專利名稱：利用促血管生成素1多態(tài)性位點(diǎn)確定缺血性腦卒中易感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用促血管生成素1多態(tài)性位點(diǎn)確定患者對缺血性腦卒中的遺傳易感性的方法，用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
腦卒中(Stoke)，又稱中風(fēng)或腦血管意外(Cerebrovascularaccident)，是一組突然起病，以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病。腦卒中有極高的病死率和致殘率，在我國，腦卒中則是僅次于癌癥的第二大致死疾病，每年死于腦卒中的超過100萬人，是冠心病死亡人數(shù)的2-3倍。腦卒中的防治已成為衛(wèi)生工作中的一項(xiàng)重要課題，越來越引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界特別是神經(jīng)科學(xué)界的重視。
腦卒中是臨床癥狀復(fù)雜的多因素疾病腦卒中的臨床癥狀復(fù)雜，但主要可分為兩大類缺血性卒中和出血性卒中。在西方國家進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，前者約占60-70％，后者占30-40％。在我國，缺血性腦卒中和出血性腦卒中的發(fā)病基本持平。缺血性卒中又進(jìn)一步分為大血管阻塞性疾病，是由于動(dòng)脈狹窄、管腔內(nèi)逐漸形成血栓而最終阻塞動(dòng)脈所致，稱為腦血栓形成，其最常見的病因是動(dòng)脈粥樣硬化；小血管阻塞性疾病，是由于大腦小動(dòng)脈逐漸狹窄而最終閉塞所致，管腔內(nèi)既無血栓亦無栓子，稱為腔隙性腦梗塞，高血壓動(dòng)脈硬化是最常見的原因；心源性腦卒中，是由于血栓脫落或其它栓子進(jìn)入血流中阻塞腦動(dòng)脈所引起，如房顫或冠心病患者心腔內(nèi)的栓子脫落便可引起腦栓塞。出血性腦卒中根據(jù)出血部位的不同又分為腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。腦出血俗稱“腦溢血”，是由于腦內(nèi)動(dòng)脈破裂，血液溢出到腦組織內(nèi)。蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)t是腦表面或腦底部的血管破裂，血液直接進(jìn)入含有腦脊液的蛛網(wǎng)膜下腔和腦室中。長期的原發(fā)性高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化是出血性卒中的主要原因。
研究腦卒中新的遺傳危險(xiǎn)因素意義重大大量的臨床實(shí)踐已證明，對已發(fā)生的腦卒中，無論如何完美的治療，對其短時(shí)病死率和自然史的影響都不很理想。因此，對腦卒中的防制更應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)“預(yù)防為主”的方針，而尋找、確定腦卒中的危險(xiǎn)因素(risk factor)，然后設(shè)法減少或清除這些危險(xiǎn)因素的損害，則是預(yù)防腦卒中最基本的手段，也是降低卒中發(fā)病率與死亡率的主要公共衛(wèi)生措施。存在危險(xiǎn)因素的人，可稱之為“卒中傾向個(gè)體”(stroke-prone individual)。檢出這些個(gè)體，并告知他們減少危險(xiǎn)因素?fù)p害的方法，是腦卒中預(yù)防工作的重要內(nèi)容，也是危險(xiǎn)因素研究的意義所在。
引起腦卒中的原因眾多，如高齡、吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、高血糖、心臟病、凝血機(jī)制障礙等等，此外許多證據(jù)表明遺傳因素在腦卒中的發(fā)病中有顯著作用。尋找腦卒中的致病基因，從分子水平揭示腦卒中的發(fā)病機(jī)理，可為及早發(fā)現(xiàn)腦卒中的危險(xiǎn)人群、預(yù)防腦卒中的發(fā)生提供有利手段。在腦卒中發(fā)病的遺傳學(xué)研究中，候選基因的病例-對照研究是經(jīng)典的方法。以這種方式在群體中抽取大樣本進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，可以有效地確定染色體上與腦卒中發(fā)病相關(guān)的位置、位點(diǎn)，進(jìn)而通過功能學(xué)分析確定其中的分子機(jī)制，為尋找藥物的靶位點(diǎn)和進(jìn)一步的藥物篩選提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
促血管生成素-1多態(tài)性及其與缺血性腦卒中的易感性關(guān)系作為本研究的候選基因，促血管生成素-1(Angiopoietin-1，AGP1)是1996年發(fā)現(xiàn)的特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，主要表達(dá)于血管旁細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，是受體類酪氨酸激酶Tie-2的特異性配體，與血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)在血管生成過程中有協(xié)同作用，促進(jìn)血管重塑、成熟，維持血管的完整性和調(diào)節(jié)血管功能，并有維持成熟血管中內(nèi)皮細(xì)胞的靜息狀態(tài)和血管的完整的作用。AGP1/Tie2還有阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管損傷修復(fù)的功能。由于促血管生成素-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其對于血管生理具有不可忽視的影響。血管損傷時(shí)促血管生成素-1可輔助VEGF等促使內(nèi)皮細(xì)胞聚集以利于血管損傷后的再內(nèi)皮化。Wei L已經(jīng)證明，在腦卒中過程中會(huì)發(fā)生血管生成的過程，并且血管生成對于卒中的治療策略可能發(fā)揮著極為重要的作用。Mandriota等人研究發(fā)現(xiàn)促血管生成素-1基因的表達(dá)水平與腦卒中尤其是缺血性腦卒中有很大的相關(guān)性。由于3’非翻譯區(qū)在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中具有重要的作用，直接影響到相應(yīng)mRNA的半衰期及蛋白的翻譯效率，進(jìn)而與相應(yīng)基因的表達(dá)水平發(fā)生關(guān)聯(lián)，因此，在已知的幾個(gè)位于AGP1基因上的SNP位點(diǎn)中，2914C/G由于處于AGP1 mRNA的3’非翻譯區(qū)而受到我們的關(guān)注。
