專利名稱：一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)調(diào)控序列及其應(yīng)用，特別是涉及一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列及其在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一些遺傳性疾病可使肝臟的蛋白合成功能發(fā)生障礙，目前臨床上對(duì)這些疾病的治療方法非常有限，主要是通過反復(fù)注射缺失蛋白來進(jìn)行治療，但是這種治療方式較為昂貴，有感染疾病的危險(xiǎn)，并且只能暫時(shí)減輕疾病的癥狀。肝臟移植可解決遺傳性疾病的血清蛋白質(zhì)缺陷問題，但供體器官來源有限。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展出現(xiàn)了基因療法，可以顯著改善很多遺傳性疾病的治療，由于肝臟所具有的蛋白翻譯后的修飾功能使其成為基因治療遺傳性血液病的重要靶器官，通過肝臟基因療法將功能基因?qū)牖蛉毕莸膫€(gè)體并使其在體內(nèi)長(zhǎng)期高效表達(dá)，但目前限制肝臟基因治療的主要因素是基因在肝臟內(nèi)表達(dá)水平較低，例如通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的因子E或人1抗胰蛋白酶(hAAT)的表達(dá)水平只有正常水平的百分之一，造成低水平表達(dá)的原因之一是轉(zhuǎn)錄活性不強(qiáng)，為加強(qiáng)基因在體內(nèi)的高水平表達(dá)，構(gòu)建肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列成為必需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列。
本發(fā)明所提供的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，是含有肝臟特異性啟動(dòng)子AAT-1202-+45和增強(qiáng)子Aer及ApoE的表達(dá)調(diào)控序列。
所述ApoE的Genebank號(hào)為gi|975886|；所述Aer的Genebank號(hào)為gi|24797079|；所述AAT-1202-+45的Genebank號(hào)為gi|1236244|。
所述增強(qiáng)子Aer和ApoE位于啟動(dòng)子AAT-1202-+45的上游，Aer及ApoE的前后順序可以改變。
所述肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列具有序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2的DNA序列。
含有上述肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列的肝臟表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
用于構(gòu)建所述肝臟表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任何一種原核或真核表達(dá)載體，優(yōu)選為PCI neo。
其中，以PCI neo為出發(fā)載體構(gòu)建的肝臟表達(dá)載體為PCI neoAerApoEAATP。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所提供的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，可調(diào)控外源基因地高效表達(dá)，彌補(bǔ)了低水平轉(zhuǎn)錄活性不強(qiáng)的缺點(diǎn)。本發(fā)明具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1A為注射后第1天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖1B為注射后第4天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖1C為注射后第11天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖1D為注射后第27天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖1E為注射后第54天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖1F為注射后第87天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測(cè)結(jié)果圖2A為注射后第1天血清中SEAP濃度的檢測(cè)結(jié)果圖2B為注射后第3天血清中SEAP濃度的檢測(cè)結(jié)果圖2C為注射后第9天血清中SEAP濃度的檢測(cè)結(jié)果圖2D為注射后第31天血清中SEAP濃度的檢測(cè)結(jié)果圖2E為注射后第57天血清中SEAP濃度的檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由博亞公司合成，所用酶制劑均購自TaKaRa公司。
實(shí)施例1、肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列的構(gòu)建本實(shí)施例構(gòu)建了四種肝臟表達(dá)調(diào)控序列，分別為AerApoEAATP、ApoEAATP、AATP和AlbEAATP，其中，AerApoEAATP含有肝臟特異性啟動(dòng)子AAT-1202-+45和增強(qiáng)子Aer及ApoE，后三種為對(duì)照序列，用于實(shí)施例3和實(shí)施例4中AerApoEAATP表達(dá)效果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)AAT-1206-355(Genebank號(hào)gi|1236244|)、AAT-348-+45(Genebank號(hào)gi|177830|)、AAT-261-+45(Genebank號(hào)gi|177830|)、Aer(Genebank號(hào)gi|24797079|)、ApoE(Genebank號(hào)gi|975886|)、AAT-1202-45(Genebank號(hào)gi|1236244|)、Alb(Genebank號(hào)gi|191868|)、ApoEAAT(Genebank號(hào)gi|975886|+gi|177830|)和hAAT(Genebank號(hào)gi|177828|)的cDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增上述基因片段的引物，引物序列如下擴(kuò)增AAT-1206-355的引物PA(上游引物)5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’PB(下游引物)5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’
