專利名稱：一種有效分離多種微藻種質(zhì)的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微藻種質(zhì)分離方法，它可以從一次性野外原生態(tài)采樣水體中有效分離多種微藻種質(zhì)，該方法可以有效地應(yīng)用到對淡水、海水、半咸水環(huán)境中浮游和底棲的微藻種質(zhì)的獲取、單種分離、純種培養(yǎng)、特征水體微藻群落組成分析、野外種質(zhì)采集以及環(huán)境條件監(jiān)測。
背景技術(shù)：
微藻廣泛地應(yīng)用于生物指示劑、作為生物化學(xué)和基因工程研究工具、人工養(yǎng)殖動物的餌料、藥源生物種類、人類的食物、太空空間站微生態(tài)系統(tǒng)種類、環(huán)境保護(hù)工程等廣大的領(lǐng)域中。純系微藻種質(zhì)的獲取在實(shí)驗(yàn)研究和實(shí)踐應(yīng)用中具有重要的意義。對某一種微藻的深入認(rèn)識和研究有賴于該種質(zhì)純系培養(yǎng)株的獲得；要進(jìn)行某種質(zhì)的大量培養(yǎng)以獲取某種可觀的生物量或天然產(chǎn)物生物量，純系種株的獲得是必不可少的；而在篩選某種目的微藻時，大量的微藻種質(zhì)資源的獲取是必需的。
在進(jìn)行野外微藻生態(tài)學(xué)和種群動力學(xué)的研究中，常用的是將樣品固定的方法進(jìn)行定量分析，而定性分析的活體樣本觀測結(jié)果常常是處于瞬間狀態(tài)的微藻種類組成，受觀測條件和瞬間水環(huán)境條件限制，水體中相當(dāng)一部分的種類被忽略掉了，而這一部分可能是對無機(jī)和生物環(huán)境作用具有重要意義的類群；另一方面，野外工作者常?？嘤趯τ谀骋坏貐^(qū)突然出現(xiàn)的新種感到措手不及，希望獲得種質(zhì)的目的常常因?yàn)橐巴馀囵B(yǎng)條件和短期時間的限制而與一種新種失之交臂。
自然水體中微藻種類繁多，并且不同種類的微藻其細(xì)胞大小變化很大在生態(tài)學(xué)研究范疇中，將小于2μm的浮游生物稱為picoplankton，30μm以上的為網(wǎng)采浮游生物，2-30μm之間的稱為nanoplankton，通常使用的浮游植物網(wǎng)采方法會丟失相當(dāng)多的種類，而采水的方法獲取的樣品在一般的瞬時鏡檢條件下也很難將水體中所有的種類觀察到更不用說能夠分離出來。
通常分離微藻的方法常見的有以試管將水樣逐級稀釋，待一個月甚至更長的時間后取試管內(nèi)的水樣進(jìn)行鏡檢，該方法要求的水體較大、器材樣品數(shù)多而且水體中藻類組成變化不能及時跟蹤，有相當(dāng)大的盲目性而且獲取單種微藻種質(zhì)的時間間隔長。
另外一種用毛細(xì)管分離方法由于是針對單個細(xì)胞的分離，不光是對顯微操作技術(shù)要求較高，主要還是對細(xì)胞本身的攪動較大細(xì)胞因此很可能不能存活，而且針對的是瞬時采樣水體，對水環(huán)境中非預(yù)期的少量的微小的種類常常忽略。在需要進(jìn)行多種藻類篩選而希望從某種特征環(huán)境水體中獲取多種甚至全部微藻種質(zhì)時，沒有一個方便而有效可行的方法，僅僅依靠一時刻的種類組成進(jìn)行分析和分離顯然不夠。
微量滴定板是一種在生物和化學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的塑料制樣品容器。典型的微量滴定板有6孔、24孔、96孔、384孔甚至1536孔的標(biāo)準(zhǔn)，通常以2∶3的比例形成一個長方形孔板。6孔、24孔、96孔的微量滴定板也有稱作組織培養(yǎng)板的。從我們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來看，在進(jìn)行微藻種質(zhì)獲取和分離中，24孔板是最為有利且方便應(yīng)用的一種，可以在一個板上制造多種條件的多重重復(fù)，方便鏡檢而且水體的體積足夠一定量的生物群落在實(shí)驗(yàn)條件下較長時間的演替要求。結(jié)合孔徑較大的6孔培養(yǎng)板，我們幾乎可以獲取所有大小在幾個微米到上百微米的微藻純系種質(zhì)。
