專利名稱：雞指環(huán)蛋白mrg基因的表達調(diào)控及其蛋白質(zhì)的生物學功能的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明為一個具有E3泛素連接酶活性且對于雞肌肉原代細胞具有抑制增值作用的基因/蛋白，MRG基因/蛋白，涉及生物醫(yī)學高技術(shù)中新基因、新蛋白的開發(fā)與應用領域。
背景技術(shù)：
本實驗室利用DD-PCR的方法篩選Myostatin誘導表達的基因時，鑒定得到了受Myostatin上調(diào)表達的基因MRG(Myostatin Regulated Gene)，MRG是一個新基因，目前尚無文獻報道。最初的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，MRG蛋白質(zhì)共由381個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)域分析該基因在N端具有蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Protease-associated domain，PA domain)，該結(jié)構(gòu)域在某些蛋白酶以及分選受體中有發(fā)現(xiàn)，但是具體功能并不是十分清楚，對transferrin受體中PA結(jié)構(gòu)域分析表明其可能作為蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)構(gòu)域。此外，MRG還具有一個指環(huán)結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈、核定位信號以及酸性氨基酸富集區(qū)。
1998年具有指環(huán)結(jié)構(gòu)域的一些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有泛素連接酶活性。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是細胞內(nèi)利用降解蛋白質(zhì)的主要途徑?？梢源篌w上劃分為兩個步驟i.多個泛素分子共價連接到目的蛋白上；ii.被泛素標記的蛋白由26S蛋白酶體所降解。泛素(ubiquitin)是一個小肽，含有76個氨基酸，分子量為8.5kD。泛素在生物進化過程中十分保守，從酵母到人只有三個氨基酸的差別，說明泛素引導的蛋白質(zhì)降解途徑本身對生物體的生長發(fā)育和新陳代謝十分重要。泛素的76個氨基酸中有7個賴氨酸殘基(Lysine)，其中第48位Lys殘基側(cè)鏈的ε-NH2是形成多聚體的必要基團。除了泛素外，體系中還包括泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)，泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)以及泛素蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)，26S的蛋白酶體作為最后降解目的蛋白的細胞器。目前還發(fā)現(xiàn)了去泛素化酶(deubiquitinase，E4)，作為蛋白降解前將蛋白質(zhì)上的泛素切掉以利于26S蛋白酶體降解的酶，而且同時也發(fā)現(xiàn)E4還可以挽救某些將要被降解的蛋白質(zhì)的命運，具體作用正在被人們所揭示。將泛素共價連接到底物蛋白經(jīng)過一個三步化的機制，首先泛素在泛素激活酶E1的催化下，由ATP提供能量，其C末端76位甘氨酸殘基被激活，使得泛素與E1共價相連，而后泛素被轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2上，最后在泛素連接酶E3的作用下，將E2上的泛素轉(zhuǎn)移至底物蛋白的Lys殘基上。連續(xù)過程后，在底物上形成了一條多泛素鏈(polyubiquitin chain)，多泛素鏈被26S蛋白酶體識別而降解(如圖1.2)。整個體系形成一個分等級的框架一個泛素激活酶E1可對應多個泛素結(jié)合酶E2，同時一個泛素結(jié)合酶E2又與多個泛素連接酶E3相互作用，進而一個E3又可以有多個底物。泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與細胞內(nèi)多種生物學過程，主要包括細胞周期、細胞分化、遷移等。此外泛素與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合不僅引起蛋白質(zhì)的降解，還可以對蛋白質(zhì)的分選、受體的內(nèi)吞以及基因轉(zhuǎn)錄都發(fā)揮著重要作用。隨著蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析，作為E3連接酶的指環(huán)結(jié)構(gòu)域與某些轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)域在三維結(jié)構(gòu)上是有很大差異的。
