專利名稱：通用型分子標記開發(fā)方法及所設計的禾本科通用型標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因組學、生物信息學和分子生物學這三大領域，確切地說，涉及一種通用型分子標記的開發(fā)方法，以及依此方法開發(fā)的禾本科通用型標記。
背景技術：
遺傳標記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。根據(jù)生物特征所表現(xiàn)的層次，遺傳標記可分成形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記、分子標記四種類型。其中分子標記是DNA水平上遺傳變異的直接反映，具有數(shù)量豐富，信息量大，與基因表達無關，檢測不受季節(jié)、環(huán)境和個體發(fā)育階段的影響等優(yōu)點，因而是最理想的遺傳標記。分子標記廣泛應用于遺傳作圖、基因定位、基因克隆、動植物育種、遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、遺傳病鑒定、法醫(yī)學鑒定等許多領域，因而具有重要的理論和應用價值。
自1980年首次提出分子標記的概念以來，已經(jīng)發(fā)展出十多種分子標記。但除了第一代分子標記RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)是基于DNA Southern雜交技術的之外，后來發(fā)展的分子標記皆是基于DNA擴增(PCR)技術的。PCR技術由于操作方便，因而更受歡迎?；赑CR的分子標記主要有兩種類型，一種類型標記的擴增產(chǎn)物是隨機的，如RAPD(隨機擴增多態(tài)DNA)、AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)、ISSR(簡單序列重復間區(qū))等。這些標記雖然適用于各種生物，但是由于擴增產(chǎn)物沒有特異性，使得其在不同物種(特別是遠緣物種)間缺乏可比性，因而并不能作為不同物種間的通用型分子標記。另一種類型為特異引物的分子標記，其擴增產(chǎn)物是特異的，它們在染色體上的位置是已知的，而且通常表現(xiàn)為共顯性。目前應用最多的特異引物分子標記是微衛(wèi)星(或稱SSR)標記，它具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、在基因組中分布均勻等優(yōu)點。但由于除了位于編碼區(qū)的EST-SSR之外，SSR標記大多數(shù)分布在保守性低的無用序列區(qū)域，因而其引物通常只在本物種中才具有特異性，用到其它物種中時往往喪失特異性，退化為隨機引物，所以通用性差。高等真核生物基因組中具有功能的基因和調(diào)控序列僅占很小的比例(編碼序列一般只占整個基因組的十分之一)，大部分都是無用的序列。不同物種間的序列同源性主要存在于基因和調(diào)控序列中，而那些無用序列則往往同源性很低。因此，基于基因序列開發(fā)的標記的通用性和可靠性較隨機引物要高許多。目前，對于已完成全基因組測序的擬南芥和水稻來說，借助生物信息學手段，開發(fā)特異性標記已不太困難，但是對于那些目前尚沒有測序或已知序列較少的物種而言，很難開發(fā)特異性的分子標記。Saha等根據(jù)牛毛草的EST-SSR開發(fā)了157對SSR標記引物，試驗表明，這些引物在禾本科不同種屬間中具有一定的通用性。
Brunel等提出了一種基于PCR技術且通用性很好的分子標記，稱為擴增共有序列遺傳標記(ACGM)。該技術是根據(jù)一種植物中已知功能的基因的保守編碼序列設計引物對另一種植物進行PCR擴增。但是，在不同物種間開發(fā)具有一定通用性的ACGM引物是比較困難的，目前僅見擬南芥和蕓苔屬之間的研究報道，在引物的開發(fā)上也是利用它們之間的同源基因相互探測。也有關于直接利用數(shù)據(jù)庫中的信息對不同物種直接進行tBLASTX研究的報道。
