)選如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃在步驟3)中，所說(shuō)的探針的序列優(yōu)選為與靶基因完全匹配鏈(標(biāo)記熒光劑)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互補(bǔ)鏈(標(biāo)記淬滅劑)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃另外，等長(zhǎng)雙鏈熒光探針與靶基因完全匹配鏈的5’端用FAM熒光劑標(biāo)記，3’端磷酸化封閉；另一條鏈的3’端用Dabcyl粹滅劑封閉，與熒光劑標(biāo)記的鏈有5個(gè)堿基不互補(bǔ)與靶基因完全匹配鏈FAM-5‘-GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA-3’-phosphorylation不完全互補(bǔ)鏈5‘-ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC-3’-Dabcyl在步驟4)中，混合物中MgCl2的濃度優(yōu)選2.5mM，dNTPs的濃度優(yōu)選0.25mM，Taq酶的濃度優(yōu)選1.8U。
本發(fā)明所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157的等長(zhǎng)雙鏈探針核酸檢測(cè)試劑盒設(shè)有盒體、盒蓋，在盒體里設(shè)有墊體，墊體上設(shè)有至少可分別隔離放置4個(gè)Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對(duì)照模板、陽(yáng)性對(duì)照模板和混合物的空腔，所說(shuō)的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物和探針。
試劑盒檢測(cè)溶液最好保存于-20℃冰箱。
與已有的E.coli 0157檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)檢測(cè)方法鑒定方法快，實(shí)用性好，可以直接取菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR核酸檢測(cè)，省去了分離、培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA的過(guò)程，可以快速完成對(duì)于E coli 0157的檢測(cè)，提高檢測(cè)的效率，操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)可靠性高，周期短。
2)特異性好，應(yīng)用特異的上下游引物擴(kuò)增目的片斷，再通過(guò)高度特異的等長(zhǎng)雙鏈探針進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，對(duì)于0157的檢測(cè)可以達(dá)到95％以上，可適應(yīng)流行時(shí)的診斷與治療問(wèn)題。
3)靈敏度高當(dāng)從濃度約為1.49×103CFU/ml樣品中取1μl，應(yīng)用試劑盒即可以檢測(cè)出陽(yáng)性的結(jié)果。


圖1為等長(zhǎng)熒光探針對(duì)不同來(lái)源(樣品來(lái)源于污染的水、食品、人畜糞便等)0157的檢測(cè)結(jié)果。
圖2為等長(zhǎng)熒光探針對(duì)0157、志賀氏菌、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果。
圖3為等長(zhǎng)熒光探針對(duì)不同濃度梯度0157的檢測(cè)結(jié)果。在圖3中，曲線1，2，3，4代表樣品濃度分別為1.49×106，1.49×105，1.49×104，1.49×103 CFU/ml，曲線5為空白對(duì)照，曲線6為陰性對(duì)照模板。
在圖1-3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的熒光值。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所說(shuō)的腸出血性大腸桿菌0157的等長(zhǎng)雙鏈探針核酸檢測(cè)試劑盒設(shè)有盒體、盒蓋，在盒體里設(shè)有墊體，墊體上設(shè)有至少可分別隔離放置4個(gè)Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對(duì)照模板、陽(yáng)性對(duì)照模板和混合物的空腔，所說(shuō)的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物、探針。試劑盒檢測(cè)溶液最好保存于-20℃冰箱，其保持期可達(dá)1年。
實(shí)施例1等長(zhǎng)熒光探針對(duì)0157的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)取1μl樣品加入到檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)溶液Mixs中，終體積為20μl。實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)程序?yàn)镻CR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性3min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)，[Gain Fam]＝9。熒光信號(hào)強(qiáng)度在退火階段采集。
實(shí)施例2等長(zhǎng)熒光探針對(duì)不同來(lái)源0157的檢測(cè)(樣品來(lái)源于污染的水，食品，人畜糞便等)
分別取不同樣品各1μl加入檢測(cè)溶液，按照實(shí)施程序的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，不同樣品的熒光強(qiáng)度有不同高度的升起，代表了陽(yáng)性結(jié)果。(參見(jiàn)圖1)實(shí)施例3等長(zhǎng)熒光探針對(duì)0157，志賀氏菌，侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，沙門氏菌的檢測(cè)分別取0157，志賀氏菌，侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，沙門氏菌樣品各1μl加入檢測(cè)溶液，按照實(shí)施程序的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，熒光強(qiáng)度有升起，代表了陽(yáng)性結(jié)果.(參見(jiàn)圖2)實(shí)施例4等長(zhǎng)熒光探針對(duì)不同濃度梯度0157的檢測(cè)將已知濃度的陽(yáng)性樣品按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等梯度稀釋，分別取各個(gè)梯度的樣品1μl加入檢測(cè)溶液，按照實(shí)施程序的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，不同梯度的樣品的熒光強(qiáng)度在不同的循環(huán)數(shù)升起。由此可以判斷試劑盒的靈敏度。1.49×102到1.49×106做梯度檢測(cè)，可以從濃度為1.49×103CFU/ml的樣品中取1μl即可檢測(cè)出陽(yáng)性。(參見(jiàn)圖3)
