專(zhuān)利名稱(chēng)：一種調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是許多種類(lèi)的細(xì)菌都能合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要是作為細(xì)胞內(nèi)碳源和能源的貯藏性物質(zhì)而存在的(Lemoigne M.Products of dehydration and of polymerization of-hydroxybutyricacid.Bull.Soc.Chem.Biol.，1926，8770-782)。PHA的結(jié)構(gòu)通式如 (式I)其中n可以為1、2、3或4，n＝1時(shí)表示3-羥基脂肪酸酯；m為聚合度；R為可變的側(cè)鏈基團(tuán)，如飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的不同鏈長(zhǎng)的烷基。
根據(jù)PHA側(cè)鏈的長(zhǎng)短不同，可將PHA分為三種類(lèi)型(1)短鏈PHA(short-chain-length PHA，scl PHA)，如聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)、羥基丁酸酯與羥基戊酸酯的共聚物[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，PHBV]，單體含3-5個(gè)碳原子。
(2)中長(zhǎng)鏈PHA(medium-chain-length PHA，mcl PHA)，如聚羥基己酸酯(PHHx)、聚羥基辛酸酯(PHO)，單體含6個(gè)以上碳原子。mcl PHA中可以含有多種功能基團(tuán)，如雙鍵(Huigberts GNM，Eggink G，Waard P，Huisman GW and Witholt B.Pseudomonas putitaKT2442 cultivated on glucose accumulates poly-β-hydroxyalkanoates consistingof saturated and unsaturated momnomers.Appl Envron.Microbiol.，1992，58536-544)、叁鍵、鹵素(Doi Y and Abe C.Biosynthesis and characterization ofa new bacterial copolyester of 3-hydroxyalkanoates and3-hydroxy-w-chloroalkanoates.Macromolecules，1990，232705-3707)、酚(FritzscheK.Lenz RW and Fuller RC.An unusual bacterial polyesters with a phenyl pendantgroup.Macromol Chem，1990，1911957-1968)和氰(Schulz C，Wolk S，Lenz RW andFuller RC.Growth and polyester production by Pseudomonas oleovorans on branchedoctanoic acid substrates.Macromolecules.1995，276358-6362)等。mcl PHA大多是兩種以上單體的隨機(jī)共聚物。
(3)含短鏈與中長(zhǎng)鏈單體的PHA，多是兩種或兩種以上單體的隨機(jī)共聚物(LageveenRG，Huisman GW，Preusting H，Ketelaar H，Eggink G and Witholt B.Formation ofPolyesters by Pseudomonas oleovoransEffect of Substrates on formation andcomposition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates.Appl.Environ.Microbiol，1988，542924-2932)。
PHA對(duì)于細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境的變化及生存具有重要的意義。以PHB為例，有些細(xì)菌胞內(nèi)的PHB可以減緩細(xì)胞內(nèi)重要成分-RNA和蛋白質(zhì)在饑餓條件下的降解，從而可以增加細(xì)菌對(duì)生存逆境的抵抗能力。另外在某些芽孢桿菌屬中，盡管孢子的形成并不必需PHB，但PHB可以作為孢子形成時(shí)的能源和碳源從而增加這些菌的生存機(jī)會(huì)。此外，PHB還可以為某些固氮菌屬的包囊形成提供必要的碳源和能源。對(duì)Rhizobium sp.ORS 571的固氮與PHB的形成及降解的研究表明，當(dāng)節(jié)結(jié)中的氧濃度增加時(shí)，PHB可以通過(guò)自己的降解保護(hù)固氮酶不受損傷(Anderson AJ and Dawes EA.Occurense，Metabolism，Metabolic Role，and Industrial Use of Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Microb.Rev.，1990，54450-472)。
PHA還可以作為環(huán)境的標(biāo)記。在對(duì)河灣沉積物中的微生物進(jìn)行的研究表明，通過(guò)比較其中磷脂和PHA的合成比例，可以監(jiān)測(cè)外界因素對(duì)沉積物的影響程度。而且許多可合成PHA的細(xì)菌都是在活性污泥、及富含碳源有機(jī)物的環(huán)境中被篩選出來(lái)的。在對(duì)一些被原油污染嚴(yán)重的地方分離的嗜冷海洋微生物進(jìn)行的研究表明，其中的大多數(shù)微生物都可以在限氮的條件下在胞內(nèi)積累PHA(Alvarez HM，Pucci OH and Steinbüchel A.Lipid storagecompounds in marine bacteria.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1997，47132-139)。這說(shuō)明在這些碳源較豐富的環(huán)境中大多數(shù)細(xì)菌都具備將過(guò)量的碳源轉(zhuǎn)化為PHA儲(chǔ)存起來(lái)的能力。
PHB是細(xì)菌胞內(nèi)的碳源和能源的儲(chǔ)備物。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)它也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于其原生質(zhì)膜中；而在真核生物中，則以在線(xiàn)粒體和微體膜中的比例為最多。相比于胞內(nèi)的高分子量的聚合物，存在于膜上的PHB分子較小，只有100-200個(gè)單體。對(duì)這種小分子量PHB的研究表明，它可能起著膜上的離子通道的作用。最近，在人的血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)較多量的這種小分子PHB。這對(duì)于利用PHB來(lái)包裹藥物進(jìn)行定向定量釋放以及PHA在醫(yī)療方面的應(yīng)用提供了理論上的依據(jù)。
PHA作為一種生態(tài)型的生物高分子材料，不僅可以在塑料工業(yè)中得以推廣和應(yīng)用，成為新型的生物可降解塑料，而且由于它的一些特殊性質(zhì)，如生物相容性、光學(xué)活性、壓電性、氣體相隔性等和其它許多尚未發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)，從而有可能在某些高附加值領(lǐng)域得以應(yīng)用。對(duì)PHA的研究已經(jīng)成為一個(gè)基礎(chǔ)理論與實(shí)踐應(yīng)用結(jié)合得非常緊密的應(yīng)用領(lǐng)域。
不同類(lèi)型PHA在細(xì)菌內(nèi)的合成途逕是不同的，目前已知的合成途徑主要有三條(Anderson AJ and Dawes EA.Occurense，Metabolism，Metabolic Role，and IndustrialUse of Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Microb.Rev.，1990，54450-472；Lee SY.Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Biotech.Bioeng.1996，491-14)1.以Wautersia eutropha(以前叫Ralstonia eutropha，也叫Alcaligeneseutrophus)為代表的由乙酰輔酶A直接合成PHB途徑它的PHB合成酶系統(tǒng)由pha合成操縱子phbCAB(SEQ ID NO1)基因編碼，包含三種酶β-酮基硫解酶(β-ketothiolase)、NADPH依賴(lài)的乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(PHBsynthase)；上述三種酶分別由phbA、phbB和phbC基因編碼，且位于同一個(gè)操縱子上。細(xì)胞內(nèi)的代謝中產(chǎn)物乙酰輔酶A在β-酮基硫解酶(β-ketothiolase，PhaA)的催化作用下形成乙酰乙酰輔酶A，然后在NADPH依賴(lài)的還原酶(PhaB)的作用下還原為(R)-羥基丁酰輔酶A，(R)-羥基丁酰輔酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB。這個(gè)過(guò)程需要消耗NADPH，產(chǎn)生NADP。
2.以Pseudomonas aeruginosa為代表的脂肪酸從頭合成途徑從這條途徑合成PHA需要兩個(gè)酶的催化phaG編碼的3-羥?；??；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和phaC編碼的PHA合酶。脂肪酸從頭合成途徑的中間產(chǎn)物3-羥?；??；D(zhuǎn)移蛋白由3-羥?；??；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶(PhaG)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。同樣的途徑有惡臭假單胞菌(Pseudomonas putita)的合成途徑，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putita)的PhaG的編碼基因的Genbank檢索號(hào)是AF052507。
3.以Pseudomonas oleovorans為代表的β-氧化途徑從這條途徑合成PHA需要兩個(gè)酶的作用phaJ編碼的(R)-烯?；?水合酶((R)-enoyl-CoA hydratase)和phaC編碼的PHA合酶。脂肪酸β-氧化的中間產(chǎn)物烯酰基-?；D(zhuǎn)移蛋白由(R)-烯?；?水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。同樣的途徑有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的合成途徑，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的PHA合成酶操縱子(PHA synthase operon)編碼基因的Genbank檢索號(hào)是AY093685，包括PhaJ和PhaC的編碼基因。
用13C-NMR對(duì)Pseudomonas putida的脂肪酸合成的研究表明脂肪酸的從頭合成和β-氧化與PHA合成是獨(dú)立進(jìn)行的(Hui jberts GN，De Ri jk TC，De Waard P and Eggink G..13C nuclear magnetic resonance studies of Pseudomonas putidas fatty acidsmetabolic routes involved in PHA syntheses.J.Bacteriol.1994，1761661-1666)，在一種細(xì)菌中可能會(huì)同時(shí)以二種途徑來(lái)合成中長(zhǎng)鏈PHA，雖然這二種途徑并不是均等地起作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)這兩條途徑之間也有聯(lián)系，可以將脂肪酸從頭合成途徑的中間產(chǎn)物acyl-ACP在一個(gè)硫酯酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榻到馔緩降闹虚g產(chǎn)物acyl-CoA(Rehm BHA andSteinbüchel A.Heterologous expression of the acyl-acyl carrier proteinthioesterase gene from the plant UmbelluLaria californica mediatespolyhydroxyalkanoates biosynthesis in recombinant Escherichia coli.Appl.Microbiol.Biotechnol.2001，55205-209)。這個(gè)新發(fā)現(xiàn)表明PHA合成的單體提供途徑是很多樣化的，而對(duì)PHA合成進(jìn)行代謝工程的研究也有更多的選擇。