內(nèi)含子是基因中的非編碼區(qū)段，具有很高的遺傳多態(tài)性。已有的研究發(fā)現(xiàn)ACGM標記在蕓苔屬和擬南芥之間多態(tài)位點多存在于內(nèi)含子區(qū)域。吳為人等在水稻秈稻和粳稻亞種之間檢測到大量的內(nèi)含子多態(tài)位點并開發(fā)了一種大規(guī)模檢測內(nèi)含子多態(tài)性位點的方法，這為直接應用內(nèi)含子多態(tài)位點開發(fā)ACGM標記提供了便利。目前如何直接應用內(nèi)含子多態(tài)位點開發(fā)ACGM標記，尚未見相關研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明利用已知物種的基因序列、基于內(nèi)含子長度多態(tài)，提供一種能設計通用性好、特異性高、稱為基于內(nèi)含子長度多態(tài)性的擴增共有序列遺傳標記(intron length polymorphism-based amplified consensus genetic marker，IACGM)的通用型分子標記開發(fā)方法。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種通用型分子標記的開發(fā)方法，包括利用已知物種的基因組序列數(shù)據(jù)，還包括以下步驟1)在已知一個物種A的內(nèi)含子長度多態(tài)性、即ILP的基礎上，借助生物信息學方法，將ILP所在的物種A與物種B的cDNA測序數(shù)據(jù)進行比對，在物種B的全基因組范圍內(nèi)搜索與該物種A的ILP所在cDNA同源的cDNA；物種B為物種A同科但不同屬的物種；；2)PCR引物設計在多態(tài)內(nèi)含子兩側外顯子的保守序列上設計PCR引物，并通過電子PCR和實際PCR進行檢驗；從而開發(fā)出能夠在與物種A同科不同種或同科不同屬的物種內(nèi)，通過PCR進行檢測的通用型分子標記，即IACGM。。
作為本發(fā)明的通用型分子標記的開發(fā)方法的一種改進物種為已具備基因組和cDNA測序數(shù)據(jù)的動物或植物。
以禾本科為例，本發(fā)明的IACGM標記的開發(fā)方法的內(nèi)容如下1、在內(nèi)含子長度多態(tài)兩側不同屬的物種全基因組之間搜索同源基因在已知水稻秈、粳稻品種內(nèi)含子長度多態(tài)性(ILP)的基礎上，借助生物信息學方法，該將ILP所在水稻的cDNA序列與另外一種或幾種與禾本科其它屬的物種cDNA測序數(shù)據(jù)進行比對，在不同屬的全基因組范圍內(nèi)搜索與該ILP所在cDNA同源的cDNA。
2、PCR引物設計在多態(tài)內(nèi)含子兩側外顯子的保守序列上設計PCR引物，并通過電子PCR和實際PCR進行檢驗，從而開發(fā)成能夠在同一科不同種或屬物種內(nèi)通過PCR進行檢測的通用型內(nèi)含子多態(tài)分子標記(IACGM)。對所設計引物的正確性和特異性通過電子PCR進行檢驗。
3、實驗檢驗以用于搜索內(nèi)含子長度多態(tài)性的那對秈、粳稻品種為材料，用設計的引物進行實際的PCR分析，檢驗所開發(fā)的ILP引物的正確性和可行性。同時，另外選取若干個不同屬的禾本科植物為材料，進行PCR分析，以檢驗所開發(fā)的IACGM引物的通用性和多態(tài)性水平。
IACGM的標記引物選自由下列核苷酸序列(5′→3′)組成的組IGA1正向CCGTCAACAAAGTTTGCTCC反向ATTGGACATGCTCTCCATCCIGA2正向AGCTCATCGACTCTGTGCTC反向GGGTACTCCTCTCTGATCTTGGIGA3正向CCTCGACGGCTTCTCCTT反向GCGCATTCCTTGTACAGCTCIGA4正向GACCTCAACAAGCTTGAGCC反向TGTCCTTGTGGCTGAAGAAGIGA5正向AGGAGTCCAGGGACATCATC反向GCACTTTGAACGGCACCTIGA6正向CGGCAGCTGCAAGTACATC反向GACTGCTCGTCGTACTCGTCIGA7正向GAGGTCGGCATCAAGAAGTT反向GTACGACTGCATCGTCGG
