專利名稱：一種與肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，以及在肥厚型心肌病嚴(yán)重程度診斷方面的用途。
背景技術(shù)：
早在19世紀(jì)中葉，法國人A.Vulpian就在鏡下觀察并描述了肥厚型心肌病，但是直到20世紀(jì)50年代后期，肥厚型心肌病獨(dú)特的臨床特點(diǎn)才被系統(tǒng)地論述。它通常以不對稱的左和/或右心室肥厚為特征，可累及心室的不同部位，尤以心室間隔為著，左室容積可正?；驕p少。典型的形態(tài)學(xué)改變?yōu)榧±w維排列紊亂。臨床表現(xiàn)為呼吸困難、心絞痛及暈厥，心律失常、猝死亦常見。肥厚型心肌病以往被認(rèn)為是一種少見的心臟疾病，但Maron等進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，年輕人的發(fā)病率達(dá)0.2％[1]。肥厚型心肌病有50％以上為常染色體顯性遺傳，稱家族性肥厚型心肌病(FHC)。分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，編碼肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的基因突變是家族性肥厚型心肌病的根本病因[2、3]。
肌小節(jié)是心肌收縮的基本單位，主要由粗、細(xì)肌絲兩部分組成。粗肌絲主要為肌球蛋白(myosin)和肌球蛋白連接蛋白C(MyBPC)，前者包括兩條肌球蛋白重鏈(MHC)和兩對輕鏈——必需/堿性輕鏈(MELC，MLC-1)及調(diào)節(jié)/磷酸化輕鏈(MRLC，MLC-2)。細(xì)肌絲包括肌動蛋白(actin)、α-原肌球蛋白(α-Tm)和肌鈣蛋白復(fù)合體(TnT，TnC，TnI)。此外，肌小節(jié)成分還有肌連蛋白(titin)等。
目前，已證實(shí)13個基因160多個位點(diǎn)的突變與FHC的發(fā)病有關(guān)，其中有10種是編碼肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的基因，絕大部分突變位于這些基因[4](表1)。
表1.家族性肥厚型心肌病致病基因的發(fā)生頻率及突變類型

分子遺傳學(xué)的研究初步揭示了FHC的異質(zhì)性特點(diǎn)，不僅存在基因型的異質(zhì)性即多種基因多種突變可以導(dǎo)致FHC，而且存在表型的異質(zhì)性即外顯率、心肌肥厚的程度、不適癥狀、心源性猝死、心律失常、預(yù)后等也因人而異。這種異質(zhì)性尤其是表型的異質(zhì)性引起了研究者的興趣，同時也是急需解決的難題之一。目前考慮與下列因素有關(guān)①突變引起的肌小節(jié)的功能損害程度在不同突變位置與突變蛋白類型間有顯著差異；②環(huán)境因素及后天獲得性特質(zhì)(如生活方式不同、各種風(fēng)險因素的存在及活動等)對表型的影響；③修飾基因和/或多肽性的存在，干擾了突變基因的表達(dá)，影響了疾病的臨床表型。其中修飾基因已引起越來越多的注意。修飾基因的研究策略之一是基于大樣本人群的病例對照研究，SNP因在基因組中分布廣，正逐漸成為遺傳多態(tài)標(biāo)記中的新寵。截至2003年8月24日，NCBI已收錄SNP已達(dá)1,729,779，其中證實(shí)的有548,734個。如此大量SNP信息資源為開展HCM的病例對照關(guān)聯(lián)研究提供了極大便利，使得能夠花費(fèi)較少的人力，物力通過關(guān)聯(lián)分析從眾多候選基因中尋找修飾基因和易感遺傳因素。通過候選HCM修飾基因SNP與HCM臨床表型(包括左室肥厚，左室重量，左室內(nèi)徑，左房內(nèi)徑，左室游離壁厚度，左室射血分?jǐn)?shù)，左室縮短比數(shù)等)的關(guān)聯(lián)研究可以達(dá)到以下目的1尋找HCM的修飾基因，探討HCM發(fā)病機(jī)制，為HCM的干預(yù)，治療提供靶點(diǎn)；2明確修飾基因?qū)εR床表型的影響；3與HCM臨床表型相關(guān)聯(lián)的SNP可以作為表記，進(jìn)行HCM的危險分層；4可以將修飾基因的SNP與致病基因突變篩查相結(jié)合，預(yù)測患者的臨床與預(yù)后，并為開展個性化治療奠定基礎(chǔ)。
目前獲得的修飾基因影響疾病臨床表型的證據(jù)之一是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶插入/缺失多肽性的影響較對照人群而言，D等位基因更加普遍地存在于肥厚型心肌病病人及高猝死率病人中。在排除MYBPC3突變的MYH7的403位點(diǎn)突變攜帶者身上，發(fā)現(xiàn)D等位基因與心肌肥厚有相關(guān)性，從而提出家族性肥厚型心肌病(FHC)的多基因修飾概念。
