專利名稱：微生物法生產(chǎn)二羥基丙酮的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到從土壤中篩選分離到的兩株新的微生物，還涉及利用該兩種新的微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法。
背景技術(shù)：
二羥基丙酮，又稱為1，3-二羥基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone)，簡稱DHA，是最單的酮糖，帶有甜味的白色粉末狀結(jié)晶，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑。這種化學(xué)物質(zhì)的分子量為90.08。
DHA是一種重要的化工原料、醫(yī)藥中間體和食品添加劑，用途廣泛(1)DNA分子中含有三個官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一種重要的化學(xué)合成的中間體，也是一個重要的多功能試劑，如能有效地參與從甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)。(2)DHA廣泛應(yīng)用于化妝品中，能阻止皮膚的水份過度蒸發(fā)，對皮膚起到保濕和防曬作用，在制革工業(yè)中，DHA可作為皮革制品的保護(hù)劑。(3)DHA是一種重要的醫(yī)藥中間體和藥物，現(xiàn)已應(yīng)用于低血糖和糖尿病及某些皮膚病的治療。(4)DHA可作為一種食品添加劑，廣泛用于食品生產(chǎn)。
由于DHA用途廣泛，市場容量大，用微生物法甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的研究具有重要的意義。
國外用微生物法轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮己有很多專利和文獻(xiàn)報道，用于生產(chǎn)二羥基丙酮的微生物主要是葡糖桿菌屬(Gluconobacter)(US5770411)和醋桿菌屬(Acetobacter)(US 4076589)微生物，尤其是氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋桿菌(AcebobacterSuboxydans)的報道居多，此外還研究過芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草桿菌(Bacillus subtilis FERM P-10524)(JP 2286089)、單孢絲菌屬(Micromonospora)(JP 62210994)，假單孢菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克霉伯氏菌屬(Klebsiella)、歐文藝節(jié)目氏菌屬(Erwinia)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)(US4576913)。
國內(nèi)報道的微生物法生產(chǎn)二羥基丙酮所用的菌種為弱氧化醋酸桿菌(Acebobacter Suboxydans)(食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(6)22-26)和葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter suboxydans)(CN 1687434)。
微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)DHA與化學(xué)合成法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、底物利用率高、轉(zhuǎn)化率高、生產(chǎn)工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)。從技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性，環(huán)境的友好性的角度來看，微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA更具有經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。而且生物轉(zhuǎn)化技術(shù)已日趨成熟，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類物質(zhì)的生產(chǎn)，如抗生素、甾體激素、氨基酸等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從土壤中篩選到將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮的新的微生物菌株；其次是提供一種利用該新微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法。
本發(fā)明提供的兩株新的微生物菌株屬于酵母，菌株1特征如下菌落形態(tài)菌落表面濕潤，油狀，顏色黃白，菌落呈圓形，四周光滑，中央微微凸起，菌落質(zhì)地均勻，邊緣圓整。
細(xì)胞形態(tài)圓形，橢圓形。
18s rDNA序列分析以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物P15′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和P25′-TCC TCC GCT TAT TGATAT GC-3′擴(kuò)增菌株的18S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接，經(jīng)測序確認(rèn)該片段實(shí)際長度為382bp，將該序列(已提交GenBank，GenBank登記號為DQ223426)與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，該菌與葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)的同源性最高(homology，98.43％/382bps，based on 18s rDNA)。生理生化鑒定結(jié)合分子鑒定，可確認(rèn)該菌株屬于棒孢酵母屬(Clavispora)的葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。該菌株己于2005年10月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC No.M 205116。
本發(fā)明從土壤中篩選到的新的菌株2特征如下菌落形態(tài)菌落表面濕潤，油狀，顏色黃白，菌落呈圓形，四周光滑，中央微微凸起，菌落質(zhì)地均勻，邊緣圓整。
細(xì)胞形態(tài)圓形，橢圓形。
18s rDNA序列分析以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物P15′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和P25′-TCC TCC GCT TAT TGATAT GC-3′擴(kuò)增菌株的18S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體經(jīng)測序確認(rèn)該片段實(shí)際長度為447bp，將該序列(已提交GenBank，GenBank登記號為DQ223427)與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，該菌與膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)的同源性最高(homology，98.54％/477bps，based on 18s rDNA)。生理生化鑒定結(jié)合分子鑒定，可確認(rèn)該菌株屬于畢赤酵母屬(Pichia)的膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)。該菌株己于2005年10月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC No.M 205117。