IGA8 正向AAGAAGAAGGAGAGGGCGAC反向AATCAAGCGAGAGTGCCAGTIGA9 正向GCCCCCGTATGGAACAAC反向CTCCCTGTCGAAGTTGGCIGA 10正向GGGAGCTTGGAAAATCATCTG反向TGAAGGTAAGCTAGTCCTTTTGCIGA 11正向GCACCACAGGAACCTCGTC反向GATTTTCCATCTTTGCTGCCIGA 12正向TCCTCCACCACCAGCCAT反向GCGTCAGCATCTCGTTCAGIGA13 正向GGAGCTGGAGGCGGTTAAG反向ACAATGTCGCGCTCGGTAGIGA 14正向TCATATGGCTACATCGCCC反向GTGAGCACCTCCAGCACCIGA15 正向AGAGCTATTGGTGCTGACAGA反向CAACAGTGGCTTACCACCATIGA16 正向GCATGGACATACTCTATGAGTGC反向CCCATAGGGAAAGCAGGAAGIGA 17正向GCTAAGGTGAACCTCCCCA反向TGTTGTCGCAGACGATCTTGIGA 18正向ACCAGGAACGAGTACAACGG反向CTACTCCGGCGATCACGAIGA 19正向AACACGCTCAACGTCAACCT反向CTCTGTCCACCACGCTGAAIGA20 正向GACATGATGAAGACGGCAAA反向GAAGCAGCACACGTAGATGGIGA21 正向GAGGTGCAGAGCGAGGTC反向TCTCCTTCTGCCCGTACTTGIGA22 正向AGTTATCCAGGCTGGGCTGT
反向AGCAATGCTCGCCTATCCTIGA23正向GACATGATGAAGACGGCAAA反向GAAGCAGCACACGTAGATGGIGA24正向CCATGCCGTACTGGTCATTC反向GTAGTCGATGTCCGTCCACAIGA25正向ATGTGCTTCCACCCTGACC反向GCCAATCTGCCTGTGCTTIGA26正向GGCCAAAATAATGGAAGATCG反向AGTGATGAAAGAGCAAGGCAIGA27正向ACCGCCCTAGTCCCAAAC反向ACAGAGTCAGCAAAGATGCGIGA28正向ACCCCTACGTGGTCTCCG反向CCACGTCGAGCTTCTCCCIGA29正向CGTCATCACCAAGGCTTACA反向TCCTGATCGGTCACATTGAAIGA30正向AACTTCATGGAGATCGGGC反向CCCTCCACGTAGCTGAACCIGA31正向CGTCGAGGACATGGACATC反向GACTCCGGCAGCTCACAGIGA32正向TGGGTATCATCAGGAGGCT反向CTTGATCGGAGGCGATAGAAIGA33正向AGCTCGTCTTCCCCGTCTAC反向GAAGGTCGGGGAGGTGTTIGA34正向AGGCAGTTGCTCTCCGAGTA反向CCTTCGATGTAACAGTCCCTTIGA35正向GCTTGACATAGCTCAGCAGC反向CTCCGAACCTTGTTGGACTGIGA36正向CAAGAAGAAGCGCTACCACC反向CTTCAGCCGCTGCTTGTC
IGA37正向CAAGAACTGGTTCTCGAGCTATG反向CCTCAAAGCAGAATCACCATCIGA38正向TTCGTCCTCGTCAGGATCTC反向TTGCCATTAGGGTCCTTGA。
通用型引物與隨機引物不同，通用型引物在不同物種中錨定的擴增區(qū)域在進化上是同源基因。
本發(fā)明的通用型分子標記的開發(fā)方法，是針對已完成基因組測序及大量cDNA測序的動植物(如人類、水稻、擬南芥)的。由于IACGM標記是在基因序列中開發(fā)的，因此具有通用性好、特異性高等優(yōu)點，可應用于遺傳圖譜構建、基因同源克隆、遺傳多樣性分析、基因組研究等許多方面。


圖1是本發(fā)明的IACGM標記的開發(fā)路線示意圖；圖2是IACGM標記所用引物的設計方法示意圖。
具體實施例方式
參照上述附圖，對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。
實施例1、1、序列下載本發(fā)明利用國際水稻測序中心發(fā)布的粳稻品種Nipponbair的基因組序列數(shù)據(jù)和禾本科其它物種基因組序列數(shù)據(jù)，分別從TIGR網(wǎng)站(http//www.tigr.org)和NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.org)下載。此外，還利用已公布的水稻全長cDNA序列數(shù)據(jù)，從日本的KOME網(wǎng)站(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)下載。