本發(fā)明中通過對肥厚型心肌病病人進(jìn)行基因型篩查，發(fā)現(xiàn)了肌球蛋白連接蛋白C(cMyBPC)基因中存在的新的多態(tài)性位點(diǎn)，它們與肥厚型心肌病病人中心肌肥厚程度相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了cMYBPC基因中新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了可用于檢測這一核苷酸多態(tài)性的寡核苷酸，以及利用這樣的寡核苷酸檢測該多態(tài)性的方法。本發(fā)明提供了利用這樣的核苷酸多態(tài)性確定肥厚型心肌病預(yù)后或嚴(yán)重程度或者藥物篩選或評估的方法。本發(fā)明另外涉及微陣列。


圖1顯示了cMYBPC基因中第18443位點(diǎn)處存在的A/G多態(tài)性測序圖。該位點(diǎn)在第30外顯子，GAA密碼子編碼氨基酸序列的第1096位的谷氨酸(E)，這個氨基酸位點(diǎn)C10 Ig結(jié)構(gòu)域，密碼子最后一個核苷酸A→G，其編碼的氨基酸并沒有改變。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，術(shù)語“樣品”是指來源于人類個體的任何生物學(xué)樣品，包括但不限于例如細(xì)胞，組織樣品如機(jī)體軟組織例如骨組織、毛發(fā)等，生物學(xué)流體如淋巴液、血液、唾液、尿液和其它機(jī)體排泄液等。術(shù)語“分離的”意指非天然存在的?！胺蛛x的核酸”指并不與其所來源的個體基因組中相鄰的5’和/或3’側(cè)翼序列相毗鄰的核酸。因此，“分離的核酸”也包括插入載體內(nèi)的核酸，摻入異源細(xì)胞的基因組內(nèi)的核酸，或者以獨(dú)立體存在的核酸。該術(shù)語還包括與其它核酸序列相連接的重組核酸。這樣的重組核酸可能用于生產(chǎn)融合蛋白。
在本發(fā)明中，野生型cMYBPC基因指的是現(xiàn)有技術(shù)中已知的cMYBPC基因，其序列以Genbank登錄號giY10629公開在Genbank數(shù)據(jù)庫中，在本發(fā)明中以SEQ ID NO2表示。在該序列中，第30個外顯子內(nèi)的第18443位核苷酸殘基為A。該等位基因在本發(fā)明中被稱作等位基因A。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，在該核苷酸殘基位點(diǎn)處的核苷酸殘基還可以是G，這樣的等位基因在本發(fā)明中被稱作等位基因G，也稱作cMYBPC變體基因。因此，對于cMYBPC基因的第18443位殘基而言，cMYBPC基因存在三種基因型A/A、A/G和G/G。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種cMYBPC變體基因或其片段，其在對應(yīng)于Genbank登錄號giY10629(SEQ ID NO2)所列序列中的第18443位核苷酸殘基處含有G而不是A。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體基因或片段中還含有額外的突變，包括任何已知的或?qū)慝@知的突變或核苷酸多態(tài)性。
本發(fā)明還涉及由上述變體基因或片段衍生的mRNA或cDNA。
本發(fā)明還涉及可以區(qū)分上述野生型cMYBPC基因和變體基因或其包含第18443位核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的片段或者由其衍生的mRNA或cDNA或者它們的互補(bǔ)序列的核酸，例如寡核苷酸。這樣的核酸可以不同的能力與等位基因A或其片段和等位基因G或其片段發(fā)生雜交，例如僅與其中之一發(fā)生雜交，從而辨別出該位點(diǎn)處存在的核苷酸殘基。該核酸可作為探針或引物用于特異性檢測人類個體中的上述多態(tài)性。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員均清楚，探針一般具有與目的核酸的序列互補(bǔ)、并與包含待檢測多態(tài)性的核酸特異性雜交的序列。該寡核苷酸一般定位于突變位點(diǎn)周圍，特異性地檢測樣品中上述突變的存在與否。優(yōu)選地，所述核酸或其互補(bǔ)序列中含有上文所定義的核苷酸多態(tài)性。作為例示，寡核苷酸引物或探針可設(shè)計(jì)成待檢測的多態(tài)性位點(diǎn)位于其5’或3’末端或者在中間，或者待檢測的多態(tài)性位點(diǎn)位于該引物或探針的互補(bǔ)序列的5’或3’末端或者在中間。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“特異性檢測”是指該寡核苷酸只與包含上文定義的等位基因之一或其片段或互補(bǔ)序列發(fā)生雜交，而不與另一等位基因或其片段或互補(bǔ)序列的核酸發(fā)生雜交。