權(quán)利要求
1.腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于其步驟為1)將腸出血性大腸桿菌0157特有的保守序列作為待測(cè)靶基因，長(zhǎng)度為100-350bp；2)根據(jù)待測(cè)靶基因合成一對(duì)與待測(cè)靶基因相應(yīng)的特異性引物，引物長(zhǎng)度為18-30bp，退火溫度為45-60℃；3)根據(jù)待測(cè)靶序列中位于兩個(gè)引物之間的序列合成一對(duì)等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，具體要求如下a.所說(shuō)的一對(duì)等長(zhǎng)雙鏈特異性探針的長(zhǎng)度為18-30bp，探針的退火溫度為50-70℃；b.標(biāo)記熒光劑的鏈與待測(cè)靶基因序列完全匹配，另一條鏈標(biāo)記淬滅劑；c.兩條鏈的3’端封閉；d.兩條鏈的一個(gè)末端存在堿基完全不匹配，不匹配的堿基長(zhǎng)度為2-10bp；4)使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)溶液混合物，所說(shuō)的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說(shuō)的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說(shuō)的探針為熒光劑標(biāo)記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標(biāo)記探針0.06-0.36μM；5)陽(yáng)性對(duì)照模板包含待測(cè)靶基因的被檢測(cè)DNA；6)陰性對(duì)照模板滅菌后的無(wú)離子水；7)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件
2.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟1)中，所說(shuō)的特有的保守序列長(zhǎng)度為100-250bp。
3.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟1)中，所說(shuō)的序列優(yōu)選如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT長(zhǎng)度為142bp。
4.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟1)中，腸出血性大腸桿菌0157特異性引物的反應(yīng)濃度優(yōu)選0.4μM。
5.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所說(shuō)的退火溫度為50℃。
6.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所說(shuō)的引物優(yōu)選如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃
7.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟3)中，所說(shuō)的不匹配的堿基長(zhǎng)度為5bp；所說(shuō)的探針的序列優(yōu)選為與靶基因完全匹配鏈(標(biāo)記熒光劑)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互補(bǔ)鏈(標(biāo)記淬滅劑)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃等長(zhǎng)雙鏈熒光探針與靶基因完全匹配鏈的5’端用FAM熒光劑標(biāo)記，3’端磷酸化封閉；另一條鏈的3’端用Dabcyl粹滅劑封閉，與熒光劑標(biāo)記的鏈有5個(gè)堿基不互補(bǔ)。
8.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟4)中，使用步驟2)中的上、下游引物和步驟3)中的探針及其它PCR成份組成熒光PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)溶液混合物，所說(shuō)的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR緩沖液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所說(shuō)的上下游引物各為0.2-0.6μM，所說(shuō)的探針為熒光劑標(biāo)記探針0.05-0.3μM，粹滅劑標(biāo)記探針0.06-0.36μM。
9.如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157核酸檢測(cè)方法，其特征在于在步驟4)中，混合物中MgCl2的濃度優(yōu)選2.5mM，dNTPs的濃度優(yōu)選0.25mM，Taq酶的濃度優(yōu)選1.8U。
10.腸出血性大腸桿菌0157的等長(zhǎng)雙鏈探針核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、盒蓋，在盒體里設(shè)有墊體，墊體上設(shè)有至少分別隔離放置4個(gè)Effendorf管，分別裝有Taq酶、陰性對(duì)照模板、陽(yáng)性對(duì)照模板和混合物的空腔，所說(shuō)的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR緩沖液、引物、探針。
全文摘要
腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測(cè)方法及其試劑盒，涉及一種采用等長(zhǎng)雙鏈熒光探針技術(shù)對(duì)腸出血性大腸桿菌O157進(jìn)行檢測(cè)的方法及其試劑盒。提供一種操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)可靠性高、可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)、靈敏度高、特異性好、周期短的腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測(cè)方法及其試劑盒。其步驟為將腸出血性大腸桿菌O157特有的保守序列作為待測(cè)靶基因；根據(jù)待測(cè)靶基因合成一對(duì)特異性引物；合成一對(duì)等長(zhǎng)雙鏈特異性探針；組成熒光PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)溶液混合物；陽(yáng)性對(duì)照模板包含待測(cè)靶基因的被檢測(cè)DNA；陰性對(duì)照模板滅菌后的無(wú)離子水。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1680602SQ20051005231
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者陳亮, 于廣福, 邵寒娟, 牛建軍 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)