因此，MRG的指環(huán)結(jié)構(gòu)域可能是作為E3連接酶特征的結(jié)構(gòu)，而并非是轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)域。而MRG蛋白作為E3連接酶還尚無報道。研究MRG基因的表達調(diào)控以及其蛋白質(zhì)的生物學功能是十分重要。
發(fā)明目的尋找肌肉抑制因子Myostatin的下游靶基因，了解Myostatin抑制肌肉細胞增值的分子機制。MRG作為Myostatin的下游靶基因是一個E3泛素連接酶，進而將Myostatin和細胞增殖抑制通MRG作為Myostatin的下游靶基因是一個E3泛素連接酶，進而將Myostatin和細胞增殖抑制通過泛素介導的蛋白質(zhì)降解途徑聯(lián)系起來。為進一步農(nóng)業(yè)上家禽家畜生產(chǎn)的改良提供理論基礎。
內(nèi)容與要求應用差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR、Northern印跡雜交、分子克隆、BAC文庫篩選、DNA序列測定技術(shù)、蛋白表達與純化技術(shù)、親和層析、單克隆抗體制備、免疫沉淀技術(shù)、Western blot檢測、細胞培養(yǎng)技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)以及細胞免疫熒光和生物信息學原理，體內(nèi)體外泛素化檢測技術(shù)鑒定了受Myostatin上調(diào)的下游靶基因MRG，對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了生物信息學分析，純化原核表達的目標蛋白并制備單克隆抗體，并且通過Northern和Western印跡進行了組織表達譜和發(fā)育階段表達譜的分析，進行了免疫熒光、體內(nèi)體外泛素化檢測以及在雞肌肉原代細胞過表達MRG基因以初步確定MRG基因/蛋白的功能。
該基因/蛋白達到的技術(shù)指標為1.MRG基因的cDNA序列全長為1146bp，此序列編碼381個氨基酸。MRG基因在RNA水平和蛋白質(zhì)水平受Myostatin上調(diào)。(圖1)2.MRG在雞基因組中占據(jù)20kb，包括10個外顯子在N端具有蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Protease-associated domain，PA domain)，C端具有指環(huán)結(jié)構(gòu)域(RING finger domain，RING)。(圖2)3.MRG基因基因在雞的各個組織中均有表達，并在早期階段隨著發(fā)育其表達呈現(xiàn)下調(diào)，第3周后表達消失；雞肌肉原代細胞在體外培養(yǎng)過程中不斷分化，隨著肌肉細胞的分化MRG的表達呈現(xiàn)下調(diào)。(圖3)4.免疫熒光檢測MRG蛋白表達于C2C12、雞肌肉原代細胞(CFM)、COS-7細胞的細胞核內(nèi)。(圖4)5.MRG具有E3泛素連接酶活性；UbcH5a和UbcH5c為其兩種E2，且反應是ATP，Ubiquitin，E1，E2任一組分所依賴的；指環(huán)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄銭3連接酶活性是充要的。(圖5)6.過表達MRG能夠抑制雞肌肉原代細胞(CFM)的增值，并且在RNA水平上能夠使得MyoD與Caveolin-3表達下調(diào)。(圖6)


圖1.Nortern和Western分析Myostatin調(diào)控MRG的表達圖1-AMyostatin處理雞肌肉原代細胞(CFM)后6h，12h，18h，24h，48h MRG的RNA水平；18S，28S對照。
圖1-BMyostatin處理雞肌肉原代細胞(CFM)24h后MRG蛋白質(zhì)表達水平；Tubulin對照。
結(jié)果顯示Myostatin處理CFM后，在6h，12h時間點MRG RNA水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，18S，28S作為參照。Western檢測MRG蛋白質(zhì)水平也出現(xiàn)上調(diào)，Tubulin作為參照。
圖2.MRG基因組結(jié)構(gòu)、氨基酸結(jié)構(gòu)域分析、不同物種間氨基酸比對以及分子進化分析圖2-AMRG基因組結(jié)構(gòu)。
圖2-BMRG結(jié)構(gòu)域分析。
圖2-C雞、人、小鼠、大鼠、爪蟾、斑馬魚MRG蛋白質(zhì)序列比對。
圖2-D雞、人、小鼠、大鼠、爪蟾、斑馬魚MRG蛋白質(zhì)進化樹分析。
結(jié)果顯示MRG在雞基因組中占據(jù)20kb，包括10個外顯子；MRG蛋白質(zhì)具有N端PA結(jié)構(gòu)域和C端RING結(jié)構(gòu)域；不同物種間MRG氨基酸序列比對表明MRG從斑馬魚到人具有很高的保守性，尤其在PA和RING結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
圖3.MRG基因時間和空間表達分析圖3-AcMRG與mMRG在成年個體中不同組織的蛋白質(zhì)表達情況；Tubulin對照。
