專利名稱：一種E.aero菌株中編碼1,3－丙二醇氧化還原酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程、酶工程、微生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)1，3-丙二醇(簡稱1，3-PD)的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes，簡寫為E.aero)菌株(2001年1月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 0532，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，還涉及該菌株中編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因(dhaT)。
背景技術(shù)：
1，3-PD微生物發(fā)酵法生產(chǎn)可分為一步法和二步法。一步法是指以玉米糖為底物經(jīng)工程菌直接轉(zhuǎn)化為1，3-PD；二步法是指以玉米糖為底物先經(jīng)酵母菌轉(zhuǎn)化為甘油，而后再以甘油為底物經(jīng)厭氧微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為1，3-PD。1，3-PD微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的研究始于20世紀90年代初期，此期間主要研究二步法中甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD菌株選育，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生1，3-PD的微生物菌株有Klebsiella、Citrobacter、Clostridium Lactobacillus、Enterobacter、Ilyobacter和Pelobacter，Klebsiella pneumoniae(簡稱K.pneu)和Clostridium butyricum(簡稱C.but)是研究最多的菌株(Barbirato，F(xiàn).，1995；Slaugh，1995)，這些微生物將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD時需2步酶催化反應(yīng)。第一步，甘油脫水酶將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛(3-HPA)和1分子水(1)；第二步，3-羥基丙醛在1，3-PD氧化還原酶的作用下形成1，3-PD(2)。
(1)(2)在此反應(yīng)過程中形成的1，3-PD不再被代謝，而是在培養(yǎng)液中高度聚集。甘油歧化形成1，3-PD是在厭氧條件下，且甘油作為唯一碳源并缺少其它的外源還原當(dāng)量受體的情況下完成的。在這些條件下，甘油歧化的同時還存在并列路徑，它們是甘油脫氫酶(與NAD+或NADP+偶聯(lián))將甘油氧化成二羥丙酮(DHA)(3)，而后二羥丙酮在二羥丙酮激酶催化下轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮(DHAP)(4)；繼而DHAP進入糖酵解途徑。與1，3-PD生成路徑相比，此途徑可(3)(4)提供碳源和能量并產(chǎn)生NADH。90年代中期以后，主要側(cè)重于研究1，3-PD產(chǎn)生機理、用基因工程方法構(gòu)建一步法生產(chǎn)1，3-PD高產(chǎn)工程菌，目前處于構(gòu)建階段。
近年來，隨著分子生物學(xué)理論的不斷發(fā)展，基因工程技術(shù)的不斷成熟，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-PD基因工程技術(shù)的研究已經(jīng)開始。Tong.H(1991)和Daniel.R(1995)等研究發(fā)現(xiàn)，K.pneu能在含甘油的培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生1，3-PD，是由于其基因上帶有dha調(diào)節(jié)子。不帶有dha調(diào)節(jié)子系統(tǒng)的E.coli，由于沒有外源電子受體，不能在甘油上厭氧生長也不能產(chǎn)生1，3-PD。他們在E.coli AG1中構(gòu)建了K.pneu ATCC25955基因文庫，使得E.coli AG1能在甘油和二羥丙酮上厭氧生長，并篩選出高產(chǎn)1，3-PD的菌株，從分離出的pTC1重組質(zhì)粒(全長42.5kb)上發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒擁有dha調(diào)節(jié)子所指導(dǎo)的四種酶基因甘油脫水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫氫酶(dhaD)和二羥丙酮激酶(dhaK)。這四種酶都是受甘油的存在與否誘導(dǎo)的。Frank A.Skraly(1998)等研究發(fā)現(xiàn)，在K.pneu的天然DNA中，控制1，3-PD產(chǎn)生的基因主要有dhaT和dhaBdhaB基因——編碼甘油脫水酶；dhaT基因——編碼1，3-PD氧化還原酶，dhaT和dhaB實際上由兩個不同的啟動子的控制下及在不同的方向轉(zhuǎn)錄(圖1)。
K.pneu DNA片段核苷酸序列分析(圖1)表明，在這個片段中含有dhaB(3a，4a，4)和dhaT(2)基因的ORFs，但dhaT和dhaB基因的轉(zhuǎn)錄方向是相反的。