單核苷酸多態(tài)性人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態(tài)性(″SNP″)組成，其余序列變異是短串聯(lián)重復(fù)(包括微衛(wèi)星)、長串聯(lián)重復(fù)(小衛(wèi)星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測頻率(即＞1％)出現(xiàn)兩個(gè)可替換堿基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因?yàn)橛捎诖硕鄳B(tài)性的存在，一個(gè)物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始“等位基因”)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡單的情況下，可能僅存在一個(gè)突變序列，該多態(tài)性被稱為二對等位基因多態(tài)性?？商鎿Q突變的發(fā)生可產(chǎn)生三對等位基因多態(tài)性等。SNP廣泛存在于基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助于表型變異。由于它們的流行和普遍本質(zhì)，SNP有潛力成為定位參與人類疾病情況的基因的重要工具，見如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公開了一個(gè)探索性研究，其中2,227個(gè)SNP被作圖定位于一個(gè)2.3兆堿基的DNA區(qū)域內(nèi)。
單核苷酸多態(tài)性和特定表型之間的關(guān)系不表示或需要SNP是該表型的原因。相反，這種關(guān)系可能僅表示SNP位于表型決定因子在基因組上的存在位置的附近，由此更可能被發(fā)現(xiàn)與這些決定因子關(guān)聯(lián)和由此與感興趣的表型關(guān)聯(lián)。因此，SNP可能與“真正”的功能變異存在連鎖不平衡(LD)。當(dāng)基因組兩個(gè)不同位置上的等位基因的相關(guān)性比期望的相關(guān)性更高時(shí)存在LD，又稱作等位基因相關(guān)(allelicassociation)。因此，SNP可以用作標(biāo)記，由于其接近引起特定表型的突變而具有價(jià)值。
本發(fā)明在以促血管生成素-1作為缺血性腦卒中易感候選基因的病例-對照研究中，通過對該基因2914多態(tài)性位點(diǎn)與缺血性腦卒中的關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，研究該位點(diǎn)C等位基因與缺血性腦卒中的相關(guān)性，從而確定中國人缺血性腦卒中病的易感基因。同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所鑒別的缺血性腦卒中相關(guān)SNP確定藥物的靶位點(diǎn)，可以為后續(xù)的藥物篩選提供指導(dǎo)性方針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及用于檢測促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的工具。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中中，所述工具可以是促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測促血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性，或者(2)用于檢測促血管生成素-1中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述工具是限制性內(nèi)切酶。
本發(fā)明的另一方面，涉及用于上述檢測的試劑盒，其中至少一種上述的工具，以及，任選的，用于檢測反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
本發(fā)明的又一方面，涉及一種診斷患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914CC基因型的攜帶者患腦血栓的相對危險(xiǎn)度達(dá)1.448(CI 1.091～1.923)。
本發(fā)明的又一方面，涉及一種確定患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作對照，C等位基因可使腦血栓發(fā)病的危險(xiǎn)性顯著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
本發(fā)明的再一方面，還涉及一種分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核苷酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用包括，但不限于，選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長度多態(tài)性，檢測所述樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核苷酸的存在。
本發(fā)明的再一方面，還涉及一種微陣列，其中包含上述定義的促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的分型寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明的再一方面，還涉及檢測生物學(xué)樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者缺血性腦卒中(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞)的遺傳易感性。在本發(fā)明中，所述物質(zhì)選自用于檢測促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的工具，例如，促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測促血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性，或者(2)用于檢測促血管生成素-1中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個(gè)核苷酸；能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的突變的抗體；和能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用促血管生成素-1作為缺血性腦卒中易感候選基因的病例的對照研究，對該基因2914多態(tài)性位點(diǎn)與缺血性腦卒中的關(guān)系進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果得出了該位點(diǎn)C等位基因與缺血性腦卒中的相關(guān)性。
