專利名稱：一種耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶及其分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酪氨酸蛋白磷酸酶，特別是一種從金龜子綠僵菌菌株CQMa102中誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
酪氨酸蛋白磷酸酶是屬于蛋白磷酸酶的一個大家族的酶類，它能夠特異地水解蛋白中酪氨酸上的磷酸根基團。在生物體內(nèi)，與酪氨酸磷酸化激酶一起控制著蛋白酪氨酸位點的磷酸化與去磷酸化的狀態(tài)。這種控制作用對調(diào)節(jié)細胞生長、分化、代謝、細胞間相互聯(lián)系、細胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道的活性、免疫應(yīng)答和存活等多種重要的生命活動具有重要的意義。故進一步研究了解酪氨酸蛋白磷酸酶的特性有著重要的理論意義，尋找一種用最簡單的方法獲得最高的回收率以得到耐熱性酪氨酸蛋白磷酸酶更是極需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蟲生真菌耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述酶的分離純化方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶，它能在pH5.5，75℃條件下特異性水解蛋白中酪氨酸上的磷酸根基團，并具有如下的物理化學(xué)特性(1)分子量在十二烷基磺酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳上約為82.5kDa；(2)等電點在5％天然聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(IEF)上約為9.5；(3)最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)pH在酪氨酸上含有磷酸基團的所有蛋白都是該酶蛋白的底物，其最適反應(yīng)溫度為75±1℃，最佳pH為5.5±0.5；(4)熱穩(wěn)定性此酶蛋白在70℃溫育240min對酶活性沒有明顯影響，當孵育溫度為80℃時，隨著孵育時間延長酶活性直線下降，當溫度超過90℃時，酶活性迅速喪失；(5)抑制劑N-乙基馬來酰亞氨、鉬酸根、釩酸鹽和二價鋅離子都是此酶蛋白的特異抑制劑；
(6)酶動力學(xué)特性此酶蛋白的米氏常數(shù)Km為1.273±0.083mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為8.72±0.12μmol.min-1.mg-1；其中所述酶是從綠僵菌屬(Metarhizium anisopliae)金龜子綠僵菌CQMa102(Metarhizium anisopliae var.acridum CQMa102)，保藏編號為CGMCC No.0877中提取制得。
本發(fā)明的另一目的，上述酪氨酸蛋白磷酸酶是這樣制得的金龜子綠僵菌菌株CQMa102在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)能產(chǎn)生所述的酶，并加以純化。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的磷源是酪蛋白，它可有效的誘導(dǎo)該酪氨酸蛋白磷酸酶的產(chǎn)生；另外再加無機氮作為氮源能有效的抑制蛋白酶的產(chǎn)生，有利于純化的進行；根據(jù)該酪氨酸蛋白磷酸酶等電點的特異性，采用兩步離子交換層析分離純化出所述的酪氨酸蛋白磷酸酶。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基具體是由葡萄糖20±1g/l，酪蛋白4～6g/l，無機氮硝酸銨或者硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀0.5±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素混合溶液10±0.5ml/l，調(diào)pH值為5.90～6.10，其中微量元素混合溶液由七水硫酸亞鐵0.22-0.25％，七水硫酸鋅0.95-1.05％，二水鉬酸鈉0.01-0.02％，五水硫酸銅0.01-0.02％，四水氯化錳0.01-0.02％組成，以重量百分比計；所述離子交換層析采用的層析柱分別采用市場上可直接購買得到的High QSepharoes陰離子交換介質(zhì)柱和25S Sepharoes陽離子交換介質(zhì)柱。
上述酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成5×107～5.5×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種1ml，在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)78h，培養(yǎng)溫度為26～27℃。
上述酶的分離純化條件誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液中的菌絲，收集濾液進行徹底透析、離心，其電導(dǎo)率控制在0.26～0.36ms/cm2，制備上柱前待純化粗酶液；所述HighQ陰離子交換層析是用它來徹底吸附非目的蛋白；所述25S陽離子交換層析柱是用來吸附該酪氨酸蛋白磷酸酶，采用0.0～0.2M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶，收集活性部分，即得純化的酪氨酸蛋白磷酸酶。