在1，3-PD分批發(fā)酵生產(chǎn)中，1，3-PD的最大產(chǎn)量是50～60g/L，在常規(guī)的連續(xù)培養(yǎng)中，C.but只能獲得K.pneu菌株1，3-PD最大產(chǎn)量(大約為48.75g/L)的一半，但由于前者是病原菌而逐漸被淘汰，鑒于C.but菌株的安全性，在國外它是最具有工業(yè)使用潛力的菌株。但C.but菌株生產(chǎn)1，3-PD的產(chǎn)量較低，需要篩選具有安全性且1，3-PD高產(chǎn)的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的具有安全性且1，3-PD高產(chǎn)的菌株，該菌株是從沈陽淡水湖淤泥中分離的產(chǎn)氣腸桿菌(E.aero)，經(jīng)物理、化學(xué)方法單獨誘變及物理和化學(xué)復(fù)合誘變，選育出的一株1.3-PD高產(chǎn)突變株，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 0532。該菌株的1，3-PD產(chǎn)量已經(jīng)超過了C.but菌株的生產(chǎn)能力，在最適發(fā)酵條件下，30L發(fā)酵罐中CGMCC 0532菌株1，3-PD產(chǎn)量為48.56g/L，且該菌株為兼氣性，是一株很有研究價值和應(yīng)用潛力的菌株。
本發(fā)明的另一目的是提供一種分離的dhaT基因，其來源于上述的產(chǎn)氣腸桿菌1.3-PD高產(chǎn)突變株CGMCC 0532菌株。經(jīng)測定，該dhaT基因如SEQ ID NO1所示，全長為1164bp，是以ATG起始密碼子開始，TGA終止密碼子結(jié)束。該dhaT基因編碼387個氨基酸的蛋白質(zhì)，如SEQ IDNO2所示，所表達的蛋白質(zhì)分子量為43KDa，所表達蛋白質(zhì)的酶活為39μM/mg。
具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
提供一種生產(chǎn)1，3-丙二醇(1，3-PD)的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes，簡寫為E.aero)菌株，其保藏號為CGMCC 0532。
提供一種分離的編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
提供一種由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶，其具有如SEQID NO2所示的氨基酸序列。
提供一種分離的編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因，其編碼具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
提供一種具有編碼1，3-丙二醇氧化還原酶活性的基因，其為編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基因的一個或幾個核苷酸發(fā)生取代、缺失、置換或插入后所獲得的基因。
提供一種重組載體，其包含上述的基因。
提供一種由上述基因或者由上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。


圖1表示K.pneu DNA片段核苷酸序列分析圖，在這個片段中含有dhaB(由3a、4a和4所示的3段基因組成)和dhaT(如2所示)基因的ORFs，dhaT和dhaB基因的轉(zhuǎn)錄方向是相反的。
圖2表示CGMCC 0532菌株基因組DNA電泳圖，其中M表示DNA標準λ-Hin d III(Kb)，A表示CGMCC 0532菌株基因組DNA。
圖3表示質(zhì)粒載體pMD18-T的酶切圖譜。
圖4表示表達載體pMAL-c2X的酶切圖譜。
圖5表示構(gòu)建的融合基因表達載體pMC58的酶切圖譜。
圖6表示SDS-PAGE電泳圖，其中A表示誘導(dǎo)細胞，B表示純化的融合蛋白，C表示純化的dhaT蛋白，D表示未誘導(dǎo)細胞，M表示蛋白標準(kDa)。
具體實施例方式
實施例1CGMCC 0532菌株基因組DNA提取將本發(fā)明所述的CGMCC 0532菌株活化后，接種至8ml LB液體培養(yǎng)基(組分濃度為1％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl)中，30℃培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)過夜的液體種子，按3～5％的接種量接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。將上述菌液在4℃下離心10000rpm，10～15min，棄上清液。收集的菌體用2ml無菌純水懸浮，在4℃下、離心5000rpm，10min，棄上清液，重復(fù)此操作二次。在收集的菌體中，加入400μl無菌純水，在震蕩器上振蕩懸浮，加入100μl溶菌酶(10mg/ml)，使終濃度達到2mg/ml，在37℃超級恒溫水浴中，恒溫30min。加入30μl 20％的SDS，使終濃度達到1％。加入蛋白酶60μl(20mg/ml)，使終濃度達到2mg/ml。加無菌純水，使最終體積達到600μl。加入1μlRNaseA(40mg/ml)，37℃恒溫水浴3h。采用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)溶液處理三次。再用20μl無菌純水或TE溶液(組分濃度為100Mm Tris-HCl，10mM EDTA)溶解，即獲得CGMCC 0532菌株的基因組DNA溶液。