促血管生成素-1基因位于染色體8q22.3-q23區(qū)，cDNA全長4338bp，NCBI RefSeq mRNA accession No.為NM_001146。
在本文中，促血管生成素-1基因序列和編碼的蛋白質(zhì)序列按照常規(guī)方法進(jìn)行編號。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基編號為1。
本發(fā)明所提及的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸殘基的編號是指與NCBI RefSeq mRNA accession No.為NM_001146的序列或其編碼的氨基酸序列相同位置(或編號)對應(yīng)的核苷酸和氨基酸殘基。
“對應(yīng)”是指本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)的序列在與參考序列的cDNA序列所示序列最佳比對(alignment)后與該參考序列某位置相對的位置。因此，本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)“對應(yīng)位置”或者“對應(yīng)核苷酸”或者“對應(yīng)氨基酸”不一定是與參考序列編號相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
促血管生成素-1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)“2914C/G”是指該基因第2914位多態(tài)性C和G。
單核苷酸多態(tài)性及其檢測術(shù)語“患者”是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物，最優(yōu)選人類。
術(shù)語“多態(tài)性”廣義上限定為包括已知發(fā)生在核苷酸序列中的所有變異，包括插入，缺失，置換和重復(fù)序列(包括二重重復(fù))。
根據(jù)本發(fā)明的上述方法可通過使用用于檢測單核苷酸變異的任何合適方法而得以施用，比如用質(zhì)譜對PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析，對侵入性切割產(chǎn)物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特異性擴(kuò)增(即，ARMSTM-等位基因特異性擴(kuò)增，ARMS指擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)線性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(競爭性寡核苷酸引發(fā)系統(tǒng))，等位基因特異性雜交(ASH)，寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)，侵入者試驗(yàn)，DNA芯片分析和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)(綜述參見基因組研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776頁；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100頁；人類突變(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492頁)。
攜有所述多態(tài)性核酸的獲自患者的樣品可以方便地是從個(gè)體中獲得的，包括但不限于血清、尿樣、唾液、體液、(活檢)組織樣本等。這些樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。可以明了，樣品同樣可以是對應(yīng)于試樣中序列的核酸序列，也就是說，在等位基因變異分析前，核酸樣品中的全部或一部分區(qū)域可先用任何一種方便的技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)擴(kuò)增。
顯然，對于對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說有大量的分析方法可被用于檢測在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)位置處變異核苷酸存在與否。一般來說，等位基因變異的檢測需要突變辨別技術(shù)，任選地?cái)U(kuò)增反應(yīng)和任選地信號生成系統(tǒng)。國際專利申請WO00/06768列出了許多擴(kuò)增技術(shù)和突變檢測技術(shù)，其中一些是基于PCR技術(shù)的。這些技術(shù)可和許多信號生成系統(tǒng)聯(lián)合使用，可選的信號生成系統(tǒng)也被列于WO00/06768。
用于檢測等位基因變異的許多現(xiàn)行方法綜述于Nollau等，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120頁；在標(biāo)準(zhǔn)教科書例如“突變檢測實(shí)驗(yàn)指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren編輯，牛津大學(xué)出版社，1996年和“PCR”第二版Newton & Graham編輯，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本發(fā)明涉及可被用做檢測促血管生成素-1基因中多態(tài)性的診斷引物的等位基因特異性核酸引物，該診斷引物能夠與在序列內(nèi)于促血管生成素-1基因位點(diǎn)2914處包含多態(tài)性(例如促血管生成素-1基因位點(diǎn)2914C/G或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
等位基因特異性引物通常與恒定引物一起用于諸如PCR反應(yīng)等擴(kuò)增反應(yīng)中，通過對位于一個(gè)特定序列位置處的一個(gè)等位基因的選擇性擴(kuò)增而使等位基因之間得以區(qū)分開來，例如用在ARMSTM試驗(yàn)中的引物。等位基因特異性引物的長度優(yōu)選17-50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選大約17-35個(gè)核苷酸，最優(yōu)選大約17-30個(gè)核苷酸。