擴(kuò)增AAT-348-+45的引物PC(上游引物)5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴(kuò)增AAT-261-+45的引物PE(上游引物)5’-CGGGGTACCCGCCACCCCCTCCACCTT-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴(kuò)增Aer的引物PF(上游引物)5’-CCCAAGCTTACAGCCCCTAGAAAATAACCTGCGTT-3’PG(下游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’擴(kuò)增ApoE的引物PH(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’PI(下游引物)5’-CCCAAGCTTCCCTCTCACACTACCTAAACCA-3’擴(kuò)增AAT-1202-45的引物PJ(上游引物)5’-CGGCGTACCTGTGGGTCACTCGCCTGGTAGA-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴(kuò)增AlbE的引物PK(上游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’PL(下游引物)5’-GGAAGATCTGTTCCTAGATTACATTACACAT-3’擴(kuò)增ApoEAAT的引物PM(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴(kuò)增hAAT的引物PN(上游引物)5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’po(下游引物)5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’一、肝臟表達(dá)調(diào)控序列ApoEAATP的構(gòu)建以質(zhì)粒載體pBC-hFIX-B[1](Eric C Olivares，Roger P.Hollis，ThomasW.Chalberg et al.Site-specific genomic integration produces therapeuticFactor IX levels in mice.nature，2002)為模板，在引物PM和PD的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ApoEAATP，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收該目的片段，并將其插入到載體pGEM-T(Promega公司)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(博大泰克公司)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-ApoEAATP。將T-ApoEAATP用限制性內(nèi)切酶IppoI和BglII雙酶切后回收得到目的片段ApoEAATP。
二、肝臟表達(dá)調(diào)控序列AATP的構(gòu)建以人肝臟的基因組DNA為模板，在引物PA和PB的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AAT-1206-355，在引物PC和PD的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AAT-348-+45，將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段AAT-1206-355和AAT-348-+45，將AAT-1206-355插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-AAT-1206-355；將AAT-348-+45插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-AAT-348-+45。將T-AAT-1206-355經(jīng)BglII和ScaI雙酶切后，回收大小為851bp的目的片段，將該片段命名為BglIIAAT1206-355ScaI；將T-AAT-348-+45經(jīng)ScaI和IppoI進(jìn)行雙酶切后，回收大小為303bp的目的片斷，將大小為303bp的目的片段用T4DNA連接酶與BglIIAAT1206-355ScaI進(jìn)行連接，再以該連接產(chǎn)物為模板，在引物PA和PD的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AAT-1206-+45，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收該目的片段，并將其插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-AAT-1206-+45。將質(zhì)粒載體T-AAT-1206-+45用限制性內(nèi)切酶IppoI和BglII進(jìn)行雙酶切后，回收得到目的片段AAT-1206-+45。
三、肝臟表達(dá)調(diào)控序列AerApoEAATP的構(gòu)建提取人肝臟的基因組DNA，并以此為模板，在引物PH和PI的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ApoE，在引物PF和PG的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增Aer，再以T-AAT-1206-+45為模板，在引物PJ和PD的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AAT-1202-+45，將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收大小正確的目的片段，將ApoE、Aer、AAT-1202-+45插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，將三種質(zhì)粒載體命名為T-ApoE、T-Aer；T-AAT-1202-+45。將T-ApoE經(jīng)限制性內(nèi)切酶ScaI和HindIII雙酶切后回收ApoE片斷，并將該片段與經(jīng)同樣酶酶切處理的載體T-Aer連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定陽性克隆后提取質(zhì)粒，命名為T-AerApoE。將T-AAT-1202-+45經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI和SacI雙酶切后回收AAT-1202-+45片斷，并將該片段與經(jīng)同樣酶酶切處理的載體T-AerApoE連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定陽性克隆后提質(zhì)粒，命名為T-AerApoEAAT，用限制性內(nèi)切酶IppoI和BglII對(duì)T-AerApoEAAT進(jìn)行酶切后得到目的片斷AerApoEAAT，對(duì)該DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明AerApoEAAT具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由1880個(gè)堿基組成，自5’端第1-6位堿基為限制性內(nèi)切酶BglII的識(shí)別位點(diǎn)，自5’端第7-326位堿基為增強(qiáng)子ApoE，自5’端第327-332位堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII的識(shí)別位點(diǎn)，自5’端第333-613位堿基為增強(qiáng)子Aer，自5’端第614-619位堿基為限制性內(nèi)切酶KpnI的識(shí)別位點(diǎn)，自5’端第620-1865位堿基為啟動(dòng)子AATP，自5’端第1866-1880位堿基為限制性內(nèi)切酶IppoI的識(shí)別位點(diǎn)。其中，增強(qiáng)子ApoE和Aer在序列中的位置可調(diào)換，上述限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)也可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行更換。