對CGMCC 0532菌株基因組DNA的純度及完整性檢測如下取上述5μl DNA溶液稀釋至200μl，用紫外分光光度計測量260nm、280nm的OD值，并用1％的瓊脂糖凝膠電泳在260～280V，30mA的電壓下快速檢測CGMCC 0532菌株DNA的完整性。實驗結(jié)果，OD260/OD280＝1.9＞1.8，說明提取到高純度的CGMCC 0532菌株基因組DNA；電泳結(jié)果表明提取到的CGMCC 0532菌株基因組DNA是完整的(圖2)。在圖2中，M表示DNA標準λ-Hind III(Kb)，A表示CGMCC 0532菌株基因組DNA。
實施例2dhaT基因PCR克隆1.PCR法克隆dhaT基因1.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)K.pneu菌株的dhaT基因(如SEQ ID NO3所示)，設(shè)計并合成用于dhaT基因擴增的寡核苷酸引物，在上游引物的5′端設(shè)計了Hind III酶切位點，下游引物的5′端設(shè)計了EcoR I酶切位點。
PCR引物dhaT F 5′-AAG CTTATG AGC TAT CGT ATG TTT GAT TAT CTG-3′(SEQ ID NO4)dhaT R 5′-G AAT TCT CAG AAT GCC TGG CGG AAA AT-3′(SEQ ID NO5)1.2PCR克隆dhaT基因用LA TaqTM、pyrobest Taq、EX TaqTM試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號分別為DRR002A或DRR002B；DR005A或DR005B；DRR001A或DRR001B或DRR001C)，以CGMCC 0532菌株基因組DNA為模板，dhaTF/dhaTR為引物，作PCR。
第一PCR反應(yīng)體系dNTP(各0.5mM)8μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，10×LA緩沖液5μl，基因組DNA 2μl，引物dhaT R(0.5μM)0.5μl，引物dhaT F(0.5μM)0.5μl，加無菌純水至50μl。
反應(yīng)條件起始解鏈溫度為94℃，時間為1min；在隨后的每個循環(huán)節(jié)中，解鏈在98℃10s，退火在50～55℃30～45s，延伸在72℃1～2min，共計30～35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存在4℃。
第二PCR反應(yīng)體系dNTP(各0.5mM)8μl，LATaq DNA聚合酶0.5μl，10×LA緩沖液5μl，基因組DNA 2μl，引物dhaT R(0.5μM)0.5μl，引物dhaT F(0.5μM)0.5μl，加無菌純水至50μl。
反應(yīng)條件起始解鏈溫度為94℃，時間為1min；在隨后的每個循環(huán)節(jié)中，解鏈在98℃10s，退火在55℃30s，延伸在72℃1min，共計30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存在4℃。
1.3PCR擴增出的dhaT基因直接測序以dhaT seqF和dhaT seqR為引物進行測序。
dhaT seqF5′-CCG ATT TCC CGT ATA TGG-3′(SEQ ID NO6)dhaT seq R5′-TGG TGT CTT TAG GGT TTG-3′(SEQ ID NO7)測得的序列如SEQ ID NO1中所示。
2.dhaT基因克隆至pMD18-T載體并測序2.1dhaT基因插入片段的調(diào)整a.以上述PCR產(chǎn)物為模板，dhaT F/dhaT R為引物，800μl LA Taq DNA聚合酶反應(yīng)體系PCR擴增dhaT基因。
b.將PCR產(chǎn)物用乙醇濃縮，25μl無菌純水溶解沉淀，加入25μl 3M NaAc和2.5倍體積無水冷乙醇，于-80℃冰箱中保存20min，4℃離心13500rpm 15～20min，棄上清液，將沉淀部分用TE溶液或無菌純水溶解。
c.片段回收DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，再用NaI回收。
d.片段純化采用乙醇、聚乙二醇或異丙醇純化。
2.2連接將純化后的DNA片段與酶切(Hind III/EcoR I)精制后的pMD18-T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號為D504A或D504B或D504C，該產(chǎn)品結(jié)構(gòu)如圖3)用DNA連接酶連接。本發(fā)明中使用DNA連接試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號為D2050)。
反應(yīng)體系為pMD18-T 1μl，DNA 3μl，連接緩沖液5μl，加無菌純水至10μl。
反應(yīng)條件為16℃，1h。
2.3轉(zhuǎn)化將連接液全部熱轉(zhuǎn)化(或電擊轉(zhuǎn)化)至大腸桿菌JM109(購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號為D3050)中。
2.4檢驗用pMD18-T載體上引物RV-M(如SEQ ID NO8所示)和PCR引物dhaT R，采用PCR方法進行檢驗。
PCR檢驗第一反應(yīng)體系為dNTP 4μl，LA緩沖液2.5μl，引物RV-M 0.5μl，引物dhaTR0.5μl，LATaq 0.5μl，菌液10μl，加無菌純水至25μl。反應(yīng)條件起始解鏈溫度為94℃，時間為1min；在隨后的每個循環(huán)節(jié)中，解鏈在98℃10s，退火在55℃30s，延伸在72℃1min，共計30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存在4℃。