微藻的室內(nèi)培養(yǎng)是指在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下人為提供模擬微藻生長所需的環(huán)境條件，培養(yǎng)微藻需要在一個適當(dāng)?shù)娜萜髦袨槲⒃逄峁┻m當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)條件使微藻生活其中。在微藻群落的演替過程中，化學(xué)條件和生物條件的改變決定了群落的微藻種類組成從而形成了不同的微藻優(yōu)勢種類的出現(xiàn)。微藻種類除少數(shù)屬于完全自養(yǎng)型微藻外，大多數(shù)都屬于混合營養(yǎng)型，除了要求主要的培養(yǎng)條件如光照、CO2、H2O、營養(yǎng)鹽、微量元素外還需要添加其自身不能合成的因素如維生素等。維持一個自然種群的多種類混合水體空間可以保障一些未知的生物種間關(guān)系在群落演替中的作用。不同的微藻種類有不完全一樣的營養(yǎng)要求，在瞬時提供各種營養(yǎng)條件差異的基礎(chǔ)上，利用微藻群落在時間序列上因變的群落優(yōu)勢特點(diǎn)就有利于觀察、分離并純化一次采樣水體的系列微藻種質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有背景技術(shù)而提供一種有效分離多種微藻種質(zhì)的新方法，它能快捷方便、有效可靠地從一個野外水樣中獲取和分離多個微藻種質(zhì)，克服了諸多缺陷如現(xiàn)行的微藻野外采集樣品中如果沒有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢種就難以從中分離種質(zhì)，在采用試管水樣逐級稀釋過程中，僅分離一個目標(biāo)種質(zhì)就需要耗費(fèi)大量的時間，在采用毛細(xì)管分離微藻種質(zhì)時，由于細(xì)胞分撿后密度過低往往難以存活。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是利用微藻群落演替法在微量組織培養(yǎng)板上從一次性采樣樣品中獲取多種微藻種質(zhì)方法，并且可以及時跟蹤不同培養(yǎng)條件下單個野外水樣微生態(tài)群落在受到不同環(huán)境條件改變后的群落演替過程。
具體來說，這種技術(shù)方案包括以下技術(shù)步驟1.野外樣品的采集選擇典型環(huán)境條件下的水體如水華或赤潮水體、特征污染水體、清潔水體或熱源環(huán)境水體等，以浮游植物采水方法獲得微藻種質(zhì)原生態(tài)群落；2.取一定體積的樣品鏡檢除去可見的浮游動物以消除浮游動物的捕食影響；
3.充分搖勻樣品水體，等量移取定量水樣分別加入潔凈的微孔組織培養(yǎng)板的各孔之中，在不同的微孔板上制造相應(yīng)的目標(biāo)培養(yǎng)條件，新增培養(yǎng)液和水樣以1∶0.5至1∶10的比例接種到微孔板上；4.將各板放置在設(shè)定培養(yǎng)條件的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，定期于倒置顯微鏡下進(jìn)行鏡檢；5.在特定條件和時間下會有典型的優(yōu)勢種類出現(xiàn)，這是野外采集水樣微觀自然群落在不同培養(yǎng)條件下出現(xiàn)群落演替的必然結(jié)果，此時，利用消毒的毛細(xì)管吸取優(yōu)勢種類進(jìn)一步分離獲取純系種質(zhì)，這樣演替出現(xiàn)的優(yōu)勢群落包括多個微藻種質(zhì)，它可以是野外采集水樣初次鏡檢時就觀察到的主要種類，也可以是在初次鏡檢時無法觀察到的非預(yù)期微藻種類。
步驟1中所述的野外采樣水體包括多種微藻野外水樣環(huán)境，可以是淡水、海水或半咸水環(huán)境。
步驟3中所述的微孔組織培養(yǎng)板可以是6孔、24孔或96孔的組織培養(yǎng)板，可以將微藻在組織培養(yǎng)板微孔中進(jìn)行培養(yǎng)和微藻種質(zhì)的分離。所述的目標(biāo)培養(yǎng)條件主要是指調(diào)節(jié)大量營養(yǎng)鹽的含量及比例的變化、或者是微量營養(yǎng)物質(zhì)的含量和比例變化，以及光照、溫度等培養(yǎng)條件的改變。大量營養(yǎng)鹽是指氮、磷、硅，微量營養(yǎng)物質(zhì)是指微量元素、維生素等。
步驟4所述的群落演替是指一個環(huán)境水樣中復(fù)雜的微藻群落，可以在培養(yǎng)條件改變后形成優(yōu)勢的群落，從而可以方便地分撿純化種質(zhì)。
步驟5所述的預(yù)期微藻種質(zhì)是指野外采集到的樣品中直接鏡檢確認(rèn)的微藻種類。非預(yù)期微藻種質(zhì)是指在野外采集樣品鏡檢過程中沒有發(fā)現(xiàn)的微藻種質(zhì)，這些非預(yù)期種質(zhì)是在改變培養(yǎng)條件以后逐漸發(fā)生的新種質(zhì)，即在野外采集樣品初次鏡檢時沒有觀察到，但實(shí)際上，在經(jīng)過一些特殊的培養(yǎng)條件能夠從孢囊萌發(fā)、稀有群落(初次鏡檢時由于數(shù)量很稀少被忽略或根本無法觀察到)演變?yōu)閮?yōu)勢群落。