優(yōu)選地，等位基因特異性引物與待檢測的等位基因完全地相對應(yīng)，但是也可以考慮其衍生物，其中3’端大約有6到8個(gè)核苷酸與待檢測的等位基因?qū)?yīng)而不超過10個(gè)，比如不超過8，6，4，2或者1個(gè)剩余核苷酸在不顯著影響引物特性的情況下可以發(fā)生變化。常常在第2和/或第3位(相對于3’端)的核苷酸被錯(cuò)配以優(yōu)化差異引物結(jié)合和優(yōu)先僅從正確的等位基因辨別引物延伸。
本發(fā)明還涉及用于檢測促血管生成素-1基因中的多態(tài)性的寡核苷酸探針，該探針能特異地與在序列內(nèi)包含位于促血管生成素-1基因位點(diǎn)2914位的多態(tài)性(例如促血管生成素-1基因位點(diǎn)2914C/G或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
術(shù)語“寡核苷酸探針”指長度至少有17個(gè)核苷酸的一種核苷酸序列，此序列與部分或全部的人類促血管生成素-1基因，特別是表達(dá)多態(tài)性的人類促血管生成素-1基因部分對應(yīng)。優(yōu)選長度17到50個(gè)核苷酸。一般來說這樣的探針包含與基因中相應(yīng)的野生型或變體座位完全互補(bǔ)的堿基序列。
然而，如果需要，可以引入一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配，前提是寡核苷酸探針的辨別能力不被過度影響。本發(fā)明的探針可以攜有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記以便于檢測，比如在Moleaular Beacons中。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的試劑盒，其包含至少一種促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G多態(tài)性分型寡核苷酸，或是限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明中所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測促血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性，或者(2)用于檢測促血管生成素-1中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中任選的含有適于所述檢測反應(yīng)的緩沖體系和顯色體系。
在一些實(shí)施方案中，一種組合物含有用于同時(shí)探測兩個(gè)或更多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸身份的兩個(gè)或更多個(gè)不同標(biāo)記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對以允許同時(shí)靶向和擴(kuò)增含多態(tài)性位點(diǎn)的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域的引物組合物。
本發(fā)明的促血管生成素-1基因分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如芯片、珠或玻片(如見WO98/20020和WO98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用于各種多態(tài)性檢測試驗(yàn)，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸試驗(yàn)。本發(fā)明的固定的促血管生成素-1基因分型寡核苷酸可以包括為同時(shí)快速篩選DNA樣品在多個(gè)基因中的多態(tài)性而設(shè)計(jì)的有序寡核苷酸陣列。
本發(fā)明等位基因特異性寡核苷酸引物優(yōu)選具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補(bǔ)的3’末端核苷酸，或優(yōu)選地3’倒數(shù)第二個(gè)核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時(shí)其才可以用作聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明其它基因分型寡核苷酸與位于這里所述的多態(tài)性位點(diǎn)之一下游一個(gè)至幾個(gè)核苷酸處的靶區(qū)域雜交。這種寡核苷酸可用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法中以檢測這里所描述的多態(tài)性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這里稱作“引物延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與多態(tài)性位點(diǎn)緊臨的核苷酸互補(bǔ)的脫氧核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括包裝在分開容器中的至少兩個(gè)基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開容器中的其它成分如雜交緩沖液(此時(shí)寡核苷酸待用作探針)。可供選擇地，當(dāng)寡核苷酸待用于擴(kuò)增靶區(qū)域時(shí)，該試劑盒可以含有包裝在分開容器中的聚合酶和用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸如PCR的經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)緩沖液。
本發(fā)明還涉及一種診斷患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的體外方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914CC基因型的攜帶者患腦血栓的相對危險(xiǎn)度達(dá)1.448(CI 1.091～1.923)。
本發(fā)明還涉及一種確定患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的易感性的體外方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作對照，C等位基因可使腦血栓發(fā)病的危險(xiǎn)性顯著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