更為具體地說，上述純化中，待純化粗酶液的制備是指誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000Da，用10倍體積的去離子水在4～8℃透析36～40h，期間換6～8次水，徹底去除培養(yǎng)液中的鹽，溶液在13，500rpm、4℃離心20min；然后用三羥甲基氨基甲烷將透析液pH值調(diào)節(jié)到9.5，控制電導(dǎo)率為0.26～0.36ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液；上述第一步離子層析是40ml High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱先用200ml三羥甲基氨基甲烷平衡緩沖液(15mM，pH9.5，電導(dǎo)0.21～0.26ms/cm2)平衡后，將上述粗酶液以3.0ml/min的流速上柱，收集穿柱液，用于下一步純化；上述第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱層析后收集的穿柱液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，裝入透析袋中，在4℃條件下于15L蒸餾水中透析5～8h，控制電導(dǎo)率在0.25～0.35ms/cm2，上5ml 25S Sepharoes陽離子交換介質(zhì)柱，此層析柱先用50ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)平衡，上柱流速為2.5～3.0ml/min；上柱完畢后用60ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)以2.0ml/min平衡；采用80ml 0.0～0.25M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶。
本發(fā)明充分利用該酶蛋白的高等電點和與離子交換介質(zhì)作用能力低的特點，首先采用40ml High Q陰離子交換作為純化第一步，控制上柱液的電導(dǎo)率在0.26～0.36ms/cm2，將上柱液pH調(diào)整到9.5，以盡可能的吸附去除非目標蛋白；純化的第二步采用5ml 25S陽離子交換并將上柱pH設(shè)置到8.0，盡可能牢固的收集目的蛋白。采用本發(fā)明所述的分離純化方法回收率高，得到的酪氨酸蛋白磷酸酶酶蛋白純度達95％以上，具有活性高、底物專一性高的特點，可以作為生化試劑。


圖125 S Sepharoes(Bio-Rad)陽離子層析流出圖；圖2純化所得酶蛋白的分子量及等電點；圖3底物特異性分析；圖4不同蛋白磷酸酶抑制劑對純化的酪氨酸蛋白磷酸酶活性的影響；圖5不同金屬離子對純化酪氨酸蛋白磷酸酶活性的影響；圖6溫度對酪氨酸蛋白磷酸酶活性的影響；圖7.pH對酪氨酸蛋白磷酸酶活性的影響；圖8.酪氨酸蛋白磷酸酶的熱穩(wěn)定性；圖9.Lineweaver-Burk方程測定純化的酪氨酸蛋白磷酸酶Km和Vmax。
在圖2中，1為酶蛋白；2為分子量Marker；4為純酶蛋白等電聚焦銀染；5為純酶蛋白等電聚焦酶染具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例子對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于此。
實施例金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子的活化本例的金龜子綠僵菌菌株CQMa102(Metarhizium anisopliae var.acridum CQMa102)是從罹病竹蝗僵蟲體內(nèi)分離培養(yǎng)純化得到，由重慶大學(xué)基因工程中心分離純化，中國微生物所菌種保存中心保存的菌株，保藏編號CGMCC No.0877，其分生孢子存儲于30％甘油溶液中，于-80℃超低溫冰箱中長期保存。將-80℃保存的金龜子綠僵菌菌株CQMa102接種于1/4SDA平板培養(yǎng)基上進行活化，所用培養(yǎng)基由10～11g/l葡萄糖，2.3～2.7g/l蛋白胨，4.8～5.2g/l酵母浸膏，19～21g/l瓊脂組成，并將其pH值調(diào)至6.0，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產(chǎn)孢，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)條件所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由葡萄糖20±1g/l，酪蛋白4～6g/l，硝酸銨或者硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀0.5±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素混合溶液(七水硫酸亞鐵0.22～0.25％，七水硫酸鋅0.95～1.05％，二水鉬酸鈉0.01～0.02％，五水硫酸銅0.01～0.02％，四水氯化錳0.01～0.02％，以重量百分比計)10±0.5ml/l組成，調(diào)pH值為5.90～6.10。具體配制方法先將酪蛋白溶解于0.1M的氫氧化鈉中，用0.05M鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.5備用；按誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方稱量，調(diào)節(jié)pH至5.90～6.10。最后將培養(yǎng)基分裝到250ml三角瓶，每瓶100ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)基滅菌備用。
收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，用滅菌的0.05％吐溫80溶液配制成5×107～5.5×107孢子/ml菌懸液；每100ml誘導(dǎo)培養(yǎng)液接種1ml。培養(yǎng)液在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)78h，培養(yǎng)溫度為26～27℃。