四、肝臟表達(dá)調(diào)控序列AlbEAATP的構(gòu)建以質(zhì)粒載體EalbPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，NereaRazquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of ChimericLiver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)為模板，在引物PE和PD的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AAT261-+45；以質(zhì)粒載體EIIPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in VivoComparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)為模板，在引物PK和PL的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AlbE。將AAT261-+45插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-AAT45-261。將AlbE插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-AlbE。將T-AlbE經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI和KpnI雙酶切后回收目的片斷AlbE，將AlbE與經(jīng)同樣酶酶切處理的載體T-AAT45-261連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定得到陽性克隆后提取質(zhì)粒，命名為T-AlbEAAT。將T-AlbEAAT用限制性內(nèi)切酶IppoI和BglII酶切后回收得到目的片段AlbEAAT。
實(shí)施例2、以PCI neo為出發(fā)載體構(gòu)建的肝臟表達(dá)載體將實(shí)施例一中得到的肝臟表達(dá)調(diào)控序列AerApoEAATApoEAATP、AAT-1206-+45、和AlbEAAT分別與經(jīng)限制性內(nèi)切酶IppoI和BglII酶切后的載體PCI neo(購于Promega公司)相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定得到陽性克隆后提取質(zhì)粒，得到肝臟表達(dá)載體，命名為PCI neo-AerApoEAAT，用上述同樣方法得到含有AerApoEAAT的肝臟表達(dá)載體PCI neo-ApoEAATP，含有AAT-1206-+45的肝臟表達(dá)載體PCI neo-AATP和含有AlbEAAT的肝臟表達(dá)載體PCI neo-AlbEAAT。
實(shí)施例3、以hAAT為報(bào)告基因驗(yàn)證肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)水平一、含有基因hAAT的載體PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCIneoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT和PCI neoAlbEAATP-hAAT的構(gòu)建從人肝臟組織中提取RNA，以PN/PO為引物，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增hAAT基因片段。將hAAT基因片段插入到載體pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的陽性克隆擴(kuò)增后提質(zhì)粒，命名為T-hAAT。將T-hAAT經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切后回收目的片斷hAAT，再將hAAT分別與經(jīng)相同酶酶切處理的載體PCI neo、PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定得到陽性克隆后提取質(zhì)粒，分別命名為PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT。
二、hAAT表達(dá)水平的驗(yàn)證1、大量提取質(zhì)粒PCI neo、PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCIneoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and inVivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULARTHERAPY Vol.7，No.3，March 2003)。
2、將40只昆明鼠分成8組(每組5只)，用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法給每只昆明鼠尾靜脈注射25μg質(zhì)粒，注射的溶液量(生理鹽水)相當(dāng)于昆明鼠體重的10％，注射時(shí)間控制在五秒鐘以內(nèi)，1-7組依次注射質(zhì)粒PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCIneo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT、PCI neo，第8組為空白對(duì)照。
3、分別于注射后第1、4、11、27、54、87天尾靜脈采血，用ELISA法檢測(cè)血清中hAAT的濃度，檢測(cè)方法包括以下步驟1)取hAAT(購自SIGMA公司)2mg溶于2mL PBS中，再加入2mL弗氏完全佐劑，乳化后用肌肉注射法免疫日本大耳白兔，四周后再取1mg hAAT溶于1mL PBS中，加入1mL弗氏不完全佐劑乳化后對(duì)上述經(jīng)初次免疫的大耳白兔肌肉注射加強(qiáng)免疫，兩周后再進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫。第2次加強(qiáng)免疫后10天，耳緣靜脈采血，采用EIASA法測(cè)定血清中的抗體滴度，抗體滴度高于10-6后心臟穿刺取血，離心取上清。
2)將步驟1)采集的兔血清先用飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，再經(jīng)蛋白G柱(Promega公司)純化后得到高純度的抗-hAAT抗體，采用過碘酸鈉法將辣根酶(HRP)對(duì)抗-hAAT抗體進(jìn)行標(biāo)記。
3)用羊抗hAAT(5μg/mL，購自SIGMA公司)包被96孔板，4℃包被16小時(shí)后，用PBST洗板，拍干，每孔加入130μL含10％胎牛血清的PBST，37℃溫育1小時(shí)后拍干，每孔再加入100μL待檢測(cè)樣品及已知濃度的經(jīng)梯度稀釋的hAAT標(biāo)準(zhǔn)品，37℃溫育40分鐘，用PBST洗板，拍干，每孔加入100μL經(jīng)400倍稀釋的步驟2)中的HRP標(biāo)記的抗hAAT抗體，37℃溫育40分鐘，用PBST洗板，拍干，顯色，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值計(jì)算出待檢樣品中hAAT的濃度。
結(jié)果如圖1A-圖1F所示，圖中1-7分別表示注射PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT和PCI neo的組，8為空白對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果表明，由AerApoEAATP調(diào)控的hAAT的表達(dá)水平明顯高于其它組，表達(dá)時(shí)間可持續(xù)2-3個(gè)月。
實(shí)施例三、以SEAP為報(bào)告基因驗(yàn)證肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)水平。
一、含有基因SEAP的載體PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCIneoAerApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP的構(gòu)建將質(zhì)粒載體PTAL-SEAP(CLONTECH公司)用EcoRI和SalI酶切后，回收大小約為1.8kbp的SEAP片斷，將SEAP片斷分別與經(jīng)過EcoRI和SalI雙酶切處理的載體PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定陽性克隆后提質(zhì)粒，分別命名為PCIneo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP和PCIneoAlbEAATP-SEAP。