在PHA的代謝途徑中，既有能量的代謝(NAD/NADH，NADP/NADPH等)，也有物質(zhì)的代謝(乙酰輔酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代謝過(guò)程，實(shí)際上也是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)能量和物質(zhì)的改變過(guò)程。由于PHA可以廣泛的存在于各種細(xì)胞中，這也為將PHA合成機(jī)制作為調(diào)節(jié)手段在各種不同的微生物中調(diào)節(jié)其能量和物質(zhì)水平，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種調(diào)控微生物代謝的方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控微生物代謝的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
所述代謝包括能量和物質(zhì)代謝。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。
所述phbCAB基因優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；所述PhaG基因優(yōu)選為AF052507，所述phaC基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685，所述phaJ基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685。
PHA合成途徑的相關(guān)基因可以通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)手段導(dǎo)入宿主微生物中，例如，可以利用表達(dá)載體如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體等，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等手段導(dǎo)入宿主微生物中；也可以利用原生質(zhì)體融合等手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。
所述調(diào)控微生物代謝為調(diào)控微生物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。
所述微生物為細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌；所述發(fā)酵產(chǎn)物包括有機(jī)酸，醇類(lèi)，抗生素，氨基酸和維生素。
其中，所述微生物可為獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)，優(yōu)選為獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸和透明質(zhì)酸；所述微生物可為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)，優(yōu)選為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019，所述發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮酸；所述微生物可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338，所述發(fā)酵產(chǎn)物為麥角固醇；所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；所述微生物可為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)，優(yōu)選為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B，所述發(fā)酵產(chǎn)物為彈性蛋白酶；所述微生物可為紅酵母(Rhodotorula glutinis)，優(yōu)選為紅酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353，所述發(fā)酵產(chǎn)物為類(lèi)胡蘿卜素；所述微生物可為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷氨酰胺；所述微生物可為乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)，優(yōu)選為乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269，所述發(fā)酵產(chǎn)物為賴(lài)氨酸；所述微生物可為大腸桿菌(Escherichia.coli)，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882，所述發(fā)酵產(chǎn)物為苯丙氨酸；所述微生物可為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，優(yōu)選為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556，所述發(fā)酵產(chǎn)物為α-淀粉酶；所述微生物可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇；所述微生物可為克魯斯假絲酵母(Candida krusei)，優(yōu)選為克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196，所述發(fā)酵產(chǎn)物為甘油；所述微生物可為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，優(yōu)選為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH22248，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十二碳二元酸；所述微生物可為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，優(yōu)選為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十五碳二元酸；所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220，所述發(fā)酵產(chǎn)物為鳥(niǎo)苷；所述微生物可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷胱甘肽；所述微生物可為球擬酵母(ToruLopsis sp)，優(yōu)選為球擬酵母(ToruLopsis sp)B845，所述發(fā)酵產(chǎn)物為赤蘚糖醇；所述微生物可為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，優(yōu)選為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)ATCC 31095，所述發(fā)酵產(chǎn)物為D-核糖；所述微生物可為丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)，優(yōu)選為丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260，所述發(fā)酵產(chǎn)物為1，3-丙二醇；所述微生物可為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，優(yōu)選為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；所述微生物可為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高微生物抗逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。
所述phbCAB基因優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；所述PhaG基因優(yōu)選為AF052507，所述phaC基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685，所述phaJ基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685。
其中，所述方法中，所述微生物可為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述逆境脅迫為冷脅迫或熱脅迫；所述微生物可為大腸桿菌(Escherichia coli)，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109，所述逆境脅迫為重金屬離子脅迫；所述重金屬離子可為Hg2+；所述微生物為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonasmobilis)NRRL B-4286，所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫；所述微生物可為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，優(yōu)選為嗜酸乳桿菌(Lac tobacillus acidophilus)ATCC 53671，所述逆境脅迫為低pH脅迫；所述微生物可為芽孢桿菌，優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，尤其優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068；所述微生物可為芽孢桿菌，優(yōu)選為芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23；所述逆境脅迫為原油脅迫。
本發(fā)明通過(guò)引入PHA合成基因，使微生物本身的代謝得到調(diào)控，提高了對(duì)逆境脅迫的抗性。
所述PHA合成機(jī)制包括以Wautersia eutropha，Rhodospirillum rubrum為代表的由乙酰輔酶A直接合成PHB途徑；以Pseudomonas aeruginasa為代表的脂肪酸從頭合成途徑，以Pseudomonas oleovorans為代表的脂肪酸β-氧化途徑等。
在本發(fā)明的調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法中，可將PHA合成的相關(guān)基因克隆到針對(duì)于目的菌的質(zhì)粒載體上，將構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入到目的菌中獲得重組菌，發(fā)酵重組菌獲得所需的產(chǎn)物或提高抗逆性。PHA合成的相關(guān)基因可以在質(zhì)粒上或染色體上。
為提高轉(zhuǎn)化效率，將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入目的菌中的方法優(yōu)選為電轉(zhuǎn)化法，但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，包括熱激法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和接合轉(zhuǎn)化法。
本發(fā)明通過(guò)在微生物重組生產(chǎn)菌中引入PHA合成途徑，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)的NAD(P)/NAD(P)H代謝以及乙酰輔酶A，丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物的流向，為所需的發(fā)酵產(chǎn)物提供可調(diào)節(jié)的合成環(huán)境，同時(shí)PHA的積累能提高重組生產(chǎn)菌對(duì)惡劣環(huán)境的耐受力，特別是產(chǎn)物的反饋抑制，也有利于提高發(fā)酵產(chǎn)量的提高。