酸性磷酸酶同工酶檢測等電聚焦電泳參照汪家政(2001)，采用T＝5％，C＝3寬pH范圍兩性電解質(zhì)(pH3～9.5)。電泳設(shè)備為Mini-Protean apparatus(Bio-Rad)％垂直板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(IEF-PAGE)。樣品中包含10％的甘油。陰極電泳液是為2mM NaOH溶液；陽極電解液是由5mM醋酸溶液。采用分步電泳，先在100V電壓下電泳1h，接著在250V電壓下電泳2h。
凝膠染色等電聚焦后的膠用Nagy等的發(fā)表的方法染色。具體方法是將膠放入100ml染色溶液中，室溫孵育20分鐘后，將膠轉(zhuǎn)移到7％的醋酸溶液終止染色。染色液由150mgα-萘基磷酸鈉和50mg固蘭RR溶解在50mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸，pH5.5。
酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測以酶與磷酸酪氨酸反應(yīng)釋放的無機磷含量來確定酪氨酸蛋白磷酸酶活性。取一定體積酶液(xμl)和20μl 20mM的磷酸酪氨酸溶液，在20mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(pH5.5)中、70℃下反應(yīng)10min，反應(yīng)體系總體積100μl。加入100μl 20％三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入100μl牛血清白蛋白(10mg/ml)，在13，500rpm離心20分鐘。取上清液50μl加水50μl，再加入50μl顯色液。顯色液中含有3.6M硫酸、0.5％的鉬酸銨、2％的維生素C。在37℃中水浴30分鐘，在700nm下測吸光值。用磷酸二氫鉀作為標準制作標準曲線。酶活定義為在70℃條件下，每分鐘釋放1μmol無機磷所需的酶量為一個酶活力單位(U)。
為便于樣品處理，本例中每批次培養(yǎng)接種2L培養(yǎng)液，經(jīng)過78h培養(yǎng)，所得濾液經(jīng)過透析處理后，體積為1.8L左右。
酪氨酸蛋白磷酸酶的純化培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000Da，用10倍體積的去離子水在4～8℃透析36～40h，期間換6～8次水，徹底去除培養(yǎng)液中的鹽，溶液在13，500rpm、4℃離心20min；然后用三羥甲基氨基甲烷將透析液pH值調(diào)節(jié)到9.5，控制電導(dǎo)率為0.26～0.36ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液。
本發(fā)明的所有層析都是在Duo-flow高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad)上進行。第一步離子層析是指40ml High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱先用200ml三甲基氨基甲烷平衡緩沖液(15mM，pH9.5，電導(dǎo)0.21～0.26ms/cm2)平衡后，將上述待純化粗酶液以3.0ml/min的流速上柱，收集穿柱液，用于下一步純化。
第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱層析后收集的穿柱液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，裝入透析袋中，在4℃條件下于15L蒸餾水中透析5～8h，控制電導(dǎo)率在0.25～0.35ms/cm2，上5ml 25 S Sepharoes陽離子交換介質(zhì)柱，此層析柱先用50ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)平衡過，上柱流速為2.5～3.0ml/min；上柱完畢后用60ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)以2.0ml/min平衡；采用80ml 0.0～0.25M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶(參見圖1)。
本例結(jié)合同工酶分析資料，根據(jù)目的蛋白的等電點的特異性，首先選用40ml High QSepharoes(Bio-Rad)陰離子交換層析，該介質(zhì)直徑為50μm，流速較快，可以較快地將樣品中的非目標蛋白吸附到介質(zhì)上，從而達到快速除去非目標蛋白的目的，將上柱pH設(shè)置為9.5，電導(dǎo)率控制在0.26～0.36ms/cm2是為了讓非目標蛋白很好的吸附到柱上，通過這一步層析，去除掉了樣品中的非目的蛋白，有利于下一步純化。
經(jīng)過第一步陰離子交換層析后，樣品中蛋白很少了，進一步采用5ml 25 S Sepharoes陽離子交換介質(zhì)，25 S Sepharoes陽離子介質(zhì)直徑為25μm，由于柱子小，介質(zhì)細，因而分辨率更高，pH8.0，控制電導(dǎo)在0.25～0.35ms/cm2，此層析柱先用50ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)平衡，上柱流速為2.5-3.0ml/min；上柱完畢后用60ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(10mM，pH8.0)以2.0ml/min平衡；采用80ml 0.0～0.25M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶，得到了一個單一的洗脫峰，也就是酪氨酸蛋白磷酸酶活性峰。
發(fā)明人對本例純化得到的酪氨酸蛋白磷酸酶進行生化特性鑒定1、分子量和等電點分子量的測定是根據(jù)Laemmli的方法用12％的SDS-PAGE測定，蛋白質(zhì)分子量Marker是低分子量Marker(Pharmacia)。等電點是在IEF-PAGE上測定的。