圖3-B不同發(fā)育階段(從胚胎期第10天到出生后第10周)MRG RNA與蛋白質(zhì)表達水平。
圖3-C體外培養(yǎng)雞肌肉原代細胞不同階段RNA與蛋白質(zhì)表達水平。
結(jié)果顯示小鼠與雞MRG在成體的不同組織中均有表達；在發(fā)育的早期階段，MRG的表達呈現(xiàn)下調(diào)，第3周后表達消失；雞肌肉原代細胞在體外培養(yǎng)過程中不斷分化，隨著肌肉細胞的分化MRG的表達呈現(xiàn)下調(diào)。
圖4.MRG蛋白質(zhì)在細胞中的定位A.C2C12免疫前血清檢測B.C2C12 DAPI染色C.C2C12細胞MRG單克隆抗體檢測D.C2C12 DAPI染色E.CFM細胞MRG單克隆抗體檢測F.CFM DAPI染色G.COS-7細胞MRG單克隆抗體檢測H.COS-7 DAPI染色結(jié)果顯示MRG表達于細胞核內(nèi)。
圖5.MRG具有E3泛素連接酶活性圖5-AcMRG，hMRG與已知的E3連接酶RING結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對；C258A/H260A和W270A分別為保守氨基酸定點誘變位點圖5-B原核表達MRG羧基端含有RING結(jié)構(gòu)域的重組蛋白體外泛素化檢測圖5-C以UbcH5a作為E2，缺少其中某一組分的體外泛索化檢測圖5-D全長野生型MRG及其兩種RING結(jié)構(gòu)域突變C258A/H260A，W270A的MRG轉(zhuǎn)染COS-7細胞后的免疫沉淀組分體外泛素化檢測圖5-EMRG E3連接酶體內(nèi)泛素化檢測結(jié)果顯示MRG具有E3泛素連接酶活性；UbcH5a和UbcH5c為其兩種E2，且反應是ATP，Ubiquitin，E1，E2任一組分所依賴的；指環(huán)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄銭3連接酶活性是充要的。
圖6.過表達MRG能夠抑制雞肌肉原代細胞(CFM)的增值圖6-ACFM轉(zhuǎn)染MRG后0h，24h，48h細胞計數(shù)圖6-BCFM轉(zhuǎn)染24h后，RT-PCR鑒定細胞中Caveolin-3與MyoD RNA的表達水平結(jié)果顯示過表達MRG能夠抑制雞肌肉原代細胞(CFM)的增值，并且在RNA水平上能夠使得MyoD與Caveolin-3表達下調(diào)。
實施例1.差異顯示PCR體外培養(yǎng)的雞肌肉原代細胞(CFM)用Myostatin處理或PBS處理24小時后分別提取總RNA，經(jīng)DNA酶處理消化污染的基因組DNA。分別利用3種錨定引物(5’-T15N3-3’)進行反轉(zhuǎn)錄反應，接下來分別用3種錨定引物和6種隨機引物(共18種組合)進行PCR擴增反應，最后以6％的變性聚丙烯酰氨測序膠分離α-33P標記的DNA擴增片段，進行干膠，并壓片顯影。在經(jīng)過18種PCR引物組合擴增出的片段中，共得到52條差異片段。我們分別從凝膠中切割下含有差異片段的膠塊，將DNA洗脫下來并用其作為模板采用DD-PCR中的條件進行再擴增，經(jīng)膠回收后用于探針的標記。
2.RNA的制備和Northern印跡分析取成年雞引頸處死后，快速切取腦、肌肉、腸、肝、脾、心、腎組織，裝入1.5ml離心管，紗布包裹后迅速液氮冷凍。然后用鈍器砸碎，稱取100μg組織加入有1ml Trizol試劑(LifeTechnologies)的微量組織勻漿器中。分別取組織置于加有1ml Trizol試劑的微量組織勻漿器中，按照Trizol試劑說明所述提取總RNA。
采用甲醛變性的1％瓊脂糖凝膠電泳，每個泳道上樣所提組織總RNA 25μg，電泳結(jié)束后，用DEPC處理過的水淋洗凝膠數(shù)次，50mM的NaOH處理20min以水解RNA，無RNA酶的水淋洗數(shù)次，并用20XSSC浸泡凝膠45min，用20XSSC轉(zhuǎn)膜16-20h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，于6XSSC中漂洗濾膜，晾干，80℃干烤固定1-2h。室溫存放待雜交用。用PCR擴增rtSH3p13片段，擴增片段的回收、定量，探針標記DNA用量為25ng，采用隨機引物標記試劑盒(Boehringer Mannheim)對探針進行放射性標記，雜交液使用Clontech公司Express Hyb TM Hybridization Solution。將雜交液68℃預熱，使液體均勻。將Northern膜放入6XSSC中浸濕，然后置于雜交管中。固定有核酸的一面朝上，膜與雜交管之間勿留氣泡，加入5ml雜交液，68℃預雜交30min。將標記探針于100℃處理10min，然后冰浴10min，繼而與預熱的雜交液混勻，加到雜交管中。68℃雜交1-2h。雜交結(jié)束后，小心將膜自雜交管中取出。置于2XSSC/0.5％ SDS中室溫洗三次，每次15min。然后再用0.1XSSC/0.1％ SDS 68℃洗膜兩次，每次20min。將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X光膠片，-70℃曝光(圖1，圖3)3.MRG基因片段的原核表達與純化C末端含有指環(huán)結(jié)構(gòu)域的MRG cDNA克隆到pET28載體上，而后轉(zhuǎn)化入BL21大腸桿菌中。BL21菌在含有50ug/ml的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至O.D.600＝1.0，而后加入IPTG至終濃度為1mM，仍在37℃下誘導4個小時。菌體收集離心后超聲破碎，12,000rpm離心后收集上清液，大部分MRG重組蛋白表達于上清中。由于重組蛋白中含有6個連續(xù)的組氨酸，能夠與Ni離子螯合，所以利用Ni-NTA agarose可以對其進行純化。