根據(jù)以上微生物學(xué)特征，這兩個新的菌株被鑒定屬于葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，和膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)菌株，這兩個兩株不屬于上述已公開專利菌種的任何一種，這兩株微生物菌株具有將甘油轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮的能力，可以用于二羥基丙酮的生產(chǎn)。
本發(fā)明所用到的原料是一種廣泛應(yīng)用工業(yè)化學(xué)品——甘油(丙三醇)，甘油2位羥基(2-OH)經(jīng)過微生物細(xì)胞內(nèi)甘油脫氫酶催化反應(yīng)，生成酮基，得到二羥基丙酮。
用該微生物生產(chǎn)二羥基丙酮的方法如下本發(fā)明的新的微生物葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)CCTCCNo.M 205116或膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)CCTCC No.M205117與含碳源、氮源、無機(jī)鹽的培養(yǎng)基，底物為甘油，進(jìn)行發(fā)酵，分離發(fā)酵中的二羥基丙酮，并進(jìn)行提純。
本發(fā)明的培養(yǎng)基組成為(w/v，％)甘油0.5％～12％，酵母粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.1％～2.0％，(NH4)2SO40％～1.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.8％，MgSO40.01％～0.1％，CaCO30.1％～0.4％，以自來水配制，pH值4.0～7.0。
該培養(yǎng)基中的甘油，也可以用甘露醇替代。
用本發(fā)明的新的菌株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)生產(chǎn)DHA，其方法有(1)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后的菌種葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116或膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)，CCTCC No.M 205117，斜面或用種子液接種，進(jìn)行培養(yǎng)，通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為4.0～7.0，以接近中性較好，培養(yǎng)時間為24h～72h較好，其中以48h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳。在發(fā)酵過程中，pH值用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類調(diào)節(jié)控制。該方法中培養(yǎng)基組成中的甘油既是微生物利用的碳源，又是被微生物轉(zhuǎn)化的底物；底物甘油經(jīng)過微生物的脫氫反應(yīng)，生成DHA。
(2)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后菌種葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116或膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，CCTCC No.M 205117，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為4.0～7.0，以接近中性較好；在培養(yǎng)過程中流加微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物——甘油，可以在菌體剛開始生長的時候流加，也可以在菌體生長了一段時間后，即在菌體生長對數(shù)期后再進(jìn)行流加，流加的速度可以根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，培養(yǎng)時間為48h～120h較好，其中以72h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳；在發(fā)酵過程中，pH值的變化用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類調(diào)節(jié)控制，制得發(fā)酵產(chǎn)物。
(3)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后菌種葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116或膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，CCTCC No.M 205117，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件通常選擇溫度在20℃～40℃，以25℃～35℃較好，初始pH為4.0～7.0，以接近中性較好；培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期，進(jìn)行離心分離，得到菌體；將得到的菌體加入底物甘油，底物甘油濃度為0.5％～15.0％，反應(yīng)時間為1h～100h較好，其中以24h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳；在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中，pH值的變化用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類調(diào)節(jié)控制。
從發(fā)酵液提取目標(biāo)產(chǎn)物時，可采用常規(guī)的發(fā)酵產(chǎn)物提取法。如過濾、離心、沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、濃縮、干燥、冷凍干燥，吸附、離子交換、層析等等。
具體的提取方法如下采用體積比為95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油醚濕法裝柱，在高徑比10～40∶1，洗脫流速1mL/min～10mL/min，加樣量為柱床體積3％～10％時，其濃縮物中甘油和二羥基丙酮分離效果較好。收集含二羥基丙酮段樣品，進(jìn)行真空濃縮，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色二羥基丙酮結(jié)晶。
二羥基丙酮的分析方法采用氣相色譜與薄層層析方進(jìn)行二羥基丙酮薄層層析方法。實(shí)驗采用G型硅膠板(20mm×10mm)，展開劑氯仿-甲醇-蒸餾水混合溶劑(體積比為80∶19∶1)，顯色劑組成為磷鉬酸3g，甲醇45mL，蒸餾水45mL和濃硫酸10mL。具體操作步驟將點(diǎn)樣后的硅膠薄板以基準(zhǔn)線向下放置在裝有展開劑的層析缸中展開10～15min，直至展開劑擴(kuò)散至距離薄板頂端1～2cm處。取出薄板，吹干，碘缸中熏蒸2～5min，顯色，放入烘箱中，在110℃下烘烤10min左右，即可呈現(xiàn)二羥基丙酮斑點(diǎn)，通過和不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品顯示的斑點(diǎn)大小相比較，判斷樣品中二羥基丙酮含量。