寡核苷酸探針或引物可設(shè)計(jì)成使得18443位多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的整個或部分包含在探針或引物的核苷酸序列中。這樣，有可能利用由此制備的寡核苷酸作探針通過雜交或差異雜交的存在與否來確定18443位多態(tài)性位點(diǎn)處存在的核苷酸殘基，或者作為引物通過擴(kuò)增并隨后檢測多態(tài)性情況。這種檢測可通過多種方法進(jìn)行，包括例如測序、限制性酶切等?；蛘撸梢詫⑻结樆蛞镉每蓹z測標(biāo)記標(biāo)記上，從而可以很容易地區(qū)分開不同的等位基因。由于第18443位核苷酸殘基為A時在該位點(diǎn)附近沒有SacI酶切位點(diǎn)，而第18443位核苷酸殘基為G時形成了SacI酶切位點(diǎn)。因此，可通過SacI限制性內(nèi)切酶的切割而將這兩種等位基因區(qū)分開。
寡核苷酸探針或引物一般長度大于約10bp，例如10-100個核苷酸，優(yōu)選地，其長度為15-75個核苷酸，更優(yōu)選18-50個核苷酸，尤其優(yōu)選為20-35個核苷酸，最優(yōu)選為23-30個核苷酸。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以很容易設(shè)計(jì)出合適的寡核苷酸探針或引物，用于多態(tài)性位點(diǎn)的檢測。至于其制備，則可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，包括但不限于例如化學(xué)合成法等。優(yōu)選地，探針/引物是被可檢測標(biāo)記的，以便于檢測。標(biāo)記可以是例如生物素、熒光染料、放射性同位素等，但并不限于此。它們是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并可通過常規(guī)方法連接到探針/引物上。該核酸可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。
在本領(lǐng)域中眾所周知，可利用引物通過添加游離核苷酸而延伸核酸序列。雜交指的是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸序列發(fā)生選擇性結(jié)合。在本文中，嚴(yán)謹(jǐn)條件是僅允許引物與含多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因之一的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交，而不與另一等位基因的核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的條件。依照所使用的引物，普通技術(shù)人員可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定相應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。在這方面有眾多的現(xiàn)有技術(shù)可供參考，包括例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約。
本發(fā)明還涉及利用設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增后將得到包含多態(tài)性位點(diǎn)的片段的引物進(jìn)行突變檢測。所述引物一般定位于多態(tài)性位點(diǎn)周圍或者其5’或3’方向1000bp、優(yōu)選500bp、更優(yōu)選250bp、尤其優(yōu)選200bp、最優(yōu)選100bp的范圍內(nèi)，其長度一般大于約10bp，優(yōu)選為15-100bp，更優(yōu)選為18-75bp，尤其優(yōu)選為20-50bp，最優(yōu)選為25-40bp。
還可以在本發(fā)明的寡核苷酸序列5’和/或3’末端連接一些額外的核苷酸序列。這樣的寡核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
