專利名稱：利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的唐古特莨菪的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，為一種利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的唐古特莨菪的方法，具體涉及目的基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建、獲得托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪的具體過程。本發(fā)明還提供利用基因工程獲得的托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪及其培養(yǎng)的子代、再生植株、植物組織或種子。
背景技術(shù)：
唐古特莨菪是西藏民間發(fā)掘出來的鎮(zhèn)痛草藥，為茄科山莨菪屬植物，是產(chǎn)生托品烷類生物堿的基源植物和重要來源。托品烷類生物堿的生物合成途徑已經(jīng)闡明，編碼限速酶的基因已經(jīng)克隆，其中氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶是該途徑上最重要的限速酶。已經(jīng)有研究報(bào)道，在莨菪發(fā)根中過量表達(dá)來源于黑莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因，使得東莨菪堿的含量比原始材料提高了9倍。但是基于莨菪的發(fā)根要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐還不現(xiàn)實(shí)，真正有效的方法是利用基因工程技術(shù)培育遺傳改良的托品烷類生物堿高產(chǎn)的植物。然而到目前為止，還未見利用基因工程方法獲得托品烷類生物堿高產(chǎn)植物的報(bào)道。
本方面采用基因工程方法在唐古特莨菪過量表達(dá)來源于唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因，從而達(dá)到打破唐古特莨菪中托品烷類生物堿生物途徑上的限速反應(yīng)，最終培育出托品烷類生物堿高產(chǎn)的唐古特莨菪。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種利用基因工程技術(shù)遺傳改良唐古特莨菪的方法，該方法將轉(zhuǎn)移唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)到托品烷類生物堿的基源植物唐古特莨菪中高效表達(dá)，從而提高唐古特茛菪中托品烷類生物堿的合成能力。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種植物表達(dá)載體，它包含上述唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是唐古特莨菪。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離出的兩條DNA分子一條是唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因的編碼區(qū)，用引物fpmt5’-ccagatctATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3’和rpmt5’-ccggtcaccTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’可以從唐古特莨菪中擴(kuò)增出來；另一條是唐古特莨菪的莨菪堿-6-羥化酶基因的編碼區(qū)，用引物f6h5’-ccggatccATGGCTACTCTTGTCTCCAAC-3’和rh6h5’-ccgagctcTTAGGCATTGATTTTATAAGGC-3’可以從唐古特莨菪中擴(kuò)增出來。
一種利用基因工程技術(shù)提高唐古特莨菪中托品烷類生物堿含量的方法，特征在于利用攜帶唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的植物表達(dá)載體，采用任何轉(zhuǎn)基因方法在唐古特莨菪細(xì)胞、組織、器官、植株中過量表達(dá)氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶，從而提高唐古特莨菪中托品烷類生物堿生物合成能力。其步驟如下(1)采用基因克隆的方法獲得唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)；(2)把唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成植物表達(dá)載體；(3)獲得唐古特莨菪的無菌外植體；(4)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)到唐古特莨菪細(xì)胞、組織、器官、植株中；(5)在特定的條件下篩選和鑒定唐古特莨菪轉(zhuǎn)化子；
(6)在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的唐古特莨菪，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明涉及的植物表達(dá)載體包含唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是轉(zhuǎn)基因的唐古特莨菪的細(xì)胞、組織、器官、植株，導(dǎo)入了在CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)，其氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶表達(dá)水平得到大大提高，托品烷類生物堿合成能力得到大大提高，托品烷類生物堿含量液得到大大提高。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術(shù)語“生命體”指唐古特莨菪的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語“托品烷類生物堿”包括莨菪堿和東莨菪堿。
在本發(fā)明中，術(shù)語“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、如PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在特定的條件下篩選和鑒定唐古特莨菪轉(zhuǎn)化子”是指在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的唐古特莨菪的轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定唐古特莨菪的轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的唐古特茛菪，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對(duì)經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測(cè)氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因的表達(dá)水平，篩選托品烷類生物堿高產(chǎn)的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