根據(jù)步驟5的結(jié)果，由于一個野外采集水體樣品在經(jīng)過多種不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，往往在不同的微孔培養(yǎng)板上出現(xiàn)多個不同的優(yōu)勢微藻種類，這些微藻種類都可以進(jìn)一步通過傳統(tǒng)的顯微操作技術(shù)很方便地挑選得到純化的微藻種質(zhì)，進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)擴(kuò)增。由于在一個野外水體樣品中，除初次鏡檢觀察到的一些微藻品種外，還有許多初次鏡檢忽略的微藻種類以微少群落或孢囊形式等存在，但是，這些被忽略的種類往往在特殊的培養(yǎng)條件下和群落演替的時間序列上可以形成優(yōu)勢的群落。因此，多種微藻種質(zhì)可以是一次性野外采樣所得的所有潛在微藻種類。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于它提供了一種有效獲取和分離多種微藻的新方法，該方法可以從一次野外采樣水體中通過培養(yǎng)條件的改變在微孔組織培養(yǎng)板上實(shí)現(xiàn)群落演替，從而分離出預(yù)期微藻種質(zhì)和瞬時鏡檢尚不可檢出的非預(yù)期微藻種質(zhì)，這種有效分離多種微藻種質(zhì)的技術(shù)核心是在微孔組織培養(yǎng)板上制造多種營養(yǎng)環(huán)境與培養(yǎng)條件，使微藻群落發(fā)生多種多樣的演替過程，然后于倒置顯微鏡下顯微觀測跟蹤潛在微藻種質(zhì)在時間和培養(yǎng)條件序列上的群落演替，將序列上處于優(yōu)勢的種類進(jìn)一步進(jìn)行純化分離。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例一1.野外微藻原生態(tài)群落樣品的獲取2005年6月10日于浙江洞頭采集到一個海水水樣，海水采集1L，直接裝入聚乙烯塑料瓶中。
2.實(shí)驗(yàn)室鏡檢水體中優(yōu)勢的微藻種類為米氏凱倫藻，去除準(zhǔn)備應(yīng)用水體中的浮游動物。
3.不同營養(yǎng)鹽條件設(shè)置將部分海水水樣以微孔濾膜(0.45微米)抽濾獲得海水原水；在經(jīng)過過濾消毒的天然海水中以添加不同的化學(xué)物質(zhì)及不同比例獲得不同的培養(yǎng)用營養(yǎng)鹽差異條件12組，各組分別為海水原水、未加富的消毒海水、分別只添加氮、磷、硅、微量元素、維生素、氮/磷/硅(兩種比例)、氮/磷、氮/硅、磷/硅的消毒海水(表1)。
表1培養(yǎng)液差異列表

4.分別將不同的培養(yǎng)液以移液槍定量分裝到12個24孔組織培養(yǎng)板上，每孔加入培養(yǎng)液的體積為1mL，一組條件接種一個24孔板；5.將去除浮游動物的原生態(tài)水樣以移液槍分別加入各24孔培養(yǎng)板的各孔之中，加入水體體積為1ml。水體總體積為2ml。操作過程嚴(yán)格消毒；6.將分裝接種好的12個培養(yǎng)板置于溫度為23℃、光照強(qiáng)度為3500-5000lux、D∶L＝12∶12的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天于Nikon倒置顯微鏡下觀察各板的群落組成變化；7.結(jié)果顯示，各組條件下的群落在時間序列上的演替存在一定的差異，多種營養(yǎng)鹽混合加入的組其種類演替變化豐富，微藻存活狀態(tài)良好?？傮w來說，加入硅酸鹽的組會出現(xiàn)明顯的硅藻優(yōu)勢期；單種營養(yǎng)鹽加入對原生態(tài)的群落變化影響不大；原水狀態(tài)可以在水體中較長時間地維持原生種類。各組中演替出現(xiàn)的優(yōu)勢種類有米氏凱倫藻、具齒原甲藻、錐狀斯氏藻、紅色裸甲藻、一種小型的裸甲藻、Gyrodinium、骨條藻、舟形藻、菱形藻等。其他的微藻還包括一種球狀帶刺微型藻類(具體種名待定)、三種未知硅藻和大量的甲藻孢囊。在這次實(shí)例研究中，觀察到的微藻種質(zhì)超過30余種，其中包括國內(nèi)尚未見報道的一種小型裸甲藻微藻種質(zhì)。