利用這樣的寡核苷酸，通過對來自人類個體的遺傳材料進(jìn)行擴(kuò)增和隨后分析，可以確定所述人類個體中cMYBPC基因第18443位核苷酸殘基位點(diǎn)的等位基因類型。例如，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后用溴化乙錠、SYBR綠色溶液、諸如此類染色，從而以條帶(DNA片段)的形式檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。由此，可以以DNA片段的形式檢測包含所述多態(tài)性位點(diǎn)的基因片段。除了瓊脂糖凝膠電泳以外，也可以進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳。進(jìn)一步地，可以分離擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后通過測序或者限制性酶切分析多態(tài)性位點(diǎn)的類型。還有可能使用預(yù)先經(jīng)諸如熒光染料等物質(zhì)標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。還可以采用不需要電泳的檢測方法；在這種方法中，將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到固體支持物諸如微型板上，并通過熒光、酶反應(yīng)、諸如此類等手段來檢測目的DNA片段。
本發(fā)明提供了檢測上述核苷酸多態(tài)性的方法，包括應(yīng)用上文所述寡核苷酸探針或引物檢測生物學(xué)樣品，或者應(yīng)用設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增后將得到包含該突變的片段的引物對擴(kuò)增該生物學(xué)樣品并進(jìn)行檢測的步驟。在檢測中，通常應(yīng)用待測個體的生物學(xué)樣品，例如其血液，但并不限于此。在一個實(shí)施方案中，直接應(yīng)用該生物學(xué)樣品進(jìn)行檢測。例如，利用上述核酸作為引物，通過PCR法擴(kuò)增包含待檢測多態(tài)性位點(diǎn)的片段。在另一個實(shí)施方案中，在檢測前首先從該生物學(xué)樣品分離遺傳材料，例如基因組DNA，但并不限于此。檢測可通過例如核酸雜交、PCR法、測序法、限制性片段長度多態(tài)性測定法等方法常規(guī)進(jìn)行，但并不局限于這些方法。其條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的，或可非常容易地確定。優(yōu)選地，使用如上所述制備的寡核苷酸作為引物，用DNA聚合酶擴(kuò)增編碼包含待檢測多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段?；蛘?，將如上所述制備的探針與模板DNA雜交，從而檢測那些具有感興趣核苷酸多態(tài)性的DNA?？梢砸勒粘Ｒ?guī)方法來制備模板DNA，如氯化銫梯度離心、SDS裂解法、或酚/氯仿抽提。
本發(fā)明還涉及一種微陣列，其中含有上述寡核苷酸探針或引物。該寡核苷酸可以固定在固相支持物上。在一個實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片、基因芯片、微型芯片、珠陣等的形式。DNA芯片是將很多種DNA探針排列并固定在基片例如玻璃片上，然后在上面進(jìn)行標(biāo)記DNA的雜交、通過檢測探針上的標(biāo)記信號而可區(qū)分地檢測完全匹配和核苷酸錯配，由此對核酸進(jìn)行檢測。芯片的常規(guī)制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明還涉及可用于檢測上述核苷酸多態(tài)性的試劑盒，其中包括一種或多種相關(guān)的診斷性引物或探針和/或可區(qū)分18443位核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)處的上述多態(tài)性的寡核苷酸引物，例如前文所述的寡核苷酸探針或引物。試劑盒中還可包括容器、使用說明書、緩沖液、酶和/或其它反應(yīng)成分。優(yōu)選地，其中還包含陽性對照和陰性對照，以便進(jìn)一步確認(rèn)檢測結(jié)果。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含用于預(yù)定測定法的任何和所有成分酶或成分。這些成分的實(shí)例包括但不限于寡核苷酸、聚合酶(如Taq聚合酶)、緩沖液(如Tris緩沖液)、dNTP、對照試劑(如組織樣品、用作陽性和陰性對照的靶寡核苷酸、等)、標(biāo)記和/或檢測試劑(熒光染料諸如VIC、FAM)、固體支持物、說明書、例示性圖表和/或產(chǎn)品信息、抑制劑等。本發(fā)明的試劑盒可以是只包含部分必需成分的部分試劑盒。在這種情況中，使用者可以提供其余成分。本發(fā)明的試劑盒可以包含兩個或多個分開的容器，每個都包含將要使用的部分成分。例如，在試劑盒中，第一個容器包含酶，而第二個容器包含寡核苷酸。酶的具體實(shí)例包括適當(dāng)保存緩沖液或容器中的結(jié)構(gòu)特異性切割酶。