DHA氣相色譜分析方法所用的儀器瓦里安varian cp-3800氣相色譜儀，帶氫火焰離子化檢測器；PY-2020iD型裂解器(Frontier LaboratoriesLtd.Japan)。所用試劑TMAH(25％水溶液)，二羥基丙酮(色譜純)，甘油、無水甲醇(分析純)，蒸餾水。色譜條件Ultra ALLOY-5不銹鋼毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；汽化溫度400℃；檢測器溫度280℃；柱溫50℃開始以1℃/min升至60℃，再以10℃/min升至280℃；分流比30∶1；載氣，氮?dú)?；柱流?mL/min。加樣0.2μL發(fā)酵上清夜和0.4μLTMAH(25％水溶液)。
本發(fā)明的微生物菌株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)，不僅能在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，而且對甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)的能力較強(qiáng)；利用葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitania)或膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)生產(chǎn)二羥基丙酮，在較佳工藝條件下，甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％～90％，(即1摩爾的甘油能轉(zhuǎn)化為0.50～0.90摩爾的二羥基丙酮)，本發(fā)明的微生物菌株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)或膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)適用于二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方案下面實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例中采用的微生物為葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitania)ZHB-05571菌株，CCTCC No.M 205116。
實(shí)施例1培養(yǎng)基配方(重量kg/體積L百分比，以下同)甘油1.0％，酵母粉0.8％，蛋白胨0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.01％，用自來水配制，用HCl溶液將pH調(diào)到4.0，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取100mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在2個250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
取2L上述培養(yǎng)基，平均分裝入40個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為1.5％(v/v，即同單位體積比，以下同)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)時間為72h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
收集上述發(fā)酵液1.5L，經(jīng)過離心(10000×g，10min)之后，上清液濃縮至500mL，在55℃下活性炭脫色30min，然后真空濃縮至漿狀，加入適量無水乙醇混勻，真空濃縮去乙醇，反復(fù)加入乙醇三次，濃縮至無乙醇為止，濃縮物備用。
上述濃縮物通過裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離濃縮物中的二羥基丙酮和甘油，采用95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油醚濕法裝柱，在高徑比35∶1，洗脫流速2mL/min，加樣量為柱床體積5％時，其濃縮物中甘油和二羥基丙酮分離效果較好。收集含二羥基丙酮段樣品，進(jìn)行真空濃縮，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色二羥基丙酮結(jié)晶，冷凍干燥后得到0.95g二羥基丙酮。
實(shí)施例2培養(yǎng)基配方甘油8.0％，酵母粉2.0％，蛋白胨0.5％，(NH4)2SO40.1％，NaH2PO4·2H2O0.8％，MgSO40.1％，CaCO30.4％，用自來水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為50h，反應(yīng)在通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液400mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到1.26克DHA。
實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基配方甘油12％，酵母粉2％，蛋白胨2％，(NH4)2SO40.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.02％，CaCO30.1％，用自來水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
種子培養(yǎng)基配方甘油1.0％，酵母提取粉1％，蛋白胨0.1％，MgSO40.05％，用自來水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
取100mL種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，在30℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
取4L發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝在80個500mL三角瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為2％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為72h，反應(yīng)在通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液3.5L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到13.4克DHA。
實(shí)施例4培養(yǎng)基配方甘油1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，(NH4)2SO40.2％，NaH2PO4·2H2O0.5％，MgSO40.01％，CaCO30.2％，用自來水配制，pH7.0，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基6.0L，滅菌，接入種子液100mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在接種后，開始流加濃度為50％(V/V)的甘油1.0L，流加速度0.2mL/min；培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間為84h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min。
