專利名稱：一對近江牡蠣體內(nèi)類立克次體 pcr檢測用的特異引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物的檢驗技術(shù)，具體涉及類立克次體微生物PCR檢測用的特異引物。
背景技術(shù)：
近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體被證明是引起近江牡蠣大規(guī)模死亡的重要病原微生物，目前還沒有有效的治療措施。為此，迫切需要建立針對近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體的快速、簡便、靈敏的檢測方法。以便在疾病發(fā)生前發(fā)現(xiàn)苗頭時，能及時在大規(guī)模死亡爆發(fā)前采取適當?shù)拇胧?，有助于降低由于大?guī)模死亡而造成的損失。PCR技術(shù)是一種簡便快捷準確的檢測方法，它可以很靈敏的檢測到只有幾個拷貝的基因的存在。套式PCR技術(shù)就是采取套嵌的引物組進行多次的PCR使得低豐度的基因在模版中的比例提高，從而更加靈敏的檢測出低豐度的基因。但PCR檢測技術(shù)的關(guān)鍵是要獲得特異的序列片斷，將這個片斷用作PCR擴增的特異引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供對近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體微生物進行PCR檢測用的特異引物。
細菌的16SrRNA目前在國際上被作為細菌分類的分子生物學(xué)依據(jù)，同時也作為PCR技術(shù)檢測微生物的主要目的片斷。由于16SrRNA本身不含有內(nèi)含子，因此可以通過直接擴增對應(yīng)的DNA模版獲得。在這里，這種模板被稱為16SrDNA。本發(fā)明人通過一系列的實驗獲得并驗證了近江牡蠣類立克次體16SrDNA的核酸序列。
近江牡蠣類立克次體16SrDNA核酸序列如下1 gcttaacaca tgcaagtcga gcggtaacag gaagagcttg ctctttgctg acgagcggcg61 gacgggtgag taacgcgtag gaatctgact gtaagagggg gatagcccgg agaaatccgg121 attaataccg cataacacct aagggtaaaa agaggcactt gtgctactgc ttacagagga181 gcctgcgttg gattagctag ttggtggggt aaaggcttac caaggcgacg atccatagct241 gctctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg301 cagcagtggg gaatattgca caatggggga aaccctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga361 agaaggcttt cgggttgtaa agcactttca gtggtgagga aaggtagtct gtgaataatg
421 ggctactgtg acgttagcca cagaagaagg accggcaaac tccgtgccag cagccgcggt481 aatacggagg gtccgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagggtgcg taggcggata541 tgtaagtggg tagtgaaaga cctgggctca acctgggagg tgctatccaa actgcataac601 tagagtacag aagaggagtg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga661 aggaacaccg gtggcgaagg cggcactctg gtctgatact gacgctgagg tacgaaagcg721 tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgctg tctactagtc781 gttgggaact taaaagtttt tagtggcgaa gcaaacgcgc taagtagacc gcctggggag841 tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat901 gtggtttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttacctggtt ttgacatcct cggaatggcg961 aagagatttg ccagtgcctt cgggagccga gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct1021 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc ttatttgcca1081 gcatgtaaag atgggaactc taaggagact gccggtgaca agccggagga aggtggggac1141 gacgtcaagt catcatggcc cttacgacca gggctacaca cgtgctacaa tggggcgtac1201 aaagggaagc gaagcggtga cgtggagcca aacctatcaa agcgcctcgt agtccggatc1261 gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcggtagt aatc結(jié)合生物信息學(xué)手段，從上述核酸序列中篩選出一對針對近江牡蠣體內(nèi)寄生的類立克次體的特異性引物。本套式PCR檢測近江牡蠣類立克次體的技術(shù)就是采用細菌通用引物進行第一次擴增，擴大細菌16SrDNA在模版中的豐度，然后采用近江牡蠣類立克次體特異引物進行檢測擴增。目的片斷的長度約為191bp。