本發(fā)明還涉及確定肥厚型心肌病患者中心肌肥厚嚴(yán)重性的方法，包括對個體的體外樣品檢測cMYBPC基因中第18443位核苷酸殘基處的多態(tài)性。優(yōu)選地，檢測步驟是按照前文所述多態(tài)性檢測方法進(jìn)行的。例如，使用位于多態(tài)性位點(diǎn)上下游的寡核苷酸首先對包含待檢測的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測可通過例如PCR法、測序法、限制性片段長度多態(tài)性等進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及利用上述cMYBPC變體基因作為靶點(diǎn)篩選或評估藥物的方法，包括例如對在cMYBPC變體基因第18443位核苷酸位點(diǎn)處含有G/G基因型的細(xì)胞、組織、器官或動物個體給予一種或多種藥物，并評估其一個或多個指示肥厚型心肌病狀況的指標(biāo)，包括例如心肌厚度，以指示疾病改善狀況。操作對象可以是個體，例如小鼠?；蛘?，操作對象也可以是細(xì)胞，例如人的心肌細(xì)胞。這樣，可以在個體或細(xì)胞水平上對藥物進(jìn)行篩選或評估。
下面以實(shí)施例的方式對本發(fā)明作出說明。這些實(shí)施例都是示范性的，它們不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 基因組DNA的提取1研究對象的選擇研究對象為在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院診斷明確的門診就診或住院的肥厚型心肌病病人，共100例，經(jīng)家族調(diào)查無血緣關(guān)系。其中包括肥厚型心肌病家系先證者51人，相關(guān)家系成員356人，散發(fā)病例49人。正常研究對照120例為性別、年齡匹配的健康人。入選者填寫《分子遺傳學(xué)研究病例調(diào)查表》，內(nèi)容包括病人聯(lián)系方式、個人一般情況、臨床癥狀、體檢結(jié)果、家族史調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖(必要時Holter)，胸片報告，超聲心動圖報告(必要時需心臟MRI或左室及冠脈造影結(jié)果)。建立資料數(shù)據(jù)庫。肥厚型心肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WHO/ISFC 1996年公布)(1)基本標(biāo)準(zhǔn)超聲心動圖診斷的原因不明的心臟左室壁厚度大于或等于13mm；或心尖部肥厚或右室肥厚。
(2)參考標(biāo)準(zhǔn)心電圖左室高電壓表現(xiàn)，伴/不伴II、III、avF、avL及V4V5導(dǎo)聯(lián)病理性Q波及ST-T改變。
(3)排除標(biāo)準(zhǔn)長期高血壓、缺血性心肌病及其他可引起心室肥厚的原發(fā)性疾病。
(4)家族性肥厚型心肌病確定標(biāo)準(zhǔn)有心肌病的家族遺傳傾向，即病人(先證者)家族中有多人發(fā)病，并符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。
2基因組DNA的分離取患者肘靜脈血5ml，EDTA(0.5M)抗凝，2500rpm離心10min。小心吸取上層血漿，用1.5ML的Eppendorf管分裝。在血細(xì)胞中加入3倍體積的溶血液(NH4Cl 8.29g、KHCO31.0g、EDTA-Na20.03734g，加雙蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.4)，搖勻，冰浴15min。2500rpm離心10min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。3000rpm離心10min，棄上清，得到白細(xì)胞，直接用于提取基因組DNA，或者于-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 如下提取基因組DNA取白細(xì)胞，加4.5ml SE(NaCl 4.383g、EDTA-Na29.306g加雙蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)PH值為8.0)，使勁吹打，混勻。沿管壁加入0.5ml的10％SDS，然后加蛋白酶E(100mg/ml，MilliQ水)50μl，首尾輕搖10min，混勻，然后于37℃水浴過夜。第二天取出，沿管壁加3ml飽和NaCl，迅速手搖15s，使蛋白變性析出，然后于4000rpm離心10min。取上清，轉(zhuǎn)入另一管中，加等體積的三氯甲烷，搖10min，混勻。2500rpm離心10min。取上清，轉(zhuǎn)入另一管中，加等體積的三氯甲烷，搖10min，混勻。2500rpm離心10min，取上清，轉(zhuǎn)入50ml管中，加3倍體積無水乙醇后，首尾輕搖，見DNA絮狀沉淀析出。將DNA挑至管壁，用75％乙醇洗滌2遍。將DNA挑至0.5ml管中，凍干。最后加TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，調(diào)節(jié)PH為8.0)300μl，使DNA溶解，紫外分光光度計(jì)測OD值定量，4℃保存。