取4mL Ni-NTA Agrose置于下端墊有濾膜的20mL層析柱中，以微型蠕動泵控制洗脫的流速，待Agrose壓密實后，以1滴/秒的流速開始洗脫。以20倍柱床體積的MCAC-0(20mM Tris-ClpH8.9，0.5M NaCl，10％甘油，1mM PMSF，0.1％Tritong-X100)平衡層析柱。將全部蛋白液過柱。以10倍柱床體積的MCAC-40(20mM Tris-Cl pH8.9，0.5M NaCl，10％甘油，1mM PMSF，0.1％ Tritong-X100，40mM咪唑)洗脫非特異性親和的雜蛋白。以約15-20mL的MCAC-200(20mM Tris-Cl pH8.9，0.5M NaCl，10％甘油，1mM PMSF，0.1％ Tritong-X100，200mM咪唑)洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。將上述收集的洗脫液在PBS或MCAC-0溶液中于4℃透析過夜。透析液以0.22μm的一次性濾器過濾并分裝，-20℃凍存。
4.MRG單克隆抗體的制備動物免疫選擇體重18～20g6周齡的BALB/c雌性小鼠，進行免疫.50ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后經(jīng)腹腔注射，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射。再過3周后，用加倍劑量的抗原進行加強免疫，3天后取脾細胞進行融合。細胞融合及雜交瘤細胞篩選取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5～10∶1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，800g離心去除培養(yǎng)基，用50％PEG作為融合劑在37du下加入0.5～0.7ml，融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后離心，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分別到96孔含有飼養(yǎng)細胞的細胞板中培養(yǎng)，5天后用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液。等到融合細胞覆蓋孔底10％～50％時，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，篩選出的特異性陽性孔采用有限稀釋法進行3次克隆，獲得分泌抗MRG單克隆抗體的細胞株。
5.Western印跡分析將結(jié)束電泳的SDS-PAGE膠從裝置上卸下，小心的切去Stacking Gel(上層膠)并在凝膠一角切下一小塊作為標記。將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min后進行轉(zhuǎn)膜。
將合適大小的PVDF膜首先置于甲醇中浸潤5min，然后在1×Transfer Buffer中平衡(即用鑷子夾住膜在Transfer Buffer中反復涮洗30s)后方可應用，如果使用尼龍膜，則直接在1×TransferBuffer中平衡后即可使用。安裝轉(zhuǎn)膜設備將轉(zhuǎn)膜用的塑料夾子的黑色面向下打開后平放于桌上，首先放置一片在1×Transfer Buffer中浸潤過的海面墊，然后放置2層浸潤過的3M濾紙，之后將平衡過的PAGE膠平鋪于濾紙上，再在其上放置平衡過的PVDF膜并用一玻璃試管趕壓所有氣泡，接著再向其上放置2層浸潤過的3M濾紙和另一片在1×Transfer Buffer中浸潤過的海面墊，最后合上塑料夾子并放置于裝滿轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中(注意電極方向)。電轉(zhuǎn)移對于轉(zhuǎn)印120KD以下的蛋白質(zhì)，通常按如下參數(shù)設置，1安培恒定電流需要1h；500mA 2h；250mA 4h；或150mA過夜。
抗原抗體反應。Blocking(封閉)將轉(zhuǎn)印好的膜卸下(觀察有色Marker是否完全從膠上轉(zhuǎn)移到膜上)，標記好正面(即蛋白面)，置于Blocking Buffer中室溫搖晃孵育1h，或37℃30min，或4℃過夜。一抗孵育將特定的抗體稀釋于Primary Antibody Dillution Buffer中，通常的稀釋比例為1∶1000。將膜從Blocking Buffer中取出，稍稍空干一下液體后直接放于稀釋的一抗溶液中，室溫搖晃孵育1h，或37℃30min，或4℃過夜(對于一些信號較弱的抗體采用4℃過夜效果較好)。二抗孵育將膜取出瀝干液體后放于1×TBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。將洗過的膜置于稀釋后的二抗中(通常1∶1000倍稀釋)室溫搖晃孵育1h。洗膜將膜從二抗稀釋液中取出，瀝干液體后放于1×TBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。