本發(fā)明利用PHA合成路徑調(diào)節(jié)微生物代謝，提高微生物發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，進(jìn)一步提高微生物抗逆性。本發(fā)明提供的方法是構(gòu)建含有PHA合成相關(guān)基因的質(zhì)粒，在導(dǎo)入相應(yīng)菌株中進(jìn)行表達(dá)。所述的菌株可以為各種微生物生產(chǎn)菌。將本發(fā)明的方法應(yīng)用到各種微生物生產(chǎn)菌中，可以有效的影響生產(chǎn)菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質(zhì)酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類(lèi)胡蘿卜素、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇云金桿菌粉劑、鳥(niǎo)苷、谷胱甘肽、赤蘚糖醇、D-核糖，1，3-丙二醇等生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，這些均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，如利用根據(jù)密碼子簡(jiǎn)并原則或堿基互補(bǔ)原則所獲得的與本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因功能基本相同的核酸分子，對(duì)于聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)酶，在其不起主要作用的位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸插入和/或缺失和/或替換所得到的功能基本相同的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因，來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“PHA”是指由微生物合成的聚羥基脂肪酸酯，其結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示，包括的PHA分子式例如聚羥基丁酸(PHB)、3-羥基丁酸和3-羥基戊酸的共聚物PHBV、3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚物PHBHHx以及中長(zhǎng)鏈單體如3-羥基己酸HHx到3-羥基十二酸3-HDD的單聚物或共聚物，。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“PHA合成途徑的相關(guān)基因”是指，在PHA合成途徑中，參與了PHA整個(gè)合成過(guò)程的各種相關(guān)合成酶和調(diào)控蛋白所對(duì)應(yīng)的基因；例如PHA合酶基因phaC，3-羥?；?酰基轉(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因phaG，(R)-烯?；?水合酶基因phaJ基因等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“抗逆性”是指微生物在偏離其最佳生長(zhǎng)條件下的環(huán)境中的生存能力，比如較高或較低的溫度，較高或較低的pH，較高或較低的滲透壓，較高的反饋抑制，有毒物質(zhì)的存在等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“微生物”包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌(例如酵母)等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵產(chǎn)物”是指一切通過(guò)微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化而得到的產(chǎn)品，比如有機(jī)酸、酒精、其他醇類(lèi)、抗生素、氨基酸、維生素等。
實(shí)施例1、在獸疫鏈球菌中表達(dá)Wautersia eutropha的phbCAB基因影響乳酸及透明質(zhì)酸產(chǎn)量菌種獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 399201)在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pBHR68質(zhì)粒(Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbüchel A.A sensitive，viable-colony stainingmethod using Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds.Arch Microbiol 1999，17173-80)為模板，用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC和GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT擴(kuò)增出phbCAB基因，然后經(jīng)過(guò)HindIII和ClaI酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308(Eichenbaum Z.and Federle MJ.Use of the lactococcalnisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteriacomparisonof induction level and promoter strength.Appl.Environ.Microbiol.1998，642763-2769)的Spac啟動(dòng)子下限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和ClaI的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pEUHB。然后通過(guò)SphI酶切將質(zhì)粒上的LacI基因切除，使phbCAB基因的表達(dá)不需要IPTG誘導(dǎo)，得到質(zhì)粒pEUHBNOI。
2)制備獸疫鏈球菌的感受態(tài)細(xì)胞，并將質(zhì)粒pEUHBNOI用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌中。
感受態(tài)細(xì)胞的制備將獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920在含有THYB(Todd-Hewitt broth)(從OXOID購(gòu)買(mǎi))36.4g/L和酵母浸出物0.5％的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h；然后將其接種到50mL新鮮的THYB培養(yǎng)基中，接種后D530不超過(guò)0.05，培養(yǎng)到OD530＝0.25即可；并在培養(yǎng)結(jié)束前半小時(shí)加入透明質(zhì)酸酶0.4mg/mL；4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用20mL 0.5mmol/L蔗糖溶液重懸細(xì)胞；4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用1mL 0.5mmol/L蔗糖溶液重懸細(xì)胞，再離心，棄上清；將細(xì)胞重懸在250μL含有10％甘油的0.5mmol/L蔗糖溶液中，按使用體積分裝到Eppendorf管中；迅速置于-80℃保存。
獸疫鏈球菌的電轉(zhuǎn)化在200μL感受態(tài)細(xì)胞中加入500-5000ng質(zhì)粒pEUHBNOI，冰浴10分鐘；將混合體系轉(zhuǎn)移到2mm電激杯中電激，電壓設(shè)為2.5kv；用1mL冰冷的THYB將混合體系轉(zhuǎn)移到10mLTHYB中，冰浴30-60分鐘；然后37℃靜置培養(yǎng)1小時(shí)；接著在14℃，6000g，離心10分鐘，菌體用1mL THYB重懸并涂于抗性平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，得到重組獸疫鏈球菌(含有pEUHBNOI的獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920)。
3)重組獸疫鏈球菌的發(fā)酵種子培養(yǎng)基成分為蔗糖20g/L，酵母粉10g/L，牛肉膏10g/L，MgSO4·7H2O2g/L，MnSO4·4H2O0.1g/L，KH2PO42g/L，微量元素液1mL/l，種子緩沖液40mL/l。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉20g/L，Na2HPO4·12H2O6.2g/L，MgSO4·7H2O2g/L，K2SO41.3g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O5mg/L，微量元素液2.5mL/l，蔗糖70g/L。其中微量元素液含CaCl22g/L，MnSO4·4H2O24mg/L，ZnCl246mg/L，CuSO4·5H2O19mg/L；種子緩沖液含Na2HPO4·12H2O36.76g/L，NaH2PO4·12H2O15.98g/L，NaHCO312.5g/L。
用接種環(huán)分別挑取平板上的獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920和重組菌菌種，分別接入裝有150mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于200rpm的搖床上培養(yǎng)14-16小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃；然后按10％(體積比)的接種量將種子接入發(fā)酵罐(7.5升發(fā)酵罐(NBS Bioflo 3000，NJ，USA)中裝液量3升)中。發(fā)酵罐控制溫度37℃，pH值7.0，通氣量5L/min。初始攪拌速度200rpm，當(dāng)溶氧降到0時(shí)升高轉(zhuǎn)速到500rpm，溶氧再次降到0時(shí)轉(zhuǎn)速調(diào)為650rpm，并維持到發(fā)酵結(jié)束，獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920發(fā)酵14小時(shí)，重組菌發(fā)酵16小時(shí)。分別測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸和乳酸的含量。結(jié)果表明獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920發(fā)酵14小時(shí)的透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)和乳酸產(chǎn)量分別為5.4g/L和65g/L。重組菌發(fā)酵14小時(shí)的透明質(zhì)酸和乳酸產(chǎn)量為5.6g/L和38g/L，乳酸產(chǎn)量下降42％；16小時(shí)的產(chǎn)量為7.3g/L和41g/L，透明質(zhì)酸產(chǎn)量上升34％，乳酸產(chǎn)量下降37％。乳酸合成是獸疫鏈球菌在缺氧條件下主要的獲取細(xì)胞內(nèi)氧化力(NAD)的途徑，因此細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的乳酸。而引入PHB合成途徑為細(xì)胞提供了一條外源的NAD再生途徑，從而可以降低乳酸途徑的壓力，使乳酸合成大大減少，乳酸的大量減少，使更多的的碳源能夠流向別的代謝途徑，從而使透明質(zhì)酸產(chǎn)量也得到一定提高。
其中，透明質(zhì)酸含量測(cè)定采用Bitter-Muir氏法(Bitter T.，Muri HM.A modifieduronic acid carbazol reaction.Anal.Biochem.1962，4330-334)，發(fā)酵液的測(cè)量樣品制備方法如下a)取1mL發(fā)酵液準(zhǔn)確稀釋到4mL，6000轉(zhuǎn)離心10分鐘；b)取1mL上清加入到4mL無(wú)水乙醇中，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；c)棄去上清，加入2mL 0.2mmol/LNaCl，放置，間或振蕩，直至最終溶解；d)加入4mL無(wú)水乙醇，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；e)棄去上清，沉淀用2mL去離子水溶解作為HA測(cè)定的樣品。乳酸鹽濃度的測(cè)定采用HPLC(SpectroSYSTEM P2000，Thermo Separation Products，USA)法。折光檢測(cè)器，離子交換柱Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm，流動(dòng)相為0.005mmol/L硫酸溶液，流速0.50mL/min。檢測(cè)前，取0.2mL發(fā)酵樣品，準(zhǔn)確稀釋到4mL，10000rpm/min離心5分鐘，去上清，0.45μm濾膜過(guò)濾后作為色譜的樣品。
實(shí)施例2、在光滑球擬酵母中表達(dá)phbCAB基因影響丙酮酸產(chǎn)量菌種光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019培養(yǎng)基斜面和種子培養(yǎng)基(L)葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，瓊脂20g/L(斜面用)，pH 5.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，蛋白胨15g/L(含氮量12％)，KH2PO45g/L，KCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.18g/L，煙酸4mg/L，鹽酸硫胺素20μg/L，鹽酸吡哆醇100μg/L，生物素10μg/L，核黃素50μg/L，pH5.0。
將質(zhì)粒pBHR68用BamHI和EcoRI酶切處理后，將獲得的5.2kb的片段插入到質(zhì)粒pPIC9K(購(gòu)于Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pPICHB。這個(gè)質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019中獲得重組菌(含有pPICHB的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取斜面培養(yǎng)的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，溫度30℃，通氣量2L/min，攪拌轉(zhuǎn)速700rpm，用5mol/L KOH控制pH為5.0。當(dāng)殘?zhí)墙抵?％時(shí)，按一定速率流加400g/L的葡萄糖液進(jìn)行流加培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。
