專利名稱：梨樹病毒一步rt－pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及梨樹病毒一步RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
目前檢測和鑒定果樹病毒的傳統(tǒng)方法是指示植物法、血清學(xué)方法，經(jīng)過幾十年篩選，國際上已經(jīng)確認(rèn)了成套標(biāo)準(zhǔn)指示植物。該法對鑒定目前已知的果樹病毒來說，雖然可靠性高，但所需時間較長，并且費土耗地，血清學(xué)方法較指示植物法檢測果樹病毒的靈敏性和檢測速度大大提高，特異性增強，但該方法因果樹病毒的抗血清制備困難而致使檢測成本高，并且很多果樹病毒因未能制備抗血清而無法使用該方法。80年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為果樹病毒的研究堤供了一種前所未有的新途徑。比起指示植物法和血清學(xué)方法該技術(shù)檢測病毒的靈敏性更高、特異性更強、速度更快，關(guān)于果樹病毒分子檢測試劑盒及其檢測方法尚沒有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梨樹病毒一步RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
本發(fā)明的內(nèi)容是；檢測梨樹病毒的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括上游引物梨環(huán)紋花葉病毒5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，蘋果莖溝病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脈黃病毒 5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，蘋果莖溝病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脈黃病毒5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTTGTTGGT---3′，上述上游引物、下游引物的濃度為0.0009mmol/L；1#液，研磨緩沖液含有6000mmol/L鹽酸胍、200mmol/L醋酸鈉、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液，含有10％十二烷基硫酸納，30mL，3#液，含有6000mmol/L碘化鈉溶液，10mL，4#液，含有乙醇，5mL，5#液，含有1000mg/mL硅粉懸液0.75mL，6#液，含有洗滌鍰沖液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化鈉、50％乙醇，30mL，7#液，含有TE10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液，含有RT-PCR鍰沖液病毒特異引物各0.0009mmol/L、四種堿基混合物各0.0.75mmol/L、10× Tag酶緩沖液、氯化鎂2mmol/L，0.3mL，9#液，含有鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL，10#液，含有無菌去離子水，1mL，11#液，含有病毒陽性對照(CK+)，0.1mL，12#液，含有病毒陰性對照(CK-)，0.1mL。
上述的三種病毒的雜交檢測試劑盒，提供了30次的檢測量。
本發(fā)明中的耐熱DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶為鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶。
梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法及其步驟如下A.病毒RNA的提取，a.取樣品200mg加入1mL 1#液勻漿，b.將0.5mL勻漿轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加入0.1mL 2#液；70℃溫浴5分鐘，間歇搖動幾次，然后冰浴5分鐘，c.13000g離心10分鐘，取上清0.3mL轉(zhuǎn)入一個新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室溫放置10分鐘，間歇搖動幾次，d.6000g離心1分鐘，棄去懸液，沉淀重懸于0.5mL6#液，重復(fù)洗滌一次，e.重懸于0.15mL7#液，70℃溫浴4分鐘解脫核酸；13000離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)入一個新的離心管中于-20℃貯存，B.RT-PCR擴增反應(yīng)，a.根據(jù)擴增樣品數(shù)量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，蓋上管蓋備用，b.分別取陽性對照、陰性對照及各標(biāo)本RNA0.0025mL加入對應(yīng)的反應(yīng)管中，加樣完畢的反應(yīng)管混勻后，瞬離3秒，取出放入擴增儀里，c.反應(yīng)程序設(shè)置37℃，1小時；94℃，5分鐘；然后94℃變性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，C結(jié)果觀察a.取0.005-0.010mL擴增產(chǎn)物與加樣緩沖液按5∶1的比例混合；b.將混合液上樣與1.5％瓊脂糖疑膠上；c.將瓊脂糖凝膠經(jīng)100伏電壓電泳30分鐘左右，并用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照；d.觀察前沿指示劑遷移至加樣孔至少5cm處，在凝膠成像分析儀上觀察并記錄試驗結(jié)果，e.梨環(huán)紋花葉病毒在635bp處一條帶，蘋果莖溝病毒在256bp處有一條帶，梨脈黃病毒在346bp處有一條帶，上述的RT-PCR檢測方法，檢測所使用的上游引物是梨環(huán)紋花葉病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，蘋果莖溝病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脈黃病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物是梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，蘋果莖溝病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脈黃病毒5′--CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT--3′，所用引物的濃度為0.0009mmol/L。
確定適宜的RT-PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)，在整個病毒樣本的擴增過程中至關(guān)重要，它主要包括變性、復(fù)性、延伸的溫度和時間、循環(huán)次數(shù)。