本發(fā)明還涉及一種分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核苷酸。在本發(fā)明所述方法中，使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長度多態(tài)性。
在本發(fā)明所述方法中，其中所述來自患者的樣品選自血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的微陣列，其中包含前述定義的促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的分型寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明還涉及檢測生物學(xué)樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者缺血性腦卒中(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞)的易感性。在本發(fā)明中，所述物質(zhì)選自用于檢測促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的工具，例如，促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測促血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性，或者(2)用于檢測促血管生成素-1中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個(gè)核苷酸；能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的突變的抗體；和能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
以下實(shí)施例用于對本發(fā)明作進(jìn)一步舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1。腦卒中患者和對照人群的入選本研究的樣本來源于多中心合作的973項(xiàng)目高血壓易患腦卒中的分子遺傳機(jī)制。2000年12月至2001年12月，從位于兗州、西安、重慶、武漢、北京和天津6個(gè)地區(qū)的7個(gè)醫(yī)療中心收集腦卒中患者，同時(shí)在當(dāng)?shù)剡x擇與之性別、年齡相匹配的對照組成1比1配對。腦卒中的診斷根據(jù)國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過嚴(yán)格的神經(jīng)學(xué)檢查，顱腦CT或核磁共振檢查確診。每入選一個(gè)腦卒中病例，在同一個(gè)醫(yī)院的眼科、消化科、耳鼻喉科或骨科的輕型病例中，或者在當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)人群中選擇沒有神經(jīng)科疾病的，年齡(±5歲)、性別相匹配者作為對照。
實(shí)施例2基因組DNA的提取以及血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性的鑒別一.材料(一)生物材料人外周血(973課題經(jīng)費(fèi)收集)(二)工具酶及常用試劑1.酶類限制性內(nèi)切酶Alu I，TaqI(大連TaKaRa公司)其它工具酶Taq DNA聚合酶(北京鼎國公司)2.常用試劑3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑3.8g枸櫞酸鈉，加生理鹽水至100ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 溶血液8.29g NH4Cl，1.0g KHCO3，0.03734g EDTA-Na2，加水定容至1,000ml。
SE4.383g NaCl，9.306g EDTA-Na2，pH8.0，加水定容至1,000ml。
10％SDS10.0g SDS溶于90ml水中，調(diào)pH7.2，加水定容至100ml。
TE10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA-Na2(pH 8.0)6)50 X TAE電泳緩沖液242.0g Tris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml 0.5mM EDTA-Na2，終體積1升。
二.方法(一)采用鹽析法從白細(xì)胞中提取DNA(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增目的片段1.引物序列
Coelenterazine-非依賴型真核熒光素酶

表3Coelenterazine-非依賴型真核熒光素酶還可以根據(jù)某些熒光素酶的底物專一性區(qū)分各種熒光素酶。最重要的底物包括Coelenterazine(Jones等1999)和熒光素，以及這兩種物質(zhì)的衍生物。下面示出了這兩種底物及其通過熒光素酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)化的示意圖熒光素酶底物下面通過舉例形式示出了某些熒光素酶底物及其轉(zhuǎn)化。本文所示出的所有底物是通過酶促轉(zhuǎn)化的，同時(shí)釋放出光和二氧化碳(CO2)并且消耗氧氣(O2)。所述反應(yīng)對輔因子或能量載體(例如，對于螢火蟲熒光素酶來說是ATP)的依賴性是酶專一性的。
Coelenterazine

水母蛋白在將Coelenterazine轉(zhuǎn)化成Coelenteramide時(shí)，會(huì)發(fā)出波長為470納米的光線。
實(shí)施例3基因型分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用χ2檢驗(yàn)和非配對t檢驗(yàn)分別比較腦卒中卒和對照組之間的計(jì)數(shù)和計(jì)量資料。單因素方差分析比較多組間計(jì)量資料。用χ2檢驗(yàn)對基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。基因型和等位基因頻率比較用SPSS10.0軟件包2×2列聯(lián)表進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。計(jì)算基因型與腦卒中的OR值。
結(jié)果1.研究人群的臨床特點(diǎn)(參見表1)表1。

可見，病歷組與對照組間在年齡構(gòu)成、血壓、血脂水平、血糖等方面均有顯著差異(P＜0.05)。在體重指數(shù)，性別組成上，對照組和病歷組之間差異不顯著。在缺血性腦卒中的2個(gè)亞型的病例中，罹患高血壓和糖尿病的患者比例高于對照組(P＜0.05)。