取2mL發(fā)酵液在8000g離心5分鐘后，上清用乳酸脫氫酶法測(cè)定丙酮酸含量(Lamperecht W，Heinz F.InMethods of enzymatic analysis，ed.Bergmeyer，H.U.VCH，Weinheim，1984，6pp570-577)。細(xì)胞用去離子水洗兩次后真空冰干。結(jié)果表明重組菌的丙酮酸產(chǎn)量為68g/L，比光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019的52g/L提高了約31％。糖酵解產(chǎn)生丙酮酸的途徑是消耗NAD的，丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)被代謝掉則是合成NAD的過(guò)程。因此細(xì)胞內(nèi)大量積累丙酮酸需要一個(gè)高氧化力的環(huán)境。phbCAB基因的引入，能夠?yàn)榧?xì)胞提供氧化力，從而提高了丙酮酸的產(chǎn)量。
實(shí)施例3、在釀酒酵母中表達(dá)phbCAB基因影響麥角固醇產(chǎn)量菌種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338(中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種中心保藏號(hào))斜面，種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，瓊脂20g/L(斜面用)，pH 5.5。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，溫度30℃，通氣量2L/min，溶氧自動(dòng)控制在15％，控制pH為5.5。發(fā)酵10小時(shí)后每隔6小時(shí)補(bǔ)料一次，加入40g葡萄糖，重組菌培養(yǎng)基中加入遺傳霉素0.2g/L。發(fā)酵30小時(shí)后，終止發(fā)酵。麥角固醇含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)(許旭萍，李惠珍，佘晨興，謝華玲，林志軍。麥角固醇產(chǎn)生菌Torullopsis famata優(yōu)化發(fā)酵條件的研究。生物學(xué)雜志，2002，1915-17)。
測(cè)定結(jié)果表明重組菌的麥角固醇含量為1.2％，比釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFFI 01338的0.9％提高了33％。有研究表明，麥角固醇的合成具有氧代謝的特征，有氧條件有利于其合成。因此，phbCAB基因的引入，為細(xì)胞提供了更多的氧化力，從而促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)麥角固醇的合成。
實(shí)施例4、在釀酒酵母中表達(dá)phbCAB基因提高酵母菌的抗逆能力菌種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入新培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分為葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，瓊脂20g/L(斜面用)，pH5.5。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC2063和重組菌的種子在接入新培養(yǎng)基之前，各分為三組，一組在48℃放置1小時(shí)，一組在-80℃放置48小時(shí)，另一組不做處理。然后將種子分別接入新培養(yǎng)基后，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。計(jì)算未經(jīng)處理的種子與經(jīng)過(guò)處理的種子延滯期時(shí)間之差。結(jié)果表明重組菌的種子經(jīng)過(guò)冷或熱處理后，其活性并未受到大幅降低，即延滯期時(shí)間與未經(jīng)處理的種子相差不大。而釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063的種子活性經(jīng)過(guò)冷或熱處理后受到較大的影響。經(jīng)過(guò)熱處理后，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063的時(shí)間差為7小時(shí)，重組菌時(shí)間差為1小時(shí)，兩個(gè)相差6小時(shí)。即是說(shuō)積累PHA的細(xì)胞具有更好的惡劣環(huán)境耐受性，具有更強(qiáng)的生命力。這對(duì)于釀酒工業(yè)有重要的意義，由于發(fā)酵過(guò)程中酵母死亡會(huì)影響發(fā)酵，同時(shí)帶來(lái)不適的口味，因此強(qiáng)壯的菌株有著更好的應(yīng)用前景。
實(shí)施例5、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB影響肌苷的生物合成菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，玉米液7g/L，氯化鈉2.5g/L，尿素2g/L，pH值7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖140g/L，玉米液16g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L，硫酸銨16g/L，七水硫酸鎂4g/L，磷酸氫二鉀5g/L，碳酸鈣20g/L。
按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在32℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，自動(dòng)控制溫度35℃，pH6.5，攪拌速度600rpm，通氣量1L/min，到肌苷產(chǎn)量不再增加停止發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間68小時(shí)。肌苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0.5％磷酸氫二鉀，流速1.2mL/min，色譜柱為HypersilODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。HPLC測(cè)定結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162的苷產(chǎn)量為19g/L，重組菌的產(chǎn)量為24g/L，提高了26％。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP，同時(shí)從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調(diào)控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制，因此NADPH的減少能促進(jìn)葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)化。總的來(lái)說(shuō)，肌苷合成是一個(gè)需要大量氧化力的生化代謝過(guò)程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)肌苷的合成。phbCAB基因的引入，正能實(shí)現(xiàn)這一要求，因此能夠顯著的提高肌苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例6、在嗜堿芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB基因影響彈性蛋白酶產(chǎn)量菌種嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B(Takagi H，Tsai YC，NakamoriS，Yamasaki M.Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase fromAlkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition.Biosci BiotechBiochem，1995，591591-1592)種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀1g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈉10g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，豆餅粉5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸氫二鉀0.75g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉20g/L，碳酸鈉10g/L。
將實(shí)施例1中獲得的pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)Ya-B中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。獲得重組菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的嗜堿芽孢桿菌嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在37℃、250rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以1％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，37℃，250rpm培養(yǎng)48小時(shí)，停止發(fā)酵。將發(fā)酵液8000g離心十分鐘，收集上清，用硫酸銨分級(jí)鹽析(30％-65％飽和度)，沉淀溶于0.05mol/l pH9.0硼酸緩沖液中，得到粗酶液。1mL粗酶液中與20mg地衣紅-彈性蛋白中分別加入1mL 0.05mol/L pH9.0硼酸緩沖液于55℃水浴保溫一小時(shí)，不時(shí)振蕩。分別以2mL 0.7mol/L pH6.0磷酸緩沖液終止反應(yīng)，8000g離心10分鐘，上清于590nm測(cè)吸光度值。20mg地衣紅-彈性蛋白完全水解后，590nm處光吸收值的一半為10個(gè)酶活力單位。
經(jīng)過(guò)48小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)后，重組菌的酶活198U/mL比嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)176U/mLYa-B高12.5％，重組菌具有更高的彈性蛋白酶產(chǎn)量。研究表明，高溶氧有利于彈性蛋白酶的合成，其合成是一個(gè)需要氧化力的過(guò)程。phbCAB基因的引入，正好能夠?yàn)榧?xì)胞提供更多的氧化力，這是有利于彈性蛋白酶的合成的。
實(shí)施例7、在紅酵母中表達(dá)phbCAB基因影響類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量菌種紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353(印度國(guó)家工業(yè)微生物菌種保存中心)斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖35g/L，麥芽提取物3g/L，酵母粉2g/L，KH2PO43g/L，K2HPO43g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，瓊脂20g/L，pH6.0。
液體培養(yǎng)基為葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，KH2PO42g/L，K2HPO42g/L，pH6.0。
將實(shí)施例2中獲得的pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到紅酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353中獲得重組菌(含有pPICHB的紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在28℃、240rpm下培養(yǎng)18小時(shí)后，以5％(v/v)接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基(100mL/500mL錐形瓶)，28℃，240rpm培養(yǎng)72小時(shí)。發(fā)酵液3000rpm離心十分鐘收集菌體，用去離子水洗兩次后冰干稱(chēng)重。每克菌體加5mL 3mol/L HCl，室溫下浸泡1小時(shí)，在沸水浴中煮4分鐘，迅速冷卻，3000g離心十五分鐘，棄去上清，沉淀用去離子水洗兩次后加3mL丙酮，室溫下振蕩三十分鐘，再3000g離心二十分鐘，上清即為類(lèi)胡蘿卜素提取液，將提取液稀釋后，測(cè)475nm處吸光度值，按下式計(jì)算胡蘿卜素含量胡蘿卜素含量(μg/g菌體)＝A475×V×D/0.16w。A475為胡蘿卜素吸光度值，V為提取所用溶劑量(mL)，D為樣品稀釋倍數(shù)，w為菌體量(g)，0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。