實(shí)施例2 PCR法檢測肌球白連接蛋白C(cMYBPC)基因中的多態(tài)性為檢測肌球蛋白連接蛋白C(cMYBPC)基因中的多態(tài)性，進(jìn)行了PCR，其中所用引物及擴(kuò)增條件如下表2所示(基因組序列來自Genebank database，登陸號為Y10629)表4


按照表4中的PCR條件對各患者或?qū)φ盏幕蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并按照實(shí)施例2的方法分離擴(kuò)增產(chǎn)物并對其測序。由此篩選出來的基因突變列于表5中。
表1.引物及擴(kuò)增條件(MYBPC3，giY10129)

PCR反應(yīng)基本體系(50μl)引物(濃度20pmol/μl) 1μl10×buffer(含Mg2+) 5μlTaqDNA聚合酶(2u/μl) 1μldNTP(10mM)1μl人基因組DNA 1μl消毒雙蒸水41μl(3)按上述配制反應(yīng)體系，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，吸取2μl PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定，顯示得到了預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物。
4.PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序前純化將50μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物同其6倍體積的無水乙醇與5M醋酸胺(5∶1)混合溶液混合，置于-80℃30分鐘以上，然后于14,000rpm、4℃離心15分鐘，棄去上清，向沉淀中加入200μl的75％酒精，于14,000rpm、4℃離心5分鐘，吸上清棄去。將沉淀室溫或冷凍干燥后，加入20μl TE溶解，并取吸2μl等分試樣經(jīng)2％瓊脂糖凝膠(0.5×TBE緩沖液配制)電泳進(jìn)行定量。
5.末端雙脫氧法測序配制如下反應(yīng)體系(20μl)BigDyeTM 4μlBigDyeTM緩沖液2μl 引物(10pmol/μl) 2μl
按照如下進(jìn)行PCR測序反應(yīng)(根據(jù)引物的退火溫度而定)94℃ 2min 4℃ 保存或94℃2min 4℃ 保存反應(yīng)完成后，進(jìn)行測序產(chǎn)物的純化向20μl產(chǎn)物中加25μl醋酸銨(5M)和125μl乙醇，置-70℃1小時，然后14,000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀制加入75％乙醇100μl，于14,000rpm離心5分鐘，棄上清。將沉淀于95℃1分鐘烤干后，加入2μl上樣緩沖液，混勻，于94℃變性5分鐘，然后迅速置于冰上。將純化后的測序反應(yīng)產(chǎn)物在ABI PRISM377自動測序儀上測序，并在IMAC 333計(jì)算機(jī)上用AssemblyLIGNTM、Sequencing Analysis 3.4軟件進(jìn)行測序結(jié)果的分析。
結(jié)果顯示，cMYBPC基因第30號外顯子中的第18443位核苷酸殘基處存在A/G多態(tài)性。該位點(diǎn)位于第30個外顯子內(nèi)，GAA密碼子編碼氨基酸序列第1096位的谷氨酸(E)，這個氨基酸位于C10 Ig結(jié)構(gòu)域，密碼子最后一個核苷酸A→G，其編碼的氨基酸并沒有改變。為了對進(jìn)一步的肥厚型心肌病患者中的此核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，設(shè)計(jì)了如下引物F1 5’-CCC AAC CCA CAG CTC ACA-3’；R5’-CCC TTC CTG ATG CCG AGA-3’。以F1、R為引物，對患者和正常人的基因組DNA按下述條件擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(20μl)