2、序列分析用所有水稻候選ILP標記引物對小麥、大麥和玉米的cDNA/EST庫進行BLASTN搜索，選取錯配堿基數(shù)＜4的保守引物。
3、引物設計對初選的水稻ILP標記，進一步在其內(nèi)含子兩側的外顯子上用ePrimer3軟件重新設計引物，以提高引物的保守性。引物長度一般在18-25堿基之間，退火溫度一般在50-62℃之間。
所設計的引物具體由下列核苷酸序列組成


4、電子PCR對設計的引物在秈、粳稻基因組序列中進行了e-PCR檢驗，要求只產(chǎn)生單一擴增產(chǎn)物。由此即獲得候選的禾本科IACGM標記。
5、分類與命名
根據(jù)電子PCR的結果，我們將禾本科IACGM標記用IGAn表示，其中n為編號，如IGA16。每一個標記的名稱都是唯一的。
6、引物正確性和可行性的實驗驗證合成候選標記的引物，以粳稻品種Nipponbare和秈稻品種93-11為材料，剪取幼嫩葉片提取基因組DNA作為模板，按常規(guī)PCR程序進行擴增。退火溫度設定在50-62℃之間，循環(huán)35次。根據(jù)預測的擴增產(chǎn)物大小的不同，在瓊脂糖凝膠或非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，用紫外線照射或銀染顯帶。擴增結果與預期吻合的，說明引物設計是正確的和可行的。
7、引物通用性和多態(tài)性水平的檢驗選擇若干個不同屬或種的禾本科植物材料，用第6步獲得的引物，按第6步相同的方法進行實驗，觀察各個品種的擴增情況和差異條帶數(shù)目。在所有品種中皆有擴增產(chǎn)物，說明通用性好；差異條帶數(shù)多，說明多態(tài)性水平高。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種通用型分子標記的開發(fā)方法，包括利用已知物種的基因組序列數(shù)據(jù)，其特征是還包括以下步驟1)在已知一個物種A的內(nèi)含子長度多態(tài)性、即ILP的基礎上，借助生物信息學方法，將所述ILP所在的物種A與物種B的cDNA測序數(shù)據(jù)進行比對，在物種B的全基因組范圍內(nèi)搜索與該物種A的ILP所在cDNA同源的cDNA；所述物種B為物種A同科但不同屬的物種；2)PCR引物設計在多態(tài)內(nèi)含子兩側外顯子的保守序列上設計PCR引物，并通過電子PCR和實際PCR進行檢驗；從而開發(fā)出能夠在與物種A同科不同種或同科不同屬的物種內(nèi)，通過PCR進行檢測的通用型分子標記，即IACGM。
2.根據(jù)權利要求1所述的通用型分子標記的開發(fā)方法，其特征是所述物種為已具備基因組和cDNA測序數(shù)據(jù)的動物或植物。
3.采用權利要求1～2所述的開發(fā)方法所設計的禾本科通用型標記IACGM，以水稻作為物種A，其特征是所述IACGM的標記引物選自由下列核苷酸序列(5′→3′)組成的組IGA1正向CCGTCAACAAAGTTTGCTCC反向ATTGGACATGCTCTCCATCCIGA2正向AGCTCATCGACTCTGTGCTC反向GGGTACTCCTCTCTGATCTTGGIGA3正向CCTCGACGGCTTCTCCTT反向GCGCATTCCTTGTACAGCTCIGA4正向GACCTCAACAAGCTTGAGCC反向TGTCCTTGTGGCTGAAGAAGIGA5正向AGGAGTCCAGGGACATCATC反向GCACTTTGAACGGCACCTIGA6正向CGGCAGCTGCAAGTACATC反向GACTGCTCGTCGTACTCGTCIGA7正向GAGGTCGGCATCAAGAAGTT反向GTACGACTGCATCGTCGGIGA8正向AAGAAGAAGGAGAGGGCGAC反向AATCAAGCGAGAGTGCCAGTIGA9 