結(jié)果表明紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353的類(lèi)胡蘿卜素含量為76μg/g，而重組菌的含量為92μg/g，提高了21％。高氧化力環(huán)境有利于類(lèi)胡蘿卜素的合成。phbCAB基因的導(dǎo)入，能夠?yàn)榧?xì)胞提供氧化力，從而促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素的合成。
實(shí)施例8、在谷氨酸棒桿菌種表達(dá)phbCAB影響谷氨酰胺合成菌種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032。
種子培養(yǎng)基及發(fā)酵成分為一水葡萄糖50g/L，(NH4)2SO47.5g/L，NaCl 2g/L，CH3COONa·2H2O 3g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，K2HPO4·3H2O 8g/L，KH2PO42g/L，尿素5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，鹽溶液10mL/l，生物素6μg/L，維生素B1 1mg/L，卡那霉素20mg/L。其中鹽溶液為MnSO4·7H2O 20mg，Na2B4O7·10H2O 2mg，(NH4)5MO7O24·4H2O 1mg，F(xiàn)eCl2·6H2O 20mg，ZnSO4·7H2O 5mg，CuSO4·5H2O 2mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 250mg，溶于50mL 1mol/L HCl中。
將實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中獲得重組菌(含有pEUHB的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032和重組菌，分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，自動(dòng)控制溫度30℃，pH 6.5，攪拌速度600rpm，通氣量1L/min，發(fā)酵48小時(shí)，停止發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中谷氨酰胺含量。谷氨酰胺的測(cè)定用新華3號(hào)濾紙?jiān)谑覝叵掠貌伙柡头ㄕ归_(kāi)，展開(kāi)劑用體積比為5∶2的正丙醇和濃氨水的混合液，上行法展開(kāi)。稱(chēng)取谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，配成1％，1.5％，2％，2.5％，3％等不同質(zhì)量濃度的溶液，每種溶液點(diǎn)樣1μL，發(fā)酵液離心取上清點(diǎn)樣1μL。展析完成后風(fēng)干濾紙，用0.5g/L茚三酮丙酮溶液顯色，105℃烘干5分鐘，濾紙上出現(xiàn)紫紅色氨基酸斑點(diǎn)，剪下氨基酸斑點(diǎn)，用洗脫液(體積比為2∶38的0.1g/L CuSO4·5H2O和75％乙醇的混合液)洗脫30分鐘，然后在520nm處測(cè)光吸收，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得發(fā)酵液中谷氨酰胺含量。結(jié)果表明谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的谷氨酰胺產(chǎn)量為11g/L，重組菌產(chǎn)量為14g/L，提高約27％。phbCAB基因的引入，能夠減少丙酮酸向乳酸的代謝，促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，而谷氨酰胺的前體正是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，這樣能夠?yàn)楣劝滨０返暮铣商峁└嗟那绑w，因此產(chǎn)量得到提高。
實(shí)施例9、在乳酸發(fā)酵短桿菌中表達(dá)phbCAB影響賴(lài)氨酸產(chǎn)量菌種乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269。
斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，pH7.2-7.4。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO41％，MgSO4·7H2O 0.04％，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg/L，MnSO4·H2O 0.8mg/L，生物素5μg/L，VB1 20mg/L，豆餅水解液5％，pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖14％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO44％，MgSO4·7H2O 0.04％，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg/L，MnSO4·H2O 0.8mg/L，生物素5μg/L，維生素B1 20mg/L，豆餅水解液5％，碳酸鈣2％，pH 7.0。
將實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269中獲得重組菌(含有pEUHB的乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269和重組菌，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液量30mL，于搖床上30℃，110rpm，培養(yǎng)12小時(shí)。接種2mL一級(jí)種子于30mL二級(jí)種子培養(yǎng)基中，于搖床上30℃，110rpm，培養(yǎng)10-12小時(shí)。然后取1mL二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，500mL搖瓶裝液量20mL，30℃，110rpm，培養(yǎng)72小時(shí)。賴(lài)氨酸含量用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液經(jīng)3500g離心15分鐘，取上清0.1mL稀釋到100mL，取1mL稀釋液加入到4mL茚三酮試劑(取水合茚三酮1.0g，加入乙二醇甲醚75mL，另取1.34g CuCl2·2H2O加入pH1.3檸檬酸緩沖液25mL中，混合兩種溶液后，再加蒸餾水100mL，得到茚三酮溶液)中，沸水浴加熱20分鐘，快速冷卻后測(cè)定478nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定賴(lài)氨酸含量。
結(jié)果表明乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269賴(lài)氨酸產(chǎn)量為53g/L，而重組菌的產(chǎn)量為58g/L，約有10％的提高。在合成代謝中，賴(lài)氨酸的前體物質(zhì)草酰乙酸有三條途徑合成，但都與丙酮酸和NADP/NADPH的代謝有關(guān)，因此phbCAB基因的導(dǎo)入能對(duì)賴(lài)氨酸的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。
實(shí)施例10、在大腸桿菌中表達(dá)phbCAB基因影響苯丙氨酸產(chǎn)量菌種大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882。
種子培養(yǎng)基成分為蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，葡萄糖2％，pH7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為Na2HPO4·12H2O20g/L，檸檬酸鈉6g/L，谷氨酸鈉0.4g/L，酪氨酸0.6g/L，葡萄糖20g/L。
補(bǔ)料培養(yǎng)基CaCl2·2H2O 0.6g/L，酪氨酸500mg/L，葡萄糖500g/L，MgSO4·7H2O1g/L，維生素B1 500mg/L，氨水28％。
將pBHR68質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882中獲得重組菌(含有pBHR68的大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882和重組菌，分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，自動(dòng)控制溫度38.5℃，pH 7.0，溶氧20％，通過(guò)補(bǔ)料控制葡萄糖濃度在1.5％，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。苯丙氨酸含量測(cè)定方法如下取2μL發(fā)酵液上清點(diǎn)樣于濾紙上，置于層析液中單向上行展析16小時(shí)，烘干后以茚三酮噴涂顯色，以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸為對(duì)照，剪下層析后的著色斑點(diǎn)，置于65％的乙醇溶液中脫色2小時(shí)，測(cè)定520nm下光吸收，氨基酸量＝標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液濃度×被測(cè)發(fā)酵液光密度/標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液光密度。
結(jié)果表明大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882發(fā)酵得到苯丙氨酸濃度為8.2g/L，而重組菌產(chǎn)物濃度為10.6g/L，提高了29％。對(duì)于大腸桿菌的氨基酸合成，如果用全局的代謝調(diào)控能夠取得較好的效果。而phbCAB基因的引入，一個(gè)有效的調(diào)控是能增強(qiáng)磷酸戊糖途徑，有利于氨基酸的合成。
實(shí)施例11、在熒光假單胞菌中表達(dá)phbCAB基因影響葡萄糖酸產(chǎn)量菌種熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，pH7.0。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2％，玉米漿1％，尿素0.2％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉水解糖14％，玉米漿1.5％，輕質(zhì)碳酸鈣4％，pH 6.7。
將質(zhì)粒pBHR68經(jīng)過(guò)HindIII和BamHI酶切處理后，插入到質(zhì)粒pBBR1MCS2(KovachME，Elzer PH，Hill DS，Robertson GT，F(xiàn)arris MA，Roop RM，Peterson KM.Four newderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995，166175-176)的HindIII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pBBRHB。這個(gè)質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)AS 1.55中獲得重組菌(含有pBBRHB的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)AS 1.55)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、230rpm下培養(yǎng)16小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500mL裝液量50mL，在30℃、230rpm下培養(yǎng)72小時(shí)。發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量＝25℃下發(fā)酵液旋光度絕對(duì)值/0.88。
熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1005的發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量為13.4g/L，重組菌的產(chǎn)量為16g/L，提高了大約19％，phbCAB基因的導(dǎo)入，有利于提高菌的的耐受力，生長(zhǎng)得更好，從而得到更高的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例12、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB基因影響α-淀粉酶合成菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556。
種子培養(yǎng)基成分為(300mL)葡萄糖1g，牛肉膏1g，蛋白胨1g，NaCl 1g，KH2PO41g，淀粉1g，pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(200mL)牛肉膏1g，蛋白胨1g，NaCl 1g，KH2PO41g，NaH2PO41g，淀粉3g。