在本發(fā)明中，我們從唐古特莨菪中克隆氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因的編碼區(qū)，并構(gòu)建了植物高效反義表達(dá)載體，并遺傳轉(zhuǎn)化唐古特莨菪，以打破唐古特莨菪中托品烷類生物堿生物合成途徑中的限速反應(yīng)步驟，從而提高托品烷類生物堿的生成能力，然后篩選獲得托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪進(jìn)行培養(yǎng)，并獲得轉(zhuǎn)基因后代。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的克隆根據(jù)唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(GenBank登錄號(hào)AY690623)和莨菪堿-6-羥化酶基因(GenBank登錄號(hào)AY356396)的全長序列，并根據(jù)植物雙元載體pCAMBIA1304(由澳大利亞CAMBIATM組織提供)和pBI121(Jefferson等，EMBO Journal 1987，63901-3907)的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)攜帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的基因特異性引物分別擴(kuò)增目的基因的編碼區(qū)，用于構(gòu)建植物表達(dá)載體。
克隆唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的引物為fpmt5’-ccagatctATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3’(作為上游引物，攜帶Bgl II酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rpmt5’-ccggtcaccTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’(作為下游引物，攜帶BstE II酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)。
克隆唐古特莨菪莨菪堿-6-羥化酶基因的引物為fh6h5’-ccggatccATGGCTACTCTTGTCTCCAAC-3’(作為上游引物，攜帶BamHI酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rh6ht5’-ccgagctcTTAGGCATTGATTTTATAAGGC-3’(作為下游引物，攜帶Sac I酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)。
從唐古特莨菪(西藏農(nóng)牧學(xué)院藏藥種植園)葉片中提總RNA(上海華舜生物工程有限公司的RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50ul，包含去離子水，10×PCR buffer5ul，dNTP 1ul，MgCl23ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul。PCR條件為94℃3分鐘，隨之以94℃45秒、58℃45秒、和72℃2分鐘進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸8分鐘。1％瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增目的基因。
電泳分離后，回收(賽百勝PCR產(chǎn)物回收試劑盒)PCR產(chǎn)物，取適量回收產(chǎn)物與PMD 18-T easy Vector載體(大連寶生物)連接(TaKaRa PMD 18-TVector試劑盒)后轉(zhuǎn)入DH5α，LB+氨芐青霉素(100mg/l)固體培養(yǎng)基上抗性篩選陽性克隆，PCR鑒定后送測(cè)序(賽百勝公司完成)。
實(shí)施例2構(gòu)建攜帶唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的植物表達(dá)載體選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構(gòu)建雙元三價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+(p1304+)。構(gòu)建流程如下1)HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；2)回收pBI121表達(dá)盒，回收pCAMBIA1304大片段；3)連接這兩個(gè)回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α，在卡那霉素LB平板上篩選得到單克隆，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，HindIII和EcoRI雙酶切驗(yàn)證；即構(gòu)建好p1304+。
將經(jīng)過測(cè)序正確后的攜帶目的基因的DH5α(已經(jīng)轉(zhuǎn)入唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)或莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū))分別搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒；用Bgl II及BstE II雙酶切攜帶唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的PMD 18-T easy Vector載體，1％瓊脂糖電泳后回收小片段；用Bam HI及sac I雙酶切攜帶唐古特莨菪莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的PMD18-T easy Vector載體，1％瓊脂糖電泳后回收小片段。
將構(gòu)建好p1304+用Bgl II及BstE II雙酶切后回收大片斷，并與從PMD18-T easy Vector載體上用Bgl II及BstE II雙酶切切下的唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Kan(100mg/l)固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得攜帶唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的重組質(zhì)粒并命名為p1304+-atpmt。