顯色反應(辣根過氧化物酶化學發(fā)光法)。各取等體積ECL試劑A液、B液混合(按每平方厘米轉(zhuǎn)印膜0.125mL ECL混合液計算)。將轉(zhuǎn)印膜輕輕接觸3MM濾紙吸干液體。將膜放入事先混勻的ECL混合液中反應1min，提起轉(zhuǎn)印膜，輕輕在3MM濾紙上吸干液體。用保鮮膜覆蓋轉(zhuǎn)印膜，注意表面要平整。用透明膠帶將保鮮膜覆蓋的轉(zhuǎn)印膜固定在顯影暗匣內(nèi)，有蛋白的一面朝上。于暗室中與X光片暴光10s，30s，1min或更長時間不等，洗片觀察結(jié)果。(圖1，圖3)6.MRG在細胞內(nèi)的免疫熒光定位蓋玻片的處理將蓋玻片分次置入濃酸中浸泡2h，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片投入十倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5min后取出于60℃干燥1h或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。細胞免疫熒光染色細胞固定轉(zhuǎn)染或進行相應處理的細胞以PBS清洗3次，瀝干水分，以固定液室溫固定10min。PBS漂洗3次。細胞透化室溫下，0.5％Triton-X100/PBS透化處理3×10min。
細胞封閉以1-3％BSA/PBS封閉，37℃，30min，或4℃過夜。一抗孵育在Parafilm膜上加入40μL以PBS-T按一定比例稀釋(通常1∶50)的一抗(如果進行雙免疫熒光分析則同時加入兩種一抗)，將蓋玻片有細胞的一面朝下伏于一抗上，密封于濕盒中，37℃，1h，或4℃過夜。漂洗室溫下，0.5％Triton-X100/PBS漂洗3×10min。二抗孵育在Parafilm膜上加入40μL以PBS-T按一定比例稀釋((通常1∶80))的二抗(如果進行雙免疫熒光分析則同時加入兩種二抗)，將蓋玻片有細胞的一面朝下伏于二抗上，密封于濕盒中，37℃，1h。漂洗室溫下，0.5％Triton-X100/PBS漂洗3×10min。在第二次漂洗時加入1∶10000 DAPI(DAPI/0.5％Triton)。去離子水漂洗去鹽。封片取10μL封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。(圖4)7.體內(nèi)及體外泛素化實驗體外泛素化實驗1mg純化的MRG C末端重組蛋白與100nM E1(泛素激活酶)，1μM each E2(泛素連接酶UbcH2，UbcH3，UbcH5a，UbcH5b，UbcH5c，UbcH6，UbcH7，and UbcHl0)，5μM ubiquitin(Sigma-Aldrich)，50mM Tris-Cl(pH 7.5)，2mM ATP，2.5mM MgCl2，and 1mM DTT于30℃孵育1小時，反應體系為10ul。加入10ul 2×SDS上樣緩沖液以終止反應。樣品煮沸后上樣于8％SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用抗ubiquitin的抗體進行檢測。全長的帶有Myc標簽的MRG及其兩種點突變克隆(C258A/H260A，W270A)分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞后24小時收集，細胞裂解后用抗Myc的抗體以及protein A/G plus agarose將Myc-MRG及其突變型蛋白(C258A/H260A，W270A)分別沉淀下來。將沉淀物與100nM E1，1uM UbcH5a in 50mM Tris buffer(pH7.5)containing2mM ATP，2.5mM MgCl2and 1mM DTT于30℃孵育1小時，同樣利用用抗ubiquitin的抗體進行檢測。
體內(nèi)泛素化實驗COS-7細胞培養(yǎng)至密度為70％后，將HA-ubiquitin和Myc-MRG或空質(zhì)?；蚱鋬煞N突變載體(C258A/H260A，W270A)共轉(zhuǎn)染到COS-7細胞中。轉(zhuǎn)染24小時后用蛋白酶體抑制劑處理細胞4個小時后收集細胞。細胞于裂解緩沖液(50mM Tris，pH7.5，with 100mM NaCl，2mM EDTA，1％(v/v)NP-40，10mM iodoacetamide，10uM MG-132，and protease inhibitor cocktail)中裂解后離心收集上清。用抗Myc的抗體以及protein A/G plus agarose沉淀蛋白后在進行SDS電泳。轉(zhuǎn)膜后利用抗HA的抗體進行檢測。(圖5)8.