將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 21556)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在32℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，32℃，200rpm培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定α-淀粉酶酶活力。酶活力測(cè)定取5mL發(fā)酵液，4000g離心15分鐘，取上清與5-乙縮醛-麥芽庚糖-對(duì)-硝基苯反應(yīng)，酶活力單位定義為37℃，1分鐘分解1μmol淀粉為葡萄糖即為1個(gè)酶活單位。
結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556的發(fā)酵液中酶活為67U/L，而重組菌酶活為76U/L。重組菌的發(fā)酵液中有更高的淀粉酶活力，這可能是因?yàn)閜hbCAB基因?qū)е录?xì)胞內(nèi)的代謝途徑發(fā)生變化，使其傾向于有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的方向，提高了細(xì)胞利用淀粉作為碳源的能力，即是增加了細(xì)胞的淀粉酶產(chǎn)率。
實(shí)施例13、在釀酒酵母中表達(dá)phbCAB基因影響酒精產(chǎn)量菌種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
固體培養(yǎng)基配制量取5Bx麥汁200mL放入500mL燒杯中，在沸騰狀態(tài)下加入4g瓊脂，不斷攪拌直至完全融化，分裝于試管中高壓滅菌，然后放斜面；液體培養(yǎng)基配制量取5Bx麥汁110mL裝入250mL三角瓶中，調(diào)pH4.8-5.0，然后高壓滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基配制稱(chēng)淀粉300g倒入1200mL 40℃溫水中，攪拌均勻，加入0.2％氯化鈣，調(diào)節(jié)pH6.0-6.2，稱(chēng)取液化酶1g，于90℃-93℃溫度下液化30分鐘，直至加入碘液不變色，液化結(jié)束后將其迅速冷卻到58℃-60℃，并調(diào)pH值為4.4-4.6，加入1mL糖化酶(十萬(wàn)單位)進(jìn)行糖化，在淀粉水解液的糖度在23Bx時(shí)停止，加入2％的玉米漿，并煮沸1小時(shí)，冷卻過(guò)濾，然后調(diào)pH到4.8-5.0，滅菌待用。發(fā)酵時(shí)按10％(v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃保溫發(fā)酵72小時(shí)。乙醇濃度用高效液相色譜測(cè)量發(fā)酵液8000g離心十分鐘，取上清過(guò)濾后作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動(dòng)相為98％的濃硫酸∶H2O(體積比為0.5∶1000)，流速1mL/min。
結(jié)果表明釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063發(fā)酵液乙醇濃度為15％，而重組酵母的乙醇濃度為20％，提高了33％，phbCAB基因的引入，不僅可以改變細(xì)胞內(nèi)的代謝流，而且PHA的合成能夠提高重組酵母對(duì)高乙醇環(huán)境的耐受性，從而提高了乙醇的產(chǎn)量。
實(shí)施例14、在克魯斯假絲酵母中表達(dá)phbCAB基因影響甘油產(chǎn)量菌種克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，碳酸鈣5g/L，瓊脂20g/L。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖200g/L，尿素2g/L，玉米漿7g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖200g/L，尿素2g/L，玉米漿6g/L。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196中獲得重組菌(含有pPICHB的克魯斯假絲酵母(Candidakrusei)ACCC 2196)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(40mL/500mL錐形瓶)，在30℃、230rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，自動(dòng)控制pH5.5，溫度30℃，通氣量0.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速450rpm，殘?zhí)墙咏?時(shí)停止發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中甘油含量。發(fā)酵液中甘油含量用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液8000g離心十分鐘，取上清過(guò)濾后作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2 Spherogel配合基交換柱，流動(dòng)相為98％的濃硫酸∶H2O(體積比為0.5∶1000)，流速1mL/min。
結(jié)果表明克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196最終甘油濃度為62g/L，而重組菌為75g/L，提高了21％。在發(fā)酵過(guò)程中，有相當(dāng)部分的碳源會(huì)流向乙醇合成，這降低了甘油的得率。乙醇途徑是為細(xì)胞提供氧化力的一條途徑，phbCAB基因得引入，能夠降低乙醇途徑的壓力，促進(jìn)糖酵解，使更多的碳源流向甘油合成，增加了甘油的得率。
實(shí)施例15、在熱帶假絲酵母中表達(dá)phbCAB基因影響十二碳二元酸的合成菌種熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH22248(任剛，陳遠(yuǎn)童，十二碳二元酸的發(fā)酵研究，生物工程學(xué)報(bào)，2000，16198-202)。
斜面培養(yǎng)基成分為10Bx的麥芽汁，1.5％瓊脂粉。
種子培養(yǎng)基成分為酵母膏5g，玉米漿3g，蔗糖5g，KH2PO48g，加水定容至1L滅菌，接種時(shí)再加入尿素0.3％，重臘5％。
發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母膏2g，玉米漿1g，蔗糖2g，KH2PO48g，NaCl 1g，加水定容至100mL滅菌，接種時(shí)再加正十二烷20％，尿素0.12％，重臘3.3％，pH 7.3。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH22248中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)UH22248)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
將斜面培養(yǎng)48小時(shí)的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH22248和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基中(100mL/500mL搖瓶)，在30℃、180rpm下培養(yǎng)48小時(shí)后，接種3mL到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180rpm培養(yǎng)4天，發(fā)酵結(jié)束。取15ml發(fā)酵液，用6mol/LHCl調(diào)pH值到3.0，加入120mL乙醚，搖動(dòng)100次，放置30分鐘，然后倒出40mL乙醚提取液，通風(fēng)櫥中風(fēng)干得到白色固體，然后將其用95％的中性熱乙醇溶解，加入一滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計(jì)算十二碳二元酸產(chǎn)量。
結(jié)果表明重組菌(十二碳二元酸產(chǎn)量為92g/L)顯示出了比熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)UH22248(十二碳二元酸產(chǎn)量為78g/L)更高的十二碳二元酸產(chǎn)量，發(fā)酵液比較粘稠，細(xì)胞處于一種低溶氧水平的環(huán)境，phbCAB基因的引入能夠在這種條件下為細(xì)胞提供氧化力，同時(shí)其可能也對(duì)脂肪酸氧化途徑有抑制作用，從而增加了發(fā)酵液中的二元酸產(chǎn)量。
實(shí)施例16、在熱帶假絲酵母中表達(dá)phbCAB基因影響十五碳二元酸的合成菌種熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14(陳遠(yuǎn)童，郝秀珍，龐月川，十五碳二元酸的發(fā)酵研究，微生物學(xué)報(bào)，1995，35433-437)。
斜面培養(yǎng)基成分為10Bx的麥芽汁，1.5％瓊脂粉。
種子培養(yǎng)基成分為酵母膏5g/L，玉米漿3g/L，蔗糖5g/L，KH2PO48g/L配好滅菌，接種時(shí)再加入尿素0.3％，重臘5％。
發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母膏2g/L，玉米漿1g/L，蔗糖1g/L，KH2PO48g/L，NaCl 1g/L加水定容至100mL滅菌，接種時(shí)再加正十五烷20％，尿素0.12％，pH 7.5。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)T25-14)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
將斜面培養(yǎng)48小時(shí)的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14和重組菌的種子分別接種到種子培養(yǎng)基中(50mL/500mL搖瓶)，在30℃、220rpm下培養(yǎng)48小時(shí)后，5％(v/v)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(50mL/500mL搖瓶)，30℃、220rpm培養(yǎng)72小時(shí)。取15ml發(fā)酵液，用6mol/l HCl調(diào)pH值到3.0，加入120ml乙醚混勻，放置直到分層，除去水層，放出乙醚提取液，通風(fēng)櫥中風(fēng)干得到白色固體，然后將其用95％的中性熱乙醇溶解，加入一滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計(jì)算二元酸產(chǎn)量。
結(jié)果表明熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14的二元酸產(chǎn)量為36g/L，重組菌為43g/L，提高了19％。重組菌發(fā)酵液比較粘稠，細(xì)胞處于一種低溶氧水平的環(huán)境，phbCAB基因的引入能夠在這種條件下為細(xì)胞提供氧化力，同時(shí)其可能也對(duì)脂肪酸氧化途徑有抑制作用，從而增加了發(fā)酵液中的二元酸產(chǎn)量。
實(shí)施例17、在蘇云金芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB基因?qū)ρ挎咝纬傻挠绊懢N蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068。
將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068中獲得重組菌(含有pEUHB的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068和重組菌，分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在25℃、220rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以1％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，25℃，220rpm發(fā)酵36小時(shí)。培養(yǎng)基成分均為牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，pH7.2。發(fā)酵后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)量孢子含量。
通過(guò)顯微鏡觀測(cè)可以看到，重組菌的菌體量(10.2*109個(gè)/ml)以及孢子數(shù)(1.5*109個(gè)/ml)都高于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068(菌體量9.1*109個(gè)/ml，孢子數(shù)1.1*109個(gè)/ml)。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明高溶氧是有利于孢子形成的。phbCAB基因的引入，能夠促進(jìn)孢子形成。
實(shí)施例18、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB影響鳥(niǎo)苷合成菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，玉米液10g/L，氯化鈉5g/L，尿素2g/L，味精5g/L，pH 7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖120g/L，豆餅水解液50g/L，酵母粉16g/L，硫酸銨15g/L，七水硫酸鎂4g/L，磷酸氫二鉀2g/L，味精10g/L，碳酸鈣2g/L，pH 7.0-7.2。