收集上述發(fā)酵液6L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到11.32克DHA。
實(shí)施例5培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母提取粉2％，蛋白胨1％，(NH4)2SO41％，NaH2PO4·2H2O0.8％，MgSO40.01％，用自來水配制，pH6.5，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7L，滅菌，接入種子液100mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在菌體生長到對數(shù)期時(發(fā)酵20h后)進(jìn)行流加濃度為50％甘油1L，流加速度0.3mL/min；培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為96h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min。
收集上述發(fā)酵液7L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到34.51克二羥基丙酮。
實(shí)施例6培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉2.0％，蛋白胨0.2％，(NH4)2SO40.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，再加入CaCO30.1％，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL濃度為0.5％的甘油溶液中，利用菌體對甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)；反應(yīng)條件溫度28℃，初始pH為6.5，反應(yīng)時間為24h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.35克DHA。
實(shí)施例7培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，(NH4)2SO40.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，CaCO30.1％，用自來水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 205116，培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL濃度為12％的甘油溶液中，利用菌體中的酶生物催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮；反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為5.0，反應(yīng)時間為48h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到2.77克DHA。
以下實(shí)施例中采用的微生物為膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)菌株ZJB-05389，CCTCC No.M 205117實(shí)施例1培養(yǎng)基配方(重量/體積百分比，以下同)甘油1.0％，酵母粉0.8％，蛋白胨0.1％，KH2PO40.1％，MgSO40.01％，用自來水配制，用HCl溶液將pH調(diào)到4.0，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取100mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在2個250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
取2L上述培養(yǎng)基，平均分裝入40個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為1.5％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為50h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
收集上述發(fā)酵液1.5L，經(jīng)過離心(10000×g，10min)之后，上清液濃縮至500mL，在55℃下活性炭脫色30min，然后真空濃縮至漿狀，加入適量無水乙醇混勻，真空濃縮去乙醇，反復(fù)加入乙醇三次，濃縮至無乙醇為止，濃縮物備用。
上述濃縮物通過裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離濃縮物中的二羥基丙酮和甘油，采用95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油醚濕法裝柱，在高徑比35∶1，洗脫流速2mL/min，加樣量為柱床體積5％時，其濃縮物中甘油和二羥基丙酮分離效果較好。收集含二羥基丙酮段樣品，進(jìn)行真空濃縮，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色二羥基丙酮結(jié)晶，冷凍干燥后得到1.15g二羥基丙酮。
實(shí)施例2培養(yǎng)基配方甘油10％，酵母提取粉2.0％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.2％，MgSO40.05％，CaCO30.4％，用自來水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為50h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液400mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到1.42克DHA。
實(shí)施例3培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，kH2PO40.1％，MgSO40.01％，CaCO30.2％，用自來水配制，自然pH，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基6.0L，滅菌，接入種子液100mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在接種后，開始流加濃度為50％(V/V)的甘油1.0L，流加速度0.2mL/min；培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間為84h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min。
收集上述發(fā)酵液6L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到11.32克DHA。
實(shí)施例4培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母提取粉2％，蛋白胨1％，kH2PO40.3％，MgSO40.01％，用自來水配制，pH6.5，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7L，滅菌，接入種子液100mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在菌體生長到對數(shù)期時(發(fā)酵20h后)進(jìn)行流加濃度為50％甘油1L，流加速度0.3mL/min；培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為96h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min，pH值控制在6.0，用HCl和NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。