正向GCCCCCGTATGGAACAAC反向CTCCCTGTCGAAGTTGGCIGA10正向GGGAGCTTGGAAAATCATCTG反向TGAAGGTAAGCTAGTCCTTTTGCIGA11正向GCACCACAGGAACCTCGTC反向GATTTTCCATCTTTGCTGCCIGA12正向TCCTCCACCACCAGCCAT反向GCGTCAGCATCTCGTTCAGIGA13正向GGAGCTGGAGGCGGTTAAG反向ACAATGTCGCGCTCGGTAGIGA14正向TCATATGGCTACATCGCCC反向GTGAGCACCTCCAGCACCIGA15正向AGAGCTATTGGTGCTGACAGA反向CAACAGTGGCTTACCACCATIGA16正向GCATGGACATACTCTATGAGTGC反向CCCATAGGGAAAGCAGGAAGIGA17正向GCTAAGGTGAACCTCCCCA反向TGTTGTCGCAGACGATCTTGIGA18正向ACCAGGAACGAGTACAACGG反向CTACTCCGGCGATCACGAIGA19正向AACACGCTCAACGTCAACCT反向CTCTGTCCACCACGCTGAAIGA20正向GACATGATGAAGACGGCAAA反向GAAGCAGCACACGTAGATGGIGA21正向GAGGTGCAGAGCGAGGTC反向TCTCCTTCTGCCCGTACTTGIGA22正向AGTTATCCAGGCTGGGCTGT反向AGCAATGCTCGCCTATCCTIGA23正向GACATGATGAAGACGGCAAA反向GAAGCAGCACACGTAGATGGIGA24正向CCATGCCGTACTGGTCATTC反向GTAGTCGATGTCCGTCCACAIGA25正向ATGTGCTTCCACCCTGACC反向GCCAATCTGCCTGTGCTTIGA26正向GGCCAAAATAATGGAAGATCG反向AGTGATGAAAGAGCAAGGCAIGA27正向ACCGCCCTAGTCCCAAAC反向ACAGAGTCAGCAAAGATGCGIGA28正向ACCCCTACGTGGTCTCCG反向CCACGTCGAGCTTCTCCCIGA29正向CGTCATCACCAAGGCTTACA反向TCCTGATCGGTCACATTGAAIGA30正向AACTTCATGGAGATCGGGC反向CCCTCCACGTAGCTGAACCIGA31正向CGTCGAGGACATGGACATC反向GACTCCGGCAGCTCACAGIGA32正向TGGGTATCATCAGGAGGCT反向CTTGATCGGAGGCGATAGAAIGA33正向AGCTCGTCTTCCCCGTCTAC反向GAAGGTCGGGGAGGTGTTIGA34正向AGGCAGTTGCTCTCCGAGTA反向CCTTCGATGTAACAGTCCCTTIGA35正向GCTTGACATAGCTCAGCAGC反向CTCCGAACCTTGTTGGACTGIGA36正向CAAGAAGAAGCGCTACCACC反向CTTCAGCCGCTGCTTGTCIGA37正向CAAGAACTGGTTCTCGAGCTATG反向CCTCAAAGCAGAATCACCATCIGA38正向TTCGTCCTCGTCAGGATCTC反向TTGCCATTAGGGTCCTTGA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通用型分子標記的開發(fā)方法，包括利用已知物種的基因組序列數(shù)據(jù)，還包括以下步驟1)在已知一個物種A的內(nèi)含子長度多態(tài)性、即ILP的基礎上，借助生物信息學方法，將ILP所在的物種A與物種B的cDNA測序數(shù)據(jù)進行比對，在物種B的全基因組范圍內(nèi)搜索與該物種A的ILP所在cDNA同源的cDNA物種B為物種A同科但不同屬的物種；2)PCR引物設計在多態(tài)內(nèi)含子兩側外顯子的保守序列上設計PCR引物，并通過電子PCR和實際PCR進行檢驗；從而開發(fā)出能夠在與物種A同科不同種或同科不同屬的物種內(nèi)，通過PCR進行檢測的通用型分子標記，即IACGM。利用本發(fā)明的開發(fā)方法，能設計出通用性好、特異性高、稱為基于內(nèi)含子長度多態(tài)性的擴增共有序列遺傳標記。
文檔編號C12Q1/68GK1769492SQ20051006085
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權日2005年9月22日
發(fā)明者吳為人, 盧泳全, 汪旭升 申請人:浙江大學