PCR檢驗第二反應(yīng)體系為dNTP 8μl，2X GC緩沖液25μl，引物RV-M 0.5μl，引物dhaTR0.5μl，LA Taq 0.5μl，菌液10μl，加無菌純水至50μl。反應(yīng)條件與PCR檢驗第一反應(yīng)體系的條件相同。
2.5植菌PCR檢驗有目的帶的菌落挑取少量，植入3ml LB培養(yǎng)基中，37℃160～200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
2.6質(zhì)粒提取具體操作方法采用《分子克隆實驗指南》，第二版，薩姆布魯克等，1998。介紹的堿裂解法進行。
2.7測序以pMD18-T載體的測序引物RV-M(如SEQ ID NO8所示)和M13-47(如SEQ ID NO9所示)進行測序。經(jīng)測得，pMD18-T載體測序和dhaT基因PCR產(chǎn)物直接測序的結(jié)果完全相同。
實施例3dhaT基因表達以pMAL-c2X質(zhì)粒(購于New England Biolabs公司，產(chǎn)品編號為E8000S，結(jié)構(gòu)見圖4)構(gòu)建了融合基因表達載體pMC58(結(jié)構(gòu)見圖5)。測序結(jié)果表明，pMC58表達載體上的dhaT基因為全長dhaT基因。
在1升LB培養(yǎng)基中，按1％的接種量接入含有pMC58的大腸桿菌JM109的培養(yǎng)物，加入IPTG使終濃度達到0.4～0.8mM，malE基因和dhaT基因構(gòu)成的融合基因表達的融合蛋白；經(jīng)SDS-PAGE電泳表明融合蛋白分子量為85KDa，表達電泳結(jié)果(見圖6，B帶)。圖6中A誘導(dǎo)細胞，B純化的融合蛋白，C純化的dhaT蛋白，D未誘導(dǎo)細胞，Mh(kDa)200，160，97，4，66，45，ML(kDa)97，4，66，45，31，21.5，14.5。
實施例4dhaT基因表達的蛋白質(zhì)的分離與純化以購自New England Biolabs的pMAL-c2X融和蛋白純化系統(tǒng)純化dhaT蛋白，malE基因和dhaT基因構(gòu)成的融合基因表達的融合蛋白分子量為85KDa；純化的融合蛋白經(jīng)FactorXa酶切，經(jīng)離子交換層析分離得到了dhaT基因表達的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳表明蛋白質(zhì)分子量為43KDa(見圖6，C帶)。
實施例5dhaT基因表達的蛋白質(zhì)的酶活測定25℃時，分光光度計法測定365nm，1，3-PD氧化還原酶將三羥基丙醛轉(zhuǎn)化為1，3-PD起始NADH的消耗量。酶活定義為，每分鐘NADH消耗微摩爾數(shù)。
實驗結(jié)果表明dhaT基因表達的蛋白質(zhì)的酶活為39μM/mg。
序列表<110>遲乃玉<120>一種E.aero菌株中編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因<130>1，3-丙二醇氧化還原酶<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1164<212>DNA<213>Enterobacter aerogenes<400>1atgagctatc gtatgtgcga ttatctggtg ccaaatgtga acttgcctgg cccgaatgct 60atgcccgttg tcggcgaacg ctgcaaactg ttgggcggta aaaaagcgct gctggtgact 120gataaaggtc tgcgaattat taaggacggc gcggttgata aaacgctcga acatctgcgt 180gaagccttta ttgacgtggt ggtgtttgac ggattcgagc caaacattaa agacaccaac 240gtgcgcgacg gcctggacgt ttgtcgtaaa gagcagtgcg atatcatcgt taccgtcggc 300ggtggtagcc cgcatgactg cggtaaaggc atcggtatcg cggcgacgca cgaaggcgat 360ctctatagct atgccatgat tgaaaccctg accaatccgc tgccgccgat cgtcgcggtg 420aataccaccg ccagtaccgc cagcgaagtc acccgtcact gcttgctgac caataccaaa 480accaaagtga agtttgtgat tgtcagttgg cgaaacctgc cgtcggtttc cattagtgac 540cctctgctga tgctcggcaa acctgcgcca ctgactgcgg caacaggaat ggacgccctg 600acccacgccg ttgaggccta tatttcaaaa gatgccaacc cggttaccga cgccgccgct 660atccaggcaa ttcgtctgat cgcccgcaac ttacgccagg ccgtagcact gggcagcaac 720ctgaaagctc gcgagaatat ggcctatgcc tctttgctgg cgggtatggc cttcaacaac 780