二、SEAP表達(dá)水平的驗(yàn)證1、大量提取質(zhì)粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCIneo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP和PCI neoAerApoEAATP-SEAP。用限制性內(nèi)切酶BglII將質(zhì)粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP酶切消化成線狀，將線性化的質(zhì)粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP命名為BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP。
2、將45只昆明鼠分成9組(每組5只)，用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法給每只昆明鼠尾靜脈注射25μg質(zhì)粒，注射的溶液量(生理鹽水)相當(dāng)于昆明鼠體重的10％，注射時(shí)間控制在五秒鐘以內(nèi)，1-8組依次注射質(zhì)粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCIneoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCIneoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP，第9組為空白對(duì)照。
3、分別于注射后第1、3、9、31、57天尾靜脈采血，用的Phospha-LightTMSystem試劑盒(A&B公司)測(cè)定血清中SEAP的濃度。
結(jié)果如圖2A-圖2E所示，圖中1-8分別表示注射PTAL-SEAP、PCI neo、PCIneo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP的組，9為空白對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果表明，由AerApoEAATP調(diào)控的SEAP的表達(dá)水平明顯高于其它組，表達(dá)時(shí)間可持續(xù)2-3個(gè)月，而且將表達(dá)載體線性化后可提高報(bào)告基因在體內(nèi)的表達(dá)水平。
序列表<160>2<210>1<211>1880<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<400>1agatctggct cagaggcaca caggagtttc tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc 60agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg ctgcctctga agtccacact gaacaaactt 120cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag 180ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg 240ccacctccaa catccactcg accccttgga atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct 300ggcgtggttt aggtagtgtg agagggaagc ttacagcccc tagaaaataa cctgcgttac 360agcatccact cagtatccct tgagcatgag gtgacactac ttaacatagg gacgagatgg 420tactttgtgt ctcctgctct gtcagcaggg cactgtactt gctgatacca gggaatgttt 480gttcttaaat accatcattc cggacgtgtt tgccttggcc agttttccat gtacatgcag 540aaagaagttt ggactgatca atacagtcct ctgcctttaa agcaatagga aaaggccaac 600ttgtctacgt ttaggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg1020ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact1080tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag1140
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權(quán)利要求
1.一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，是含有肝臟特異性啟動(dòng)子AAT-1202-+45和增強(qiáng)子Aer及ApoE的表達(dá)調(diào)控序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，其特征在于所述增強(qiáng)子Aer和ApoE位于啟動(dòng)子AAT-1202-+45的上游。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，其特征在于所述肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列，其特征在于所述肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求1所述肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列的肝臟表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肝臟表達(dá)載體，其特征在于所述增強(qiáng)子Aer和ApoE在載體中位于啟動(dòng)子AAT-1202-+45的上游。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的肝臟表達(dá)載體，其特征在于用于構(gòu)建所述肝臟表達(dá)載體的出發(fā)載體為PCI neo。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肝臟表達(dá)載體，其特征在于所述肝臟表達(dá)載體為PCIneoAerApoEAATP。
9.權(quán)利要求1或2所述的肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列及其應(yīng)用，其目的是提供一種肝臟高效表達(dá)調(diào)控序列及其在肝臟中表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。該序列是含有肝臟特異性啟動(dòng)子AAT－1202－+45和增強(qiáng)子Aer及ApoE的表達(dá)調(diào)控序列。所述增強(qiáng)子Aer和ApoE在載體中位于啟動(dòng)子AAT－1202－+45的上游。本發(fā)明所提供的肝臟表達(dá)調(diào)控序列可調(diào)控外源基因地高效表達(dá)，彌補(bǔ)了低水平轉(zhuǎn)錄活性不強(qiáng)的缺點(diǎn)。本發(fā)明具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1670216SQ20051005935
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者付秋霞, 賈帥爭(zhēng), 王全立 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所