RT-PCR擴增參數(shù)為37℃，1小時；94℃，5分鐘；然后94℃變性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
本發(fā)明所稱待測樣品或為梨樹組織，或為梨樹組織RNA。
本發(fā)明還在于在電泳設(shè)備中電泳PCR擴增物，記錄結(jié)果的具體步驟為a.取0.005-0.010mL擴增物與加樣緩沖液按5∶1的比例混合，b.將混合液上樣于瓊脂糖疑膠上，c.將瓊脂糖疑膠80-100伏電壓電泳30分鐘左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照，d.觀察前沿指示劑移至距加樣孔至少5cm處，在凝膠成象儀上觀察并記錄試驗結(jié)果，e.觀察并記錄結(jié)果梨環(huán)紋花葉病毒在635bp處有一條帶，蘋果莖溝病毒在256bp處有一條帶，梨脈黃病毒在346bp處有一條帶。
根據(jù)引物設(shè)計的結(jié)果，擴增出的梨樹梨環(huán)紋花葉病毒片段長度為635bp，梨樹蘋果莖溝病毒片段長度為256bp，梨樹梨脈黃病毒片段長度為346bp，因此若擴增出635bp、256bp、346bp處和陽性對照相同位置的條帶，則可判斷此梨樹模板RNA帶有梨環(huán)紋花葉病毒、蘋果莖溝病毒、梨脈黃病毒。
本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點，本發(fā)明所配制的RT-PCR檢測試劑盒制作方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，針對RT-PCR檢測試劑盒所提供的檢測方法檢測梨樹的梨環(huán)紋花葉病毒、蘋果莖溝病毒、梨脈黃病毒的靈敏度高、重復(fù)性好、可操作性強、簡單易行、檢測成本相對較低。


附圖1附為本發(fā)明梨環(huán)紋花葉病毒樣品檢測結(jié)果影像。
附圖2為本發(fā)明蘋果莖溝病毒樣品檢測結(jié)果影像。
附圖3為本發(fā)明梨脈黃病毒樣品檢測結(jié)果影像。。
具體實施例方式實施例1RT-PCR檢測試劑盒，檢測梨樹病毒的RT-PCR檢測試劑盒，包括；上游引物梨環(huán)紋花葉病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，下游引物梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，上述上游引物、下游引物的濃度為0.0009mmol/L；1#液；研磨緩沖液含有6000mmol/L鹽酸胍、200mmol/L醋酸鈉、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液；含有10％十二烷基硫酸納，30mL，3#液；含有6000mmol/L碘化鈉溶液，10mL，4#液；含有乙醇，5mL，5#液；含有1000mg/mL硅粉懸液0.75mL，6#液；含有洗滌鍰沖液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化鈉、50％乙醇，30mL，7#液；含有TE10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液；含有RT-PCR鍰沖液病毒特異引物各0.0009mmol/L、四種堿基混合物各0.0.75mmol/L、10×Tag酶緩沖液、氯化鎂2mmol/L，0.3mL，9#液；含有鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL10#液；含有無菌去離子水，1mL，11#液；含有病毒陽性對照(CK+)，0.1mL，12#液；含有病毒陰性對照(CK-)，0.1mL。
本實施例中的耐熱DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶為鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶。
檢測儀器設(shè)備包括PCR儀、電泳設(shè)備、凝膠成像儀、冰箱、高速離心機、微量進(jìn)樣器等。
檢測實施的操作A.病毒RNA的提取a.取樣品200mg加入1mL 1#液勻漿。
b.將0.5mL勻漿轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加入0.1mL 2#液；70℃溫浴5分鐘，間歇搖動幾次，然后冰浴5分鐘；c.13000g離心10分鐘，取上清0.3mL轉(zhuǎn)入一個新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室溫放置10分鐘，間歇搖動幾次；d.6000g離心1分鐘，棄去懸液，沉淀重懸于0.5mL6#液，重復(fù)洗滌一次；e.重懸于0.15mL7#液，70℃溫浴4分鐘解脫核酸；13000離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)入一個新的離心管中于-20℃貯存。
B.RT-PCR擴增反應(yīng)a.根據(jù)擴增樣品數(shù)量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，蓋上管蓋備用。
b.分別取陽性對照、陰性對照及各標(biāo)本RNA0.0025mL加入對應(yīng)的反應(yīng)管中，加樣完畢的反應(yīng)管混勻后，瞬離3秒，取出放入擴增儀里。
c.反應(yīng)程序設(shè)置37℃，1小時；94℃，5分鐘；然后94℃變性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
C.在電泳設(shè)備中電泳PCR擴增物，記錄結(jié)果的具體步驟為a.取0.005-0.010mL擴增物與加樣緩沖液混合。
b.將混合液上樣于瓊脂糖疑膠上。
c.將瓊脂糖疑膠80-100伏電壓電泳30分鐘左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照。
e.觀察并記錄結(jié)果梨環(huán)紋花葉病毒在635bp左右有一條帶。
實施例2與實施例1的區(qū)別在于上游引物是蘋果莖溝病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′下游引物是梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′上述上游引物、下游引物的濃度為0.0009mmol/L；e.觀察并記錄結(jié)果蘋果莖溝病毒在256bp處有一條帶。
實施例3與實施例1的區(qū)別在于上游引物是梨脈黃病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′上述上游引物、下游引物的濃度為0.0009mmol/L；梨脈黃病毒5′--CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT--3′引物的濃度為0.0009mmol/Lf.觀察并記錄結(jié)果梨脈黃病毒在346bp處有一條帶。
權(quán)利要求