引物(20pmol/μl)0.4μl10×buffer(含Mg2+)2μlTaqDNA聚合酶(2u/μl)0.5μldNTP(10mM) 0.4μl人基因組DNA 0.2μl消毒雙蒸水 16.5μlPCR反應(yīng)條件95℃5min

72℃10min4℃ 保存經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出了預(yù)期的約463bp片段。其中，A等位基因的擴(kuò)增片段中沒有SacI的酶切位點(diǎn)，而G等位基因的擴(kuò)增片段中有SacI酶切位點(diǎn)。因此，以SacI對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切可以區(qū)分這兩種等位基因，其中前者可以見到463bp的片段，而后者為183bp和240bp的兩條片段。
對226位HCM患者及176位正常人進(jìn)行上述測定，結(jié)果如下

在入選的226例HCM患者和226例對照中，我們觀察了該位點(diǎn)不同基因型的頻率，并比較了不同基因型的HCM患者心肌肥厚的程度。結(jié)果見表2。cMYBPC基因18443A/G多態(tài)位點(diǎn)不同基因型在HCM患者和正常對照組的分布頻率無明顯差別(p＞0.05)。攜帶GG基因型的HCM患者肥厚心肌的厚度(25.2±5.9mm)大于攜帶AG，AA基因型(18.9±4.98mm，p＜0.01)的HCM患者。同時我們也觀察比較了攜帶不同基因型的HCM患者其他臨床表型(發(fā)病年齡、暈厥、ECG變化、SAM征、LVDD、LADD)，結(jié)果未見顯著差別。以上結(jié)果說明cMYBPC基因的18443A/G多態(tài)位點(diǎn)不同的基因型能夠?qū)е翲CM患者不同程度的心肌肥厚，提示cMYBPC基因不僅是HCM的致病基因，而且還是影響心肌肥厚程度的修飾基因。
權(quán)利要求
1.一種分離的cMYBPC變體基因或者其片段，其在對應(yīng)于Genbank登錄號giY10629列出的序列(SEQ ID NO2)中的第18443位殘基處含有G而不是A。
2.權(quán)利要求1的分離的cMYBPC變體基因或者其片段，其中還包含額外的突變或核苷酸多態(tài)性。
3.一種核酸，其可與權(quán)利要求1或2的cMYBPC變體基因或片段或者其互補(bǔ)序列特異性雜交，但不能與SEQ ID NO2所示基因或其互補(bǔ)序列的核酸雜交。
4.權(quán)利要求3的核酸，其長度為10-100個核苷酸，優(yōu)選為15-75個核苷酸，更優(yōu)選為18-50個核苷酸，尤其優(yōu)選為20-35個核苷酸，最優(yōu)選為23-30個核苷酸。
5.權(quán)利要求4的核酸，其中所述18443位核苷酸殘基位點(diǎn)位于該核酸的5’末端或3’末端或中間。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的核酸，其中所述探針被可檢測性標(biāo)記上，例如被生物素、熒光染料、放射性同位素等標(biāo)記上。
7.一種試劑盒，其中包含權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的核酸，以及使用說明書。
8.一種確定cMYBPC基因中第18443位核苷酸殘基處的核苷酸多態(tài)性的方法，包括應(yīng)用權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的核酸作為探針或引物檢測生物學(xué)樣品，或者應(yīng)用設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增后將得到包含該多態(tài)性位點(diǎn)的片段的引物對擴(kuò)增該生物學(xué)樣品并進(jìn)行檢測的步驟。
9.一種微陣列，其中包含權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的核酸。
10.一種篩選或評估藥物的方法，包括對在cMYBPC基因中第18443位核苷酸殘基處包含G或A殘基的細(xì)胞、組織、器官或動物個體給予一種或多種藥物，并評估其一個或多個指示肥厚型心肌病狀況的指標(biāo)，例如心肌肥厚程度，以指示疾病改善狀況。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，以及在肥厚型心肌病嚴(yán)重程度診斷方面的用途。
文檔編號C12N15/10GK1847257SQ200510062988
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者惠汝太, 鄒玉寶, 王萍, 王虎, 宋雷, 宋曉東, 甄一松 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院