將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB通過(guò)乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 19220)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在36℃、140rpm下培養(yǎng)10小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，36℃、220rpm下培養(yǎng)60小時(shí)，測(cè)定鳥(niǎo)苷含量。鳥(niǎo)苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0.5％磷酸氫二鉀，流速1.2mL/min，色譜柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。
結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220鳥(niǎo)苷產(chǎn)量為16g/L，重組菌的產(chǎn)量為20g/L，提高了25％。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為鳥(niǎo)苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)鳥(niǎo)苷的合成。phbCAB基因的引入，正能實(shí)現(xiàn)這一要求，因此能夠顯著的提高鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例19、在釀酒酵母中表達(dá)phbCAB基因影響谷胱甘肽產(chǎn)量菌種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186(Sakato K，Tanaka H.Advancedcontrol of glutathione fermentation process.Biotechnol Bioeng，1992，40904-912)。
斜面培養(yǎng)基成分為麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，磷酸氫二銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸氫二鉀1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，pH 7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖70g/L，酵母粉15g/L，麥汁60g/L，磷酸氫二銨10g/L，硫酸鎂5g/L，蜜糖28g/L，玉米漿16g/L，磷酸氫二鉀1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，ZnCl210mg/L，F(xiàn)eCl26mg/L，CuCl26mg/L，MnCl26mg/L，pH 7.0-7.2。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186中獲得重組菌(含有的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)KY6186)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、180rpm下培養(yǎng)24小時(shí)后，以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，7.5L發(fā)酵罐中裝液量3L發(fā)酵，自動(dòng)控制溫度30℃，pH5.4，通氣量2L/min，前兩小時(shí)轉(zhuǎn)速200rpm，之后每小時(shí)升高100rpm，直到600rpm，維持到發(fā)酵結(jié)束，36小時(shí)停止發(fā)酵。取發(fā)酵得到的新鮮酵母用蒸餾水洗三次后，在40％的乙醇中，30℃萃取2小時(shí)，3000g離心，取上清用ALLOXAN法(上海市醫(yī)藥化驗(yàn)所臨床生化檢驗(yàn)(上冊(cè))，上海，上?？茖W(xué)與技術(shù)出版社，1979)測(cè)定谷胱甘肽含量。
結(jié)果表明釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186發(fā)酵液谷胱甘肽濃度為1.3g/L，而重組菌的谷胱甘肽濃度為1.6g/L，提高了23％。研究表明乙醇合成的降低有利于谷胱甘肽的合成，而乙醇合成是一個(gè)消耗還原力，獲得氧化力的過(guò)程，phbCAB基因的引入可以抑制乙醇的合成，提高谷胱甘肽產(chǎn)量。
實(shí)施例20、在球擬酵母中表達(dá)phbCAB基因?qū)Τ嗵\糖醇產(chǎn)量的影響菌種球擬酵母(ToruLopsis sp)B845(吳燕，楊曉偉，陸茂林，赤蘚糖醇產(chǎn)生菌B845的形態(tài)，生理特征，生物技術(shù)，2002，1220-21)。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖10％，酵母膏1％，脲0.1％，瓊脂2％，pH 7.0-7.2。
種子和發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20％，酵母膏0.5％，脲0.1％，pH 7.0-7.2。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到球擬酵母(ToruLopsis sp)B845中獲得重組菌(含有pPICHB的球擬酵母(ToruLopsis sp)B845)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的球擬酵母(ToruLopsis sp)B845和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(40mL/500mL錐形瓶)，在30℃、180rpm下培養(yǎng)3天后，以5％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(50mL/500mL錐形瓶)，30℃、180rpm下培養(yǎng)3天，測(cè)定赤蘚醇的產(chǎn)量。赤蘚糖醇產(chǎn)量用高碘酸氧化法測(cè)量(原野，應(yīng)向賢，范光先，諸葛健，高碘酸氧化法直接測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇，無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，1972-75)。結(jié)果表明球擬酵母(ToruLopsis sp)B845的赤蘚糖醇產(chǎn)量為50g/L，重組菌為55g/L，提高在10％左右，作為赤蘚糖醇生產(chǎn)菌，需要有良好的耐高滲能力和代謝碳源能力，而phbCAB基因的引入，導(dǎo)致胞內(nèi)PHA的合成，是有利于提高上述能力的，因此對(duì)赤蘚糖醇的合成也有一定的促進(jìn)作用。
實(shí)施例21、在短小芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB基因影響D-核糖產(chǎn)量菌種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，玉米漿26g/L，磷酸氫二鉀0.03g/L，磷酸二氫鉀0.01g/L，pH 6.7。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖180g/L，玉米漿28g/L，硫酸銨13g/L，硫酸錳0.05g/L，pH 7.0。
將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095中獲得重組菌(含有pEUHB的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)ATCC 31095)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在37℃、180rpm下培養(yǎng)18-20小時(shí)，以10％(v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，控制溫度37℃，通氣量3L/min，攪拌速度650rpm，發(fā)酵72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中的D-核糖含量。D-核糖用地衣酚法測(cè)量發(fā)酵液5000g離心10分鐘，上清用蒸餾水稀釋?zhuān)购颂橇靠刂圃?0-90g/3mL范圍內(nèi)；取3mL稀釋液，依次加入0.1％氯化鐵濃鹽酸溶液3mL，0.1％地衣酚乙醇溶液0.3mL，搖勻，沸水浴40分鐘，自來(lái)水冷卻后在60分鐘內(nèi)測(cè)量670nm吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算核糖濃度。結(jié)果表明短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095的核糖濃度為55g/L，而重組菌可以達(dá)到72g/L，上升了31％。細(xì)胞內(nèi)核糖的合成是通過(guò)磷酸戊糖途徑，這個(gè)途徑消耗大量的細(xì)胞內(nèi)氧化力，而通過(guò)增加溶氧滿(mǎn)足細(xì)胞的代謝需求會(huì)促進(jìn)孢子的形成，這不利于通過(guò)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)生產(chǎn)核糖，因此phbCAB基因的引入，能從內(nèi)源的途徑為細(xì)胞提供一定的氧化力NADPH，從而有利于核糖的合成。
實(shí)施例22、在大腸桿菌中表達(dá)phbCAB提高細(xì)菌對(duì)重金屬離子Hg2+的耐受性菌種大腸桿菌(Escherichia coli)JM109。
大腸桿菌(Escherichia coli)JM109的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(g/100mL)蛋白胨1.0；酵母提取物0.5；NaCl 1.0，pH 7.0。
重組菌的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素至終濃度60μg/mL。
將質(zhì)粒pBHR68用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)JM109獲得重組菌(含有pBHR68的大腸桿菌(Escherichia coli)JM109)。野生型E.coli JM109作為對(duì)照。
將大腸桿菌(Escherichia coli)JM109和重組菌分別接入加入了1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、8mg/L或10mg/L HgCl2的各自的基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為500mL三角瓶裝液量100mL，37℃，200rpm，培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液的OD600。結(jié)果表明當(dāng)Hg2+濃度為4mg/L時(shí)，重組菌的生長(zhǎng)受到一定抑制，最大OD600從2.7降到了1.9；當(dāng)Hg2+濃度上升到10mg/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)幾乎完全停止。實(shí)驗(yàn)還表明對(duì)于未經(jīng)外源基因轉(zhuǎn)化的原始宿主菌E.coli JM109，在Hg2+濃度為2mg/L時(shí)就完全不能生長(zhǎng)。PHB基因的轉(zhuǎn)入使細(xì)菌對(duì)汞的耐受力得到了增強(qiáng)。
在相同操作條件下兩種菌體從2.5mg/L Hg2+濃度的模擬廢水中富集汞離子，重組菌的最終富集量為5.1mg/g細(xì)胞干重，而原始E.coli JM109則僅為1.7mg/g細(xì)胞干重。其中，細(xì)胞干重用冰干法測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)表明加入PHB合成基因的重組菌與大腸桿菌(Escherichia coli)JM109相比對(duì)于Hg2+的耐受程度有了較大的提高，在相同的條件下能夠更好的在含有重金屬離子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
實(shí)施例23、移動(dòng)單胞菌中表達(dá)phbCAB提高細(xì)菌的對(duì)高酒精環(huán)境耐受性菌種移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
將按照實(shí)施例11的方法獲得的質(zhì)粒pBBRHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基組分(g/L)葡萄糖100，蛋白胨10，酵母膏15，pH 6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)葡萄糖150，蛋白胨25，酵母膏25，pH4.5或pH6.0。