將構(gòu)建好p1304+-atpmt用Bam HI及Sac I雙酶切后回收大片斷，并與從PMD 18-T easy Vector載體上用Bam HI及Sacc I雙酶切切下的唐古特莨菪菪莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Kan(100mg/l)固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得攜帶唐古特茛菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和菪莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的重組質(zhì)粒并命名為p1304+-atpmt-ath6h。(該質(zhì)粒的獲得依據(jù)上述制備方法是否是可以重復(fù)得道的，如果不是，該重組質(zhì)粒需要提供保藏，)該質(zhì)?？梢詫?dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或者EHA105，獲得工程菌，命名為LBA4404-atpmt-ath6h或EHA105-atpmt-ath6h，可用于對(duì)唐古特莨菪的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3唐古特莨菪無菌外植體的獲得方法一利用外植體建立唐古特莨菪無菌外植體采取唐古特莨菪幼芽和幼莖，流水沖洗1小時(shí)；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在添加無菌叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長調(diào)節(jié)物1.25mg/L BA(芐基腺嘌呤)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)唐古特莨菪的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為55μmol.m-2.s-1。40天后，即可獲得無菌的唐古特莨菪無菌外植體，等到葉片長到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
方法二利用唐古特莨菪種子在無菌條件下萌發(fā)獲得無菌外植體采取唐古特莨菪成熟的種子，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡30分鐘，用無菌水沖洗6次；在無菌條件下去除其種皮；將唐古特莨菪胚接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)唐古特莨菪的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動(dòng)后，改變培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為25μmol.m-2.s-1。等到葉片長到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例4根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化唐古特莨菪獲得轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪1、根癌農(nóng)桿菌LBA4404-atpmt-ath6h、EHA105-atpmt-ath6h(按照實(shí)施范例2的方法獲得，申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室保存，西南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)。使用前自冰箱取出，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)(添加卡那霉素達(dá)到終濃度為100mg/L)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次；2、第二次活化OD600達(dá)0.3時(shí)，加100μmol/mL乙酰丁香酮，繼續(xù)28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，OD600達(dá)0.6時(shí)，室溫下4000rpm離心10分鐘；3、棄上清，菌體用MS液體培養(yǎng)基(100μmol/mL乙酰丁香酮)懸浮，稀釋到原體積的5倍，在28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，使菌液濃度達(dá)到的OD600＝0.3左右；稱轉(zhuǎn)化液；可用于唐古特莨菪的遺傳轉(zhuǎn)化；1、2、3個(gè)步驟稱為活化根癌農(nóng)桿菌；4、取無菌唐古特莨菪頂芽、側(cè)芽、莖等植物不同部位，將莖切成1cm小段，或?qū)⑷~片切成2cm2左右，用無菌的解剖刀劃以“+”字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，侵染10分鐘后取出，用無菌衛(wèi)生紙吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。
5、共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至添加1.25mg/L BA的MS固體培養(yǎng)基(添加250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪叢生芽)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為55μmol.m-2.s-1。40天后，獲得新生的唐古特莨菪叢生芽。
6、待從唐古特莨菪轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的叢生芽長到1cm左右是，分別切下單個(gè)的叢生芽，接種在無植物生長調(diào)節(jié)物的MS固體培養(yǎng)基上(添加250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因唐古特茛菪叢生芽)繼代培養(yǎng)；在該培養(yǎng)基上生長正常的唐古特莨菪叢生芽即為轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪。以后每25天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去除干凈。然后僅在添加0.25mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基上生根即可。轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪煉苗1周后，即可移栽。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪的分子檢測(cè)1、唐古特莨菪基因組DNA的提取，方法如下1)取少量唐古特莨菪，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。