雞肌肉原代細胞的轉(zhuǎn)染及細胞計數(shù)實驗中采用電擊轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染前將所用的質(zhì)粒DNA溶于滅菌的去離子水中，并調(diào)整濃度使其達到1μg/μL以上。轉(zhuǎn)染前24h更換新鮮的培養(yǎng)基并調(diào)整細胞密度，使轉(zhuǎn)染時的密度達到70-80％匯合。用胰酶-EDTA溶液消化細胞，脫壁后加入全培養(yǎng)基吹散，1000rpm離心6min，重懸于全培養(yǎng)基，并調(diào)整細胞密度至2×107/mL。轉(zhuǎn)染時，取0.5mL細胞懸液(107個細胞)與10μg質(zhì)粒DNA、120μg鮭精DNA混合混合，移入0.4cm的電轉(zhuǎn)杯。電轉(zhuǎn)條件采用300V，900μF。電轉(zhuǎn)后，立即將細胞轉(zhuǎn)移至含有適量全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞貼壁情況，轉(zhuǎn)染后12-24h，更換培養(yǎng)基一次，并按照相應的實驗設計處理細胞或細胞計數(shù)。(圖6)
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個受肌肉生長抑制因子(Myostatin)調(diào)控的雞指環(huán)蛋白MRG基因/蛋白。該基因在雞基因組中占據(jù)20kb，由10個外顯子組成，蛋白質(zhì)產(chǎn)物包括381個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之MRG基因/蛋白，其特征在于MRG是Myostatin的靶基因，在RNA水平和蛋白質(zhì)水平均受到Myostatin的上調(diào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之MRG基因/蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)在N端具有蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Protease-associated domain，PA domain)，在C端具有指環(huán)結(jié)構(gòu)域(RINGfinger domain，RING)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之MRG基因/蛋白，其特征在于該基因在雞的各個組織中均有表達，在雞發(fā)育的早期階段MRG的表達呈現(xiàn)下調(diào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之MRG基因/蛋白，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于雞肌肉原代細胞的細胞核內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述之MRG基因/蛋白，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)是一個E3泛素連接酶，其指環(huán)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谶B接酶活性是充分且必要的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述之MRG基因/蛋白，其特征在于過表達MRG能夠抑制雞肌肉原代細胞的增值。對于農(nóng)業(yè)上家禽生產(chǎn)具有重要意義。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個受肌肉生長抑制因子(Myostatin)調(diào)控的雞指環(huán)蛋白MRG(Myostatin Regulated Gene)基因的表達調(diào)控及其蛋白質(zhì)的生物學功能，屬于生物醫(yī)學高技術(shù)中新基因、新蛋白的開發(fā)與應用領域。MRG基因所編碼的蛋白由381個氨基酸組成，在N端具有蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Protease－associated domain，PA domain)，C端具有指環(huán)結(jié)構(gòu)域(RING finger domain，RING)。本發(fā)明說明了MRG在胚胎發(fā)育的早期階段發(fā)揮了重要作用；MRG蛋白具有E3泛素連接酶活性，提示著其可能參與泛素蛋白酶體介導的蛋白質(zhì)降解過程；功能研究表明MRG是一個肌肉生長發(fā)育的負調(diào)控因子。本發(fā)明對于了解MRG的基因表達調(diào)控規(guī)律及其生物學功能，進而對于其在家禽生產(chǎn)方面的應用具有重要意義。
文檔編號C12N15/85GK1840661SQ20051005978
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者楊威, 張強, 王琨, 余方, 張勇, 陳巖, 朱大海 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所