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Ile Ala Ala Thr His Glu Gly Asp Leu Tyr Ser Tyr Ala Met Ile Glu115 120 125Thr Leu Thr Asn Pro Leu Pro Pro Ile Val Ala Val Asn Thr Thr Ala130 135 140Ser Thr Ala Ser Glu Val Thr Arg His Cys Leu Leu Thr Asn Thr Lys145 150 155 160Thr Lys Val Lys Phe Val Ile Val Ser Trp Arg Asn Leu Pro Ser Val165 170 175Ser Ile Ser Asp Pro Leu Leu Met Leu Gly Lys Pro Ala Pro Leu Thr180 185 190Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Val Glu Ala Tyr Ile195 200 205Ser Lys Asp Ala Asn Pro Val Thr Asp Ala Ala Ala Ile Gln Ala Ile210 215 220Arg Leu Ile Ala Arg Asn Leu Arg Gln Ala Val Ala Leu Gly Ser Asn225 230 235 240Leu Lys Ala Arg Glu Asn Met Ala Tyr Ala Ser Leu Leu Ala Gly Met245 250 255Ala Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln260 265 270Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Met Met His Gly Val Ala Asn Val Val Leu275 280 285Leu Pro His Val Ala Arg Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Pro Glu Lys Phe290 295 300Ala Asp Ile Ala Glu Phe Met Gly Glu Asn Thr Asp Gly Leu Ser Thr305 310 315 320Met Asp Ala Ala Glu Leu Ala Ile Arg Ala Ile Ala Arg Leu Ser Ala325 330 335Asp Ile Gly Arg Pro Gln His Leu Arg Glu Leu Gly Val Lys Glu Ala340 345 350
Asp Phe Gln Tyr Met Ala Glu Met Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe355 360 365Ser Asn Pro Arg Lys Gly Asn Glu Lys Glu Ile Ala Glu Ile Phe Arg370 375 380Gln Ala Phe385<210>3<211>1164<212>DNA<213>Klebsiella pneumoniae<400>3atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctgggcggga aaaaagccct gctggtcacc 120gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggttgata aaaccctgca ttatctgcgg 180gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540ccactgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgct tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840
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1.一種生產(chǎn)1，3-丙二醇(1，3-PD)的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes，簡寫為E.aero)菌株，其保藏號為CGMCC 0532。
2.一種分離的編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種由權(quán)利要求2所述的基因編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的編碼1，3-丙二醇氧化還原酶的基因，其編碼具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一種具有編碼1，3-丙二醇氧化還原酶活性的基因，其為權(quán)利要求4所述基因的一個或幾個核苷酸發(fā)生取代、缺失、置換或插入后所獲得的基因。
6.一種重組載體，其包含權(quán)利要求4或5所述的基因。
7.一種由權(quán)利要求4或5所述基因或者由權(quán)利要求5所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明是提供一種分離的編碼1，3－丙二醇氧化還原酶的基因(dhaT)，其來源于一種保藏號為CGMCC 0532的產(chǎn)氣腸桿菌1.3－PD高產(chǎn)突變株。該dhaT基因全長為1164bp，是以ATG起始密碼子開始，TGA終止密碼子結(jié)束。該dhaT基因編碼387個氨基酸的蛋白質(zhì)，所表達的蛋白質(zhì)分子量為43KDa，所表達蛋白質(zhì)的酶活為39μM/mg。
文檔編號C12N15/63GK1746292SQ20051006304
公開日2006年3月15日 申請日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者遲乃玉, 張慶芳 申請人:遲乃玉