2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其間經(jīng)常顛倒混勻；3)12000rpm，室溫離心10分鐘；4)取上清液，加500ul飽和酚[Tris-HCl(pH8.0)飽和，吸取下層]，輕輕混勻，4℃靜置5分鐘至分層；5)12000rpm，室溫離心10min；6)吸上清(約250微升)，加2倍體積的無水乙醇(-20℃儲(chǔ)存)，充分混勻，室溫靜置至DNA析出；7)8000rpm，4℃離心5分鐘；8)用75％的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置，使乙醇揮發(fā)完全。
9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小時(shí)。
10)加40ul氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。
11)12000rpm，室溫離心10分鐘。
12)吸取上清(約35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR檢測(cè)。
抽提緩沖液配方如下100mM Tris-HCl(pH8.0)2.5％(v/v) 巰基乙醇500mM NaCl20mM EDTA1.5％(w/v) SDS
2、轉(zhuǎn)基因唐古特茛菪的PCR檢測(cè)，方法如下由于所用的目的基因莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和菪莨菪堿-6-羥化酶基因都源于唐古特茛菪自身，不可能用PCR直接檢測(cè)。由于這兩個(gè)基因在p4上是和潮霉素抗性基因在同一個(gè)邊界內(nèi)，因而可以在轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪中DNA中檢測(cè)潮霉素抗性基因以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子。潮霉素抗性基因(812bp)的檢測(cè)使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG’-3)。PCR程序?yàn)?4℃變性5min→30個(gè)循環(huán)(94℃50sec→58℃50sec→72℃1min)→72℃6min。
陽性對(duì)照為p1304+-atpmt-ath6h作為模板擴(kuò)增，陰性對(duì)照為唐古特莨菪的天然葉片DNA作為模板擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)。
實(shí)施例6東莨菪堿高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪的獲得以分子檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪為材料，采用Northern雜交檢測(cè)目的基因，即abpmt和abh6h的表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，Northern雜交檢測(cè)目的基因表達(dá)水平方法如下①探針的制備與標(biāo)記以測(cè)序驗(yàn)證的目的基因作為模板，采用與目的目的基因克隆時(shí)相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增探針。使用Amersham Pharmacia公司GeneImagesTMContents CDP-StarTM labelling module，RPN3540)，按照試劑盒所附說明書進(jìn)行操作。用DD水或TE稀釋模板(DNA或RNA)濃度至2-25ng/ul；模板一般來自PCR產(chǎn)物，或酶切產(chǎn)物，回收產(chǎn)物取5ul上樣電泳，如果清晰可見，標(biāo)記探針應(yīng)該沒有任何問題。在沸水浴中變性DNA模板10分鐘，體積至少要20ul，立即冰浴(放入冰盒中)。在離心管中加入如下試劑10ul Nucleotidemix；5ul Primer；50ng變性DNA模板；1ul Klenow酶(5U/ul)；補(bǔ)足水至50ul；溫柔混勻，稍稍離心，37度過夜；用2μl EDTA(0.5M pH＝8.0)之后在2×SSC的溶液中于65℃沖洗帶有探針的尼龍膜15分鐘，紫燈外下觀察探針是否標(biāo)記上；-20℃避光保存探針備用；
②配制瓊脂糖甲醛變性凝膠于一支180℃干烤2h的三角瓶中加入37.5mLDEPC處理過的水；7.5mL 10×MOPS；0.55g RNase-free的低熔點(diǎn)瓊脂糖；總體積45mL；于微波爐中化膠，冷至60℃時(shí)加入10mL甲醛，混勻后待冷至45℃左右倒膠，插上3mm梳子，凝膠冷后備用；③RNA變性樣品的制備和電泳提取轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪葉總RNA；事先采用乙醇沉淀法將RNA樣品濃縮至3μg/μL以上，并計(jì)算出每個(gè)樣品所需RNA的μL數(shù)，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的RNase-free的500μL Eppendorf管，編號(hào)后分別加入30μg總RNA；7μL甲醛；20μL去離子甲酰胺；2μL 10×MOPS；DEPC處理過的水補(bǔ)足至40μL；混勻后于65℃變性10min，冰上急冷，加入微量溴乙錠和6μL RNase-free的上樣buffer，立即上樣，在1×MOPS緩沖液中于1v.cm-l電泳，待溴酚蘭遷移至凝膠的一半距離時(shí)轉(zhuǎn)膜；④Northern凝膠轉(zhuǎn)膜、固定和雜交檢測(cè)1)電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體，切下左上角作為標(biāo)記；2)凝膠用DEPC處理過的水稍事清洗；3)同Southern雜交一樣，采用DEPC處理過的20×SSC轉(zhuǎn)膜；4)同Southern雜交一樣，在RNase-free的環(huán)境下預(yù)雜交、雜交(同Southern雜交，僅雜交溫度變?yōu)?5℃)和洗片；⑤最后根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱區(qū)分基因表達(dá)的強(qiáng)弱，選出高表達(dá)的株系作進(jìn)一步的分析；實(shí)施例7野生型唐古特莨菪和轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪中莨菪堿和東莨菪堿的含量比較莨菪堿和東茛菪堿含量測(cè)定參照Hashimoto等人建立的方法(1993年)。結(jié)果為莨菪堿在野生型唐古特莨菪主根、葉和莖中的含量分別為10.0mg/g(干重)、3.0mg/g(干重)、0.6mg/g(干重)；莨菪堿在轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪主根、葉和莖中的含量分別為21.2mg/g(干重)、4.5mg/g(干重)、1.6mg/g(干重)；東莨菪堿在野生型唐古特莨菪主根、葉和莖中的含量分別為0.6mg/g(干重)、0.4mg/g(干重)、0.05mg/g(干重)；東莨菪堿在轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪主根、葉和莖中的含量分別為6.6mg/g(干重)、3.4mg/g(干重)、0.2mg/g(干重)。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因核苷酸序列的編碼區(qū)。