以下以第8和12組為代表來顯示群落在前10天里的定性變化(如表2)，可以看出，原始的海水樣品中主要的微藻種類為米氏凱倫藻、具齒原甲藻，其次為舟形藻、菱形藻，經(jīng)過培養(yǎng)之后，到第5天，群落中出現(xiàn)了骨條藻、具齒原甲藻優(yōu)勢，而米氏凱倫藻開始消退，同時出現(xiàn)了多種初次鏡檢時被忽略的種類；到第10天時，除上述的具齒原甲藻外，出現(xiàn)了一種新的優(yōu)勢種，是一種小型的裸甲藻種類，這是初次鏡檢時沒有觀察到的，也沒有被國內(nèi)其他的文獻(xiàn)報道所記錄。
因此，通過本實(shí)例我們成功地分離到了表中所列的幾個主要優(yōu)勢種類，可以作為新的純系種質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，如果在研究過程中發(fā)現(xiàn)具有進(jìn)一步的醫(yī)藥、食品等經(jīng)濟(jì)價值，這些種質(zhì)可以作為純系種質(zhì)進(jìn)行生物工程生產(chǎn)。
表2以第8和12組為代表顯示群落在培養(yǎng)前10天內(nèi)的定性變化*


注表格中的數(shù)字代表群落的豐度狀態(tài)，優(yōu)勢5，亞優(yōu)勢4，大量3，較多2，出現(xiàn)1，未出現(xiàn)0
權(quán)利要求
1.一種有效分離多種微藻種質(zhì)的新方法，其特征在于該方法是從野外采樣水體中通過培養(yǎng)條件的改變在微孔組織培養(yǎng)板上實(shí)現(xiàn)群落演替，從而分離出預(yù)期微藻種質(zhì)和瞬時鏡檢尚不可檢出的非預(yù)期微藻種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的野外采樣水體包括多種微藻野外水生環(huán)境，可以是淡水、海水或半咸水環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的微孔組織培養(yǎng)板是有適宜容積的6孔、24孔或96孔的組織培養(yǎng)板，從而將微藻在組織培養(yǎng)板微孔中進(jìn)行培養(yǎng)和微藻種質(zhì)的分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的培養(yǎng)條件改變是指大量營養(yǎng)鹽的含量及比例的變化或者微量營養(yǎng)物質(zhì)的含量及比例變化，以及光照、溫度培養(yǎng)條件的改變，新增培養(yǎng)液和水樣以1∶0.5至1∶10的比例接種到微孔板上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的群落演替是指一個環(huán)境水樣中復(fù)雜的微藻群落，可以在培養(yǎng)條件改變后形成優(yōu)勢的群落，從而可以方便地分撿純化種質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的預(yù)期微藻種質(zhì)是指野外采集到的樣品中直接鏡檢確認(rèn)的微藻種類。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的非預(yù)期微藻種質(zhì)是指在野外采集樣品鏡檢過程中沒有發(fā)現(xiàn)的微藻種質(zhì)，這些非預(yù)期種質(zhì)是在改變培養(yǎng)條件以后逐漸發(fā)生的新種質(zhì)，多種微藻種質(zhì)可以是一次性野外采樣所得的所有潛在微藻種類。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的分離是制造多種營養(yǎng)環(huán)境與培養(yǎng)條件，使分裝到微孔培養(yǎng)板上的微藻群落發(fā)生多種多樣的演替過程，然后于倒置顯微鏡下顯微觀測跟蹤潛在微藻種質(zhì)在時間和營養(yǎng)條件序列上的群落演替，將序列上處于優(yōu)勢的種類進(jìn)一步進(jìn)行純化分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從一次野外樣品中有效分離多種微藻種質(zhì)的新方法。通過人為提供的多種培養(yǎng)條件，使采集的野外樣品在不同的培養(yǎng)條件下同時培養(yǎng)于微孔組織培養(yǎng)板，微藻群落能夠以定向演替的方式交替形成優(yōu)勢種群，從而可以獲取多種微藻種質(zhì)，并利于有效分離單種微藻進(jìn)行進(jìn)一步的室內(nèi)培養(yǎng)。微藻群落的演替條件和群落的演替過程跟蹤所進(jìn)行的場所為微孔組織培養(yǎng)板。
文檔編號C12N1/12GK1923993SQ20051006059
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者周成旭, 嚴(yán)小軍, 駱其君, 馬斌, 裴魯青 申請人:寧波大學(xué)