參見圖2可知，此酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量在十二烷基磺酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳上約為82.5kDa；在等電聚焦凝膠電泳(IEF)上等電點約為9.5。
2、底物特異性分析分別測定了純化的酪氨酸蛋白磷酸酶對磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸的水解作用。測定方法同上述的酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測。只是作用底物分別換為磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸。每種底物分別作三次重復(fù)(包括空白和實驗處理)。
參見圖3，磷酸酪氨酸為該蛋白酶專一性底物。
3、抑制劑及金屬離子對酪氨酸蛋白磷酸酶活性的影響將不同濃度及不同類型的抑制劑及金屬離子與純化酶蛋白混合后，在室溫孵育30分鐘后，按照上述的酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測方法測定酶活性，以清水作對照，計算其相對酶活性。參見圖4和圖5。
4、酪氨酸蛋白磷酸酶反應(yīng)最適溫度和pH測定從30～90℃每隔5℃設(shè)置一個溫度梯度，按照上述酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測定方法在不同溫度梯度的水浴鍋中反應(yīng)10min，每個溫度梯度分別作三次重復(fù)。參見圖6。
從pH3.0～9.5每隔0.5個pH設(shè)置一個梯度，其中3.0～5.0用醋酸緩沖液，5.5～6.5用MES緩沖液，7.0～7.5用HEPES緩沖液，8.0～9.5用Tris-HCl作緩沖液，按照上述酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測定方法在不同pH值緩沖液中測定。每種pH梯度分別作三次重復(fù)。參見圖7。
結(jié)論酪氨酸蛋白磷酸酶的反應(yīng)最適溫度為75℃，最適反應(yīng)PH值為5.5。
5、酪氨酸蛋白磷酸酶熱穩(wěn)定性測定純化的酪氨酸蛋白磷酸酶在50，60，70，80，90℃條件下分別水浴10min，30min，60min，120min和240min，然后按照上述酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測定方法測定酶活性。每個處理分別作三次重復(fù)。
參見圖8可知此酪氨酸蛋白磷酸酶在70℃溫育240min對酶活性沒有影響，當孵育溫度為80℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當溫度達90℃時，酶活性迅速喪失。
6、酶動力學(xué)特性測定磷酸酪氨酸終濃度設(shè)置為0，0.08，0.16，0.32，0.48，0.64，0.80，0.96，1.44mM，不同濃度梯度的磷酸酪氨酸分別與25ng純化的酪氨酸蛋白磷酸酶混合，按照上述酪氨酸蛋白磷酸酶酶活檢測定方法測定酶活性(n＝3)。應(yīng)用Lineweaver-Burk方程計算純化的酪氨酸蛋白磷酸酶Km和Vmax。(圖9)參見圖9此酪氨酸蛋白磷酸酶的特征米式常數(shù)Km1.273±0.083mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為8.72±0.12μmol.min-1.mg-1。
權(quán)利要求
1.一種耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶，它能在pH5.5，75℃條件下特異性水解蛋白中酪氨酸上的磷酸根基團，并具有如下的物理化學(xué)特性(1)分子量在十二烷基磺酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上約為82.5kDa；(2)等電點在5％的天然聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳上約為9.5；(3)最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)pH在酪氨酸上含有磷酸基團的所有蛋白都是該酶蛋白的底物，其最適反應(yīng)溫度為75±1℃，最佳pH為5.5±0.5；(4)熱穩(wěn)定性此酶蛋白在70℃溫育240min對酶活性沒有明顯影響，當孵育溫度為80℃時，隨著孵育時間延長酶活性直線下降，當溫度超過90℃時，酶活性迅速喪失；(5)抑制劑N-乙基馬來酰亞氨、鉬酸根、釩酸鹽和二價鋅離子都是此酶蛋白的特異抑制劑；(6)酶動力學(xué)特性此酶蛋白的米氏常數(shù)Km為1.273±0.083mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為8.72±0.12μmol.min-1.mg-1；其中所述酶是從綠僵菌屬(Metarhizium anisopliae)金龜子綠僵菌CQMa102(Metarhizium anisopliae var.acridum CQMa102)，保藏編號為CGMCC No.0877中提取制得。
2.一種如權(quán)利要求1所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，所述方法包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能誘導(dǎo)形成所述酶的微生物以形成所述的酶，并分離純化所得的酶；所述微生物為綠僵菌屬(Metarhizium anisopliae)金龜子綠僵菌CQMa102(Metarhiziumanisopliae var.acridum CQMa102)，保藏編號為CGMCC No.0877。
3.如權(quán)利要求2所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，其特征在于在所述分離純化方法中，對所述的酶進行同工酶檢測和酶活檢測，以確定目的蛋白的等電點，再進行純化。