具體實施例方式
取近江牡蠣的鰓組織0.1克，在液氮中研磨成粉狀。也可用其他方法粉碎組織。但據(jù)我們的實驗表明液氮研磨粉碎的效果最好。然后采用愛思進公司的細菌基因組提取試劑盒提取DNA。所取完整的方法步驟闡述如下(以下如非特殊說明，所用試劑均包括在愛思進細菌基因組提取試劑盒中)1、液氮研磨粉碎后的近江牡蠣鰓組織加入300μl已加入RNaseA1的Buffer S中。然后加入10μl的蛋白酶K，濃度為20mg/ml。購買自Takara公司。37℃下保溫25分鐘。然后加入溶菌酶10μl在37℃繼續(xù)消化5分鐘；2、加入60μl的0.25M的EDTA(pH8.0)混合均勻，然后在冰上放置五分鐘，終止酶的作用；3、加入900μl的buffer G-A，劇烈震蕩15秒，使溶液混合均勻。然后在65℃水浴中保溫10分鐘。時間長短可以根據(jù)實際情況具體調(diào)整，調(diào)整的依據(jù)就是溶液變得清澈透明，沒有懸浮的和沉淀的碎片；4、然后加入800μl的Buffer G-B和2ml的Buffer DV，順序一定不要弄錯，否則無法有效的分相。然后顛倒混勻。然后在離心機上12000×g離心2分鐘；5、棄掉上層的藍色液體，再加入2ml Buffer DV重復(fù)上述過程一次，然后將下層的液體轉(zhuǎn)移到濾器中，這個過程避免帶入上層的藍色液體。然后在12000×g離心30秒。過濾的作用是去除變性的蛋白；6、過濾后得到的清澈濾液約有1.2ml，然后加入800μl的Buffer BV輕輕震蕩混合均勻。然后加入DNA-prep管子中，12000×g離心30秒。DNA在這個過程中結(jié)合到了管子中的膜上；7、然后加入500μl的Buffer W1，12000×g離心30秒，洗一遍，700μl和500μl的BufferW2，12000×g離心30秒各洗一次。然后再12000×g離心一分鐘。徹底去除柱子中silica膜上的殘余液體。然后加入100μl純水，放置于55℃5分鐘，溶解結(jié)合在膜上的DNA，然后離心收集。這樣就獲得所需的模板DNA。即被稱為16SrDNA。
8、兩輪套式PCR所用的反應(yīng)體系均相同。同為25μl。具體成分和試劑來源如下10×Buffer(mg2+) 2.5μldNTP 1μlTaq酶(5U/μl) 0.4μl引物(10umol/L)各0.5μl模板 2μlH2O 18.6μl注Taq酶購買自Takara公司的rTaqTM，引物由上海生工公司合成。
9、第一輪PCR，采用細菌16SrDNA的通用引物。具體序列為正向5’-GCTTAACACATGCAAGTCGA-3’反向5’-GATTACTACCGATTCCGACT-3’
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性1分鐘，然后94℃變性30秒，56℃退火30秒，然后72℃延伸1分三十秒。擴增的目的產(chǎn)物條帶為1300bp左右。
10、第二輪PCR擴增種的模板由第一次擴增的產(chǎn)物稀釋十倍后，從中吸取2μl。獲得本發(fā)明所需要的近江牡蠣類立克次體16SrDNA特異引物，即用于檢測近江牡蠣體內(nèi)病原微生物的寡核苷酸。其序列為(1)正向5’-AGTCTGTGAATAATGGGCTA-3’反向5’-TTATGCAGTTTGGATAGCAC-3’反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1分鐘，然后94℃變性30秒，56℃退火30秒，然后72℃延伸30秒。擴增的目的產(chǎn)物條帶為200bp左右。
(2)、上述(1)引物，可以被添加或刪除一個或幾個單核苷酸，但不影響應(yīng)用于檢測病原微生物Oceanrickettsia ariakensis的PCR反應(yīng)；(3)也可取上述(1)引物的相似度在80％以上的引物，可用于檢測病原微生物Oceanrickettsia ariakensis.
11、由上述所得的反應(yīng)產(chǎn)物在1.8％瓊脂糖凝膠中電泳。然后溴化乙錠染色。選取發(fā)病海區(qū)的牡蠣作為陽性樣品，選取健康的，來自于非發(fā)病地區(qū)的野生近江牡蠣作為對照。拍照結(jié)果。如出現(xiàn)特意條帶，則說明牡蠣感染有這種病原微生物。
由此，人們必須采取適當措施，以防止或降低受到這種病原微生物感染的近江牡蠣的大規(guī)模死亡。
權(quán)利要求
1.一對近江牡蠣體內(nèi)類立克次體PCR檢測用的特異引物，其特征是該對序列為AGTCTGTGAATAATGGGCTA；TTATGCAGTTTGGATAGCAC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異引物，其特征是添加或刪除一個或幾個單核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異引物，其特征是相似度在80％以上的引物。
全文摘要
用于PCR檢測近江牡蠣病原微生物的特異引物。它是用于應(yīng)用PCR技術(shù)檢測寄生于近江牡蠣體內(nèi)的類立克次體這種病原微生物。本發(fā)明從近江牡蠣類立克次體16SrDNA的核酸序列中篩選出一對特異性引物，其序列為AGTCTGTGAATAATGGGCTA；TTATGCAGTTTGG ATAGC AC；上述引物，可以被添加或刪除一個或幾個單核苷酸，但不影響應(yīng)用于檢測病原微生物Oceanrickettsia ariakensis的PCR反應(yīng)；或與上述特異性引物相似度在80％以上的引物，且用于檢測病原微生物Oceanrickettsia ariakensis。
文檔編號C12Q1/68GK1814798SQ20051006185
公開日2006年8月9日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者吳信忠, 張揚 申請人:浙江大學(xué)