1.一種用于梨樹病毒一步RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括，上游引物梨環(huán)紋花葉病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，蘋果莖溝病毒5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脈黃病毒 5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，蘋果莖溝病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脈黃病毒 5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT---3′，上述上游引物、下游引物的濃度為0.0009mmol/L；1#液；研磨緩沖液含有6000mmol/L鹽酸胍、200mmol/L醋酸鈉、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液；含有10％十二烷基硫酸納，30mL，3#液；含有6000mmol/L碘化鈉溶液，10mL，4#液；含有乙醇，5mL，5#液；含有1000mg/mL硅粉懸液0.75mL，6#液；含有洗滌鍰沖液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化鈉、50％乙醇，30mL，7#液；含有TE10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液；含有RT-PCR鍰沖液病毒特異引物各0.0009mmol/L、四種堿基混合物各0.0.75mmol/L、10×Tag酶緩沖液、氯化鎂2mmol/L，0.3mL，9#液；含有鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL，10#液；含有無菌去離子水，1mL，11#液；含有病毒陽性對照(CK+)，0.1mL，12#液；含有病毒陰性對照(CK-)，0.1mL。
2.梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法，其特征在于包括如下步驟A.病毒RNA的提取a.取樣品200mg加入1mL 1#液勻漿。b.將0.5mL勻漿轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加入0.1mL 2#液；70℃溫浴5分鐘，間歇搖動幾次，然后冰浴5分鐘；c.13000g離心10分鐘，取上清0.3mL轉(zhuǎn)入一個新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室溫放置10分鐘，間歇搖動幾次；d.6000g離心1分鐘，棄去懸液，沉淀重懸于0.5mL6#液，重復(fù)洗滌一次；e.重懸于0.15mL7#液，70℃溫浴4分鐘解脫核酸；13000離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)入一個新的離心管中于-20℃貯存。B.RT-PCR擴增反應(yīng)a.根據(jù)擴增樣品數(shù)量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，蓋上管蓋備用。b.分別取陽性對照、陰性對照及各標(biāo)本RNA0.0025mL加入對應(yīng)的反應(yīng)管中，加樣完畢的反應(yīng)管混勻后，瞬離3秒，取出放入擴增儀里。c.反應(yīng)程序設(shè)置37℃，1小時；94℃，5分鐘；然后94℃變性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。C結(jié)果觀察a.取0.005-0.01mL擴增產(chǎn)物與加樣緩沖液按5∶1的比例混合；b.將混合液上樣與1.5％瓊脂糖疑膠上；c.將瓊脂糖凝膠經(jīng)100伏電壓電泳30分鐘左右，并用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照；d.觀察前沿指示劑遷移至加樣孔至少5cm處，在凝膠成像分析儀上觀察并記錄試驗結(jié)果。使用的上游引物是梨環(huán)紋花葉病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，蘋果莖溝病毒5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，蘋果莖溝病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物是梨環(huán)紋花葉病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，蘋果莖溝病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脈黃病毒 5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT---3′，引物濃度為0.0009mmol/L。
3.如權(quán)利要求2所述的梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法，其特征在于RT-PCR擴增參數(shù)為37℃，1小時；94℃，5分鐘；然后94℃變性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
4.如權(quán)利要求2或3所述的梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法，其特征在于待測樣品或為梨樹組織，或為梨樹組織RNA。
5.如權(quán)利要求2所述的梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法，其特征在于在電泳設(shè)備中電泳PCR擴增物，記錄結(jié)果的具體步驟為a.取0.005-0.010ml擴增物與加樣緩沖液按5∶1的比例混合，b.將混合液上樣于瓊脂糖疑膠上，c.將瓊脂糖疑膠80-100伏電壓電泳30分鐘左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照，d.觀察前沿指示劑移至距加樣孔至少5cm處，在凝膠成象儀上觀察并記錄試驗結(jié)果，e.觀察并記錄結(jié)果。
6.如權(quán)利要求2或3或、或5所述的梨樹病毒一步RT-PCR檢測方法，其特征在于梨樹的梨環(huán)紋花葉病毒在635bp處有一條帶，蘋果莖溝病毒在256bp處有一條帶，梨脈黃病毒在346bp處有一條帶。
全文摘要
梨樹病毒一步RT－PCR檢測試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明涉及梨樹上潛隱的梨環(huán)紋花葉、蘋果莖溝、梨脈黃三種病毒的一步RT－PCR檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒，包括、引物、十二烷基磺酸鈉、研磨緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶、上游引物、下游引物，RT－PCR檢測試劑盒制作方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，針對RT－PCR檢測試劑盒所提供的檢測方法檢測梨樹的梨環(huán)紋花葉病毒、蘋果莖溝病毒、梨脈黃病毒的靈敏度高、重復(fù)性好、可操作性強、簡單易行、檢測成本相對較低。
文檔編號C12Q1/68GK1696314SQ200510065419
公開日2005年11月16日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日
發(fā)明者牛建新, 馬兵鋼 申請人:石河子大學(xué)