4.如權(quán)利要求2所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的磷源采用酪蛋白，氮源采用無機氮；所述純化方法采用待純化粗酶液的制備和兩步離子交換層析分離純化出所述的酪氨酸蛋白磷酸酶。
5.如權(quán)利要求4所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由葡萄糖20±1g/l，酪蛋白4～6g/l，硝酸銨或者硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀0.5±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素混合溶液10±0.5ml/l組成，調(diào)pH值范圍為5.90～6.10；其中的微量元素混合溶液由七水硫酸亞鐵0.22％～0.25％，七水硫酸鋅0.95％～1.05％，二水鉬酸鈉0.01％～0.02％，五水硫酸銅0.01％～0.02％，四水氯化錳0.01％～0.02％組成，以重量百分比計；所述離子交換層析采用的層析柱分別為High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱和25SSepharoes陽離子交換介質(zhì)柱。
6.如權(quán)利要求2至5任一權(quán)利要求所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，其特征在于所述微生物金龜子綠僵菌菌株CQMa102的活化，接種于1/4SDA平板培養(yǎng)基上進行活化，所用培養(yǎng)基由10～11g/l葡萄糖，2.3～2.7g/l蛋白胨，4.8～5.2g/l酵母浸膏，19～21g/l瓊脂組成，并將其pH值調(diào)至6.0，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產(chǎn)孢，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成5×107～5.5×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種1ml，在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)78h，培養(yǎng)溫度為26～27℃；所述分離純化誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液中的菌絲，收集濾液進行徹底透析、離心，其電導(dǎo)率控制在0.26～0.36ms/cm2，制備上柱前待純化粗酶液；所述High Q陰離子交換層析是用它來徹底吸附非目的蛋白；所述25S陽離子交換層析柱是用來吸附該酪氨酸蛋白磷酸酶，采用0.0～0.2M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶，收集活性部分，即得純化的酪氨酸蛋白磷酸酶。
7.如權(quán)利要求4所述的酪氨酸蛋白磷酸酶的分離純化方法，其特征在于所述純化中待純化粗酶液的制備是指培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000Da，用10倍體積的去離子水在4～8℃透析36～40h，期間換6～8次水，徹底去除培養(yǎng)液中的鹽，溶液在13,500rpm、4℃離心20min；然后用三羥甲基氨基甲烷將透析液pH值調(diào)節(jié)到9.5，控制電導(dǎo)率為0.26～0.36ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液；所述第一步離子層析是利用High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱，先用15mM三羥甲基氨基甲烷，pH9.5，電導(dǎo)0.21～0.26ms/cm2的平衡緩沖液平衡介質(zhì)，將所述待純化粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，收集穿柱液，用于下一步純化；所述第二步離子層析是利用High Q Sepharoes陰離子交換介質(zhì)柱，層析后收集的穿柱液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，裝入透析袋中，在4℃條件下于蒸餾水中透析5～8h，控制電導(dǎo)率在0.25～0.35ms/cm2，上25S Sepharoes陽離子交換介質(zhì)柱，此層析柱先用10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8.0的緩沖液平衡，然后上柱，上柱流速為2.5～3.0ml/min；上柱完畢后用三羥甲基氨基甲烷，pH8.0的緩沖液以2.0ml/min速度平衡；在三羥甲基氨基甲烷，pH8.0的緩沖液中以0.0～0.25M氯化鈉線形洗脫梯度方式洗脫結(jié)合的酪氨酸蛋白磷酸酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從金龜子綠僵菌菌株CQMa102中誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐熱酪氨酸蛋白磷酸酶及其分離純化方法。它是采用特殊誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)該金龜子綠僵菌以形成所述的酶，并加以分離純化制得。制得的酶蛋白是糖蛋白，能特異性水解蛋白中酪氨酸上的磷酸根基團，具有活性高、底物專一性高的特點，分子量82.5kDa，等電點9.5，熱穩(wěn)定性好，在70℃條件下能4h保持酶活性不變；N－乙基馬來酰亞氨、鉬酸鹽、釩酸鹽和二價鋅離子等都能特異性抑制該酶的活性，而岡田酸和氟化物對其酶活性沒有明顯影響，可以作為生化試劑。
文檔編號C12N9/14GK1800378SQ200510057429
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者夏玉先, 李振輪, 王中康, 殷幼平, 彭國雄 申請人:重慶大學(xué), 重慶重大生物技術(shù)發(fā)展有限公司