2.多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的基因型頻率在各組之間的分布(參見表2)表2

三種基因型的分布在腦血栓和腔隙性腦梗塞中的分布與對照組均有差異(P＜0.05)，腦血栓組的等位基因頻率與對照組間的差異顯著(P＜0.05)。在未考慮缺血性腦卒中傳統(tǒng)危險(xiǎn)因子的情況下，以G等位基因作對照，C等位基因可使腦血栓發(fā)病的危險(xiǎn)性顯著增加(OR1.174，CI 1.027～1.342)。
3.多因素Logistic回歸分析基因多態(tài)性與其它危險(xiǎn)因素和腦卒中的關(guān)聯(lián)性Logistic多元回歸分析了缺血性腦卒中卒中年齡、性別、體重指數(shù)、總膽固醇、甘油三脂、高血壓、吸煙、糖尿病史、高血壓家族史、腦卒中家族史和AGP1基因2914 CG和CC基因型對缺血性腦卒中的相對危險(xiǎn)度。
(1)腦血栓病例組在傳統(tǒng)的缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素中，高甘油三酯、高血壓、吸煙以及糖尿病會(huì)導(dǎo)致缺血性腦卒中危險(xiǎn)度顯著增高。而與GG基因型比較后，CC基因型的攜帶者患腦血栓的相對危險(xiǎn)度達(dá)1.448(CI 1.091～1.923)，結(jié)果見表3。
表3

(2)腔隙性腦梗塞組在不分層的情況下調(diào)整各傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，未發(fā)現(xiàn)2914多態(tài)性位點(diǎn)與腔梗發(fā)病發(fā)生關(guān)聯(lián)。但進(jìn)一步性別分層后，本研究發(fā)現(xiàn)，2914CC基因型是腔隙性腦梗塞發(fā)病的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。
男性多元Logistic回歸分析腔梗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的結(jié)果如下表4所示
表4

由以上結(jié)果可見，在促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G在中國人群中確實(shí)與缺血性腦卒中相關(guān)。本研究作為第一個(gè)針對此SNP與缺血性腦卒中的關(guān)聯(lián)研究，確立了這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與腦血栓、腔隙性腦梗塞的聯(lián)系，為以后的藥物靶點(diǎn)選擇和藥物篩選提供了理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1.用于鑒別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的工具。
2.權(quán)利要求1的工具，它是促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測促血管生成素-1的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的多態(tài)性，或者(2)用于檢測促血管生成素-1中多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的工具，其是限制性內(nèi)切酶。
4.一種試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的工具，以及，任選的，用于檢測反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
5.診斷患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914CC基因型的攜帶者患腦血栓的相對危險(xiǎn)度達(dá)1.448(CI 1.091～1.923)。
6.確定患者缺血性腦卒中(包括腦血栓形成和/或腔隙性腦梗塞)的易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作對照，C等位基因可使腦血栓發(fā)病的危險(xiǎn)性顯著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
7.分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的核苷酸。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長度多態(tài)性。
9.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述來自患者的樣品選自外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
10.一種微陣列，其中包含權(quán)利要求2所定義的促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的分型寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10的微陣列，它是DNA芯片的形式。
12.檢測生物學(xué)樣品中促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者缺血性腦卒中(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞)的遺傳易感性。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述物質(zhì)選自權(quán)利要求1-3的工具；能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的突變的抗體；和能夠特異識別促血管生成素-1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定患者缺血性腦卒中(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞)的易感性的方法。具體地，本發(fā)明方法包括確定促血管生成素－1上的多態(tài)性位點(diǎn)2914C/G。本發(fā)明還涉及用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
文檔編號C12Q1/68GK1847407SQ20051006590
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者惠汝太, 張陸, 馬麗娜, 石毅, 孫凱, 張春玲, 劉曉寧 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院