收集上述發(fā)酵液7L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到38.26克DHA。
實(shí)施例5培養(yǎng)基配方甘露醇4％，酵母粉2.0％，蛋白胨0.2％，KH2PO40.1％，MgSO40.01％，用自來水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，培養(yǎng)菌體(24h)到對數(shù)生長期后期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL濃度為0.5％的甘油溶液中，利用菌體對甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)；反應(yīng)條件溫度28℃，初始pH為6.5，反應(yīng)時間為24h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.39克DHA。
實(shí)施例6培養(yǎng)基配方甘露醇4％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，KH2PO40.1％，MgSO40.01％，用自來水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 205117，培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL濃度為12％的甘油溶液中，利用菌體中的酶生物催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮；反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為5.0，反應(yīng)時間為48h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到2.85克DHA。
權(quán)利要求
1.一種利用從土壤中篩選分離到新的微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其特征是所述的微生物是棒孢酵母屬(Clavispora)的葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116或畢赤酵母屬(Pichia)的膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)，CCTCC No.M205117，葡萄牙棒孢酵母或膜醭畢赤酵母與含碳源、氮源、無機(jī)鹽的培養(yǎng)基，底物為甘油，進(jìn)行發(fā)酵，然后分離發(fā)酵中的二羥基丙酮，并進(jìn)行提純。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組成，重量kg/體積L的百分比，為甘油或甘露醇0.5％～12％，酵母粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.1％～2.0％，(NH4)2SO40％～1.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.8％，MgSO40.01％～0.1％，CaCO30.1％～0.4％，以自來水配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵液的分離、提純步驟為采用體積比為95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動相，使用石油醚濕法裝柱，在高徑比10～40∶1，洗脫流速1mL/min～10mL/min，加樣量為柱床體積3％～10％，收集含二羥基丙酮段樣品，進(jìn)行真空濃縮，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色二羥基丙酮結(jié)晶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入CCTCCNo.M 205116或CCTCC No.M 205117的斜面或種子液接種，進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)條件溫度20℃～40℃，初始pH為4.0～7.0，培養(yǎng)時間為24h～72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是培養(yǎng)條件溫度28℃～35℃，初始pH為7.0，培養(yǎng)時間為48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入菌種CCTCC No.M 205116或CCTCC No.M 205117的斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件溫度在20℃～40℃，初始pH為4.0～7.0，培養(yǎng)時間為48h～120h，培養(yǎng)過程中，在菌體剛開始生長的時候開始流加入微生物反應(yīng)的底物甘油；或在菌體生長對數(shù)期后再進(jìn)行流加入微生物反應(yīng)的底物甘油。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是培養(yǎng)條件溫度28℃～35℃，初始pH為7.0，培養(yǎng)時間為72h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入菌種CCTCC No.M 205116或CCTCC No.M 205117，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件溫度在20℃～40℃，初始pH為4.0～7.0，培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期，進(jìn)行離心分離，得到菌體，將得到的菌體加入到底物甘油溶液中，利用菌體轉(zhuǎn)化底物甘油，底物甘油濃度為0.5％～15.0％，反應(yīng)時間1h～100h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是培養(yǎng)條件溫度28℃～35℃，初始pH為7.0，反應(yīng)時間為24h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用新的微生物生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，涉及的微生物是棒孢酵母屬(Clavispora)的葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，CCTCC No.M 205116或畢赤酵母屬(Pichia)的膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，CCTCC No.M 205117，通過利用這種微生物生產(chǎn)二羥基丙酮，在較佳工藝條件下，甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％～90％。本發(fā)明的微生物菌株適用于二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/645GK1821418SQ200510061969
公開日2006年8月23日 申請日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者鄭裕國, 胡忠策, 柳志強(qiáng), 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)