2.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼唐古特莨菪莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸序列的編碼區(qū)。
3.一種利用基因工程技術(shù)提高唐古特莨菪中托品烷類生物堿含量的方法，特征在于構(gòu)建攜帶權(quán)利要求1和2中的DNA分子的植物高效表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在唐古特莨菪細(xì)胞、組織、器官、植株中過量表達(dá)權(quán)利1和2中的DNA分子，其步驟如下(1)采用基因克隆方法獲得來源于唐古特莨菪的的兩個(gè)基因的編碼區(qū)，即氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)克隆唐古特莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的引物為fpmt5’-ccagatctATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3’(作為上游引物，攜帶BglII酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rpmt5’-ccggtcaccTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’(作為下游引物，攜帶BstE II酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；克隆唐古特莨菪莨菪堿-6-羥化酶基因的引物為fh6h5’-ccggatccATGGCTACTCTTGTCTCCAAC-3’(作為上游引物，攜帶BamHI酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rh6ht5’-ccgagctcTTAGGCATTGATTTTATAAGGC-3’(作為下游引物，攜帶SacI酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；(2)把來源于唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)連于表達(dá)調(diào)控序列，形成高效植物表達(dá)載體；(3)獲得唐古特莨菪無菌外植體；(4)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移來源于唐古特莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)到唐古特莨菪細(xì)胞、組織、器官、植株中轉(zhuǎn)基因方法采用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、如PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化；(5)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素卡那霉素、潮霉素或G418選擇出有抗生素抗性的唐古特莨菪的轉(zhuǎn)化子；使用PCR、Southern雜交、Northern雜交或Western印跡方法來鑒定唐古特莨菪的轉(zhuǎn)化子；(6)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代對(duì)經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測(cè)氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因的表達(dá)水平，篩選托品烷類生物堿高產(chǎn)的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。(7)轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪中托品烷類生物堿的檢測(cè)。
4.一種DNA分子，其特征是用權(quán)利要求3所述方法獲得的植物表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求3所述方法獲得的生命體，其特征在于它是可生產(chǎn)托品烷類生物堿的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪，其基因組中整合了來至于權(quán)利要求3中質(zhì)粒的T-DNA。
6.用權(quán)利要求5所述方法獲得的唐古特莨菪后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的唐古特莨菪的方法。其過程是用高保真RT－PCR分離目的基因，構(gòu)建攜帶目的基因的雙元三價(jià)植物高效表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把目的基因?qū)胩乒盘剌馆懈咝П磉_(dá)，打破唐古特莨菪中托品烷類生物堿生物合成途徑中的限速反應(yīng)，推動(dòng)代謝流往目標(biāo)產(chǎn)物方向流動(dòng)，提高唐古特莨菪中托品烷類生物堿的合成能力；在特定的篩選和誘導(dǎo)條件下獲得轉(zhuǎn)基因的唐古特莨菪；并對(duì)轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪進(jìn)行分子檢測(cè)和化學(xué)檢測(cè)，最終獲得托品烷類生物堿含量大大提高的轉(zhuǎn)基因唐古特莨菪。本發(fā)明可以為包括莨菪堿和東莨菪堿在內(nèi)的托品烷類生物堿的生產(chǎn)提供一種新型優(yōu)質(zhì)藥源。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1766113SQ200510057260
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者蘭小中, 廖志華, 鮑隆友 申請(qǐng)人:蘭小中, 廖志華