發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度、菌體濃度、還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定參考(Ingram LO，GomezPF，Lai X，Moniruzzaman M，Wood BE，Yomano LP and York SW.Metabolic engineeringof bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998，58204-214)培養(yǎng)條件冰箱保藏的菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后，以10％(v/v)的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行靜止厭氧乙醇發(fā)酵。
發(fā)酵三角瓶250mL，裝液量為100mL，發(fā)酵pH4.5(重組菌)，溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286的發(fā)酵pH 4.5和6.0作為對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)表明，移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 4.5和6.0的乙醇產(chǎn)量分別為21.1g/L和62.5g/L，重組菌在pH4.5的乙醇產(chǎn)量為59.2g/L，接近移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 6.0時(shí)的水平，表明phbCAB基因的轉(zhuǎn)入有效的提高了細(xì)菌的耐酸性，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件可以在較低的pH下實(shí)現(xiàn)乙醇的高效生產(chǎn)。
實(shí)施例24、在移動(dòng)假單胞菌中表達(dá)phbCAB提高細(xì)菌對(duì)葡萄糖的利用能力菌種移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
將按照實(shí)施例11的方法獲得的質(zhì)粒pBBRHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基組分(g/L)蛋白胨10，酵母膏15，pH 6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)蛋白胨25，酵母膏25，pH 6.0，葡萄糖。其中，葡萄糖的濃度分別為120，150，160，180，210g/L梯度。
發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度、菌體濃度、還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定參考(Ingram LO，GomezPF，Lai X，Moniruzzaman M，Wood BE，Yomano LP and York SW.Metabolic engineeringof bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998，58204-214)培養(yǎng)條件冰箱保藏的菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后，以體積分?jǐn)?shù)10％的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行靜止厭氧乙醇發(fā)酵。
發(fā)酵三角瓶500mL，裝液量為100mL，發(fā)酵pH 6.0，溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間48h。分別在不同濃度的葡萄糖條件下培養(yǎng)移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286和重組菌。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在葡萄糖濃度150g/L時(shí)，乙醇的產(chǎn)量達(dá)到最大，為65g/L，而重組菌在葡萄糖濃度增加到210g/L時(shí)乙醇的產(chǎn)量一直是上升趨勢(shì)，最大為95g/L。PHB合成途徑的導(dǎo)入使得細(xì)菌對(duì)于滲透壓的抗性增強(qiáng)，初糖濃度很高時(shí)依然保持良好的生長(zhǎng)。移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286的乙醇發(fā)酵過(guò)程有著比酵母更高的葡萄糖的利用率，但是當(dāng)初始的葡萄糖濃度達(dá)到一定程度后，乙醇產(chǎn)量反而下降。當(dāng)轉(zhuǎn)入PHB的合成基因后，發(fā)酵達(dá)到乙醇最大產(chǎn)量的初糖濃度比移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286有了一定的提高。表明phbCAB的轉(zhuǎn)入有利于提高細(xì)菌對(duì)滲透壓抵抗程度。
實(shí)施例25、在丁酸梭芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB提高從甘油發(fā)酵制備1，3-丙二醇(1，3-PDO)的生產(chǎn)菌種丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260。
將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260中獲得重組菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
該發(fā)酵需厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油6％，葡萄糖1％，玉米漿2％，(NH4)2SO40.2％。發(fā)酵溫度為34℃，初始pH為6.5～7。
培養(yǎng)條件間歇發(fā)酵分為兩步進(jìn)行，首先將丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260和重組菌分別接于裝液量為100mL的150mL三角瓶中，在厭氧條件下，于36℃，100rpm，培養(yǎng)15h，然后以10％(v/v)的接種量接入裝液量為200mL的250mL三角瓶中，石蠟液封，于34℃、150rpm、初始pH 6.8進(jìn)行發(fā)酵。定期取樣測(cè)定甘油殘余量和1，3-PDO的生成量。
發(fā)酵液中甘油和1，3-PDO的濃度用氣相色譜法檢測(cè)，色譜柱為大口徑毛細(xì)管，0.5mm×20m，柱溫170℃、氣化室溫度260℃，載氣為氮?dú)猓魉?0mL/min，采用內(nèi)標(biāo)法(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為1，62己二醇)定量。
產(chǎn)物分離發(fā)酵液離心后，上清液用油浴蒸餾得到1，3-PDO產(chǎn)品。
菌體生長(zhǎng)的生物量用比色法檢測(cè)(OD650nm)。
丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260的1，3-丙二醇產(chǎn)量為15.7g/L，而重組菌為20.4g/L。丁酸梭桿菌的生長(zhǎng)pH在6～7.5之間，其以甘油為底物的發(fā)酵代謝的副產(chǎn)物主要為丁酸和乙酸，因而在發(fā)酵過(guò)程中的酸度的上升將會(huì)嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng)，同時(shí)抑制1，3-PDO生成。由此可見(jiàn)要獲得高產(chǎn)的1，3-PDO在發(fā)酵過(guò)程中須將pH控制在6.5～7之間。如果將PHB的合成基因?qū)氲郊?xì)菌中，使得細(xì)菌對(duì)酸性條件的耐受性增強(qiáng)，則可以在不用調(diào)節(jié)pH的條件下獲得較高的1，3-PDO產(chǎn)量。
實(shí)施例26、芽孢桿菌中表達(dá)phbCAB提高細(xì)菌厭氧條件下的對(duì)原油的分解菌種芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23(李清心，康從寶，王浩，張長(zhǎng)鎧，芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化及其在室內(nèi)條件下提高原油采收率的初步研究，工業(yè)微生物，2002，3228-31)。
重組菌的獲得將按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23中獲得重組菌(含有pEUHB的芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨2，Na2HPO44，KH2PO42，MgSO40.5，CaCl20.005，pH7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30，(NH4)2SO415，Na2HPO42，KH2PO42，MgSO40.5，pH 7.2。
將芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23和重組菌菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后，以體積分?jǐn)?shù)10％的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵三角瓶500mL，裝液量為100mL，溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。
發(fā)酵液中菌體濃度測(cè)定取培養(yǎng)液經(jīng)6000g離心30分鐘后，用等量蒸餾水制成菌懸液，然后稀釋?zhuān)?22型分光光度計(jì)于660nm處測(cè)定菌懸液的OD值，事先作好標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程，然后依此測(cè)得發(fā)酵液中菌體濃度。
原油降粘實(shí)驗(yàn)將不同濃度的芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23或重組菌的發(fā)酵液，加入到來(lái)源不同的原油中，45℃培養(yǎng)24h，用離心機(jī)離心脫水后，再用粘度計(jì)測(cè)粘度的變化，求出降粘率。對(duì)于來(lái)源不同的原油，細(xì)菌的降粘效果有所不同，可能是這些原油的組成成分不同所致。原油中含有豐富的烴類(lèi)、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)類(lèi)等物質(zhì)，從而使得原油具有一定的粘度。細(xì)菌在原油中生長(zhǎng)時(shí)可以利用原油中的成分作為其生長(zhǎng)的碳源，因此，對(duì)于其能降低原油粘度的原因分析有以下兩種可能一是通過(guò)對(duì)原油中烴類(lèi)及其它物質(zhì)的降解使原油的粘度下降；二是微生物利用原油產(chǎn)生了一些代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物的作用使原油粘度下降。
通過(guò)野生菌(芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23)和轉(zhuǎn)入PHB合成基因的重組菌的比較可以看出，重組菌對(duì)于原油的降粘作用更為明顯，以一種原油的結(jié)果為例，結(jié)果表明重組菌在原油中的生長(zhǎng)情況好于芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23，因而對(duì)原油的降粘效果更好。這是由于PHB合成基因的轉(zhuǎn)入使得細(xì)菌對(duì)滲透壓的抗性提高，能在原油中更好的生長(zhǎng)。
表1野生菌和重組菌的降粘效果比較


實(shí)施例27、在嗜酸乳桿菌中表達(dá)phbCAB提高細(xì)菌在酸性條件下的存活率菌種嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671。
按照實(shí)施例1的方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜酸乳桿菌(Lac tobacillus acidophilus)ATCC 53671)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)方法如下菌種傳代培養(yǎng)基12.8g脫脂奶粉溶于100mL蒸餾水中，121℃滅菌15min。
計(jì)數(shù)培養(yǎng)基牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，酵母膏0.6％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.8％，pH6.8，121℃滅菌20min。
豆汁的制備將大豆室溫(20℃左右)浸泡48小時(shí)，使大豆充分溶漲，磨漿(水∶豆＝3∶1)，兩層紗布過(guò)濾除去豆渣即得。115℃滅菌15min。
不同pH值豆汁的制備以乳酸作為調(diào)節(jié)劑，將豆汁pH值分別調(diào)至4.0、4.5、5.0或5.5。豆汁的自然pH值為6.5左右，配制是在磁力攪拌器上進(jìn)行，用pH酸度計(jì)監(jiān)測(cè)。
保存實(shí)驗(yàn)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671和重組菌分別于豆汁培養(yǎng)基(pH6.5)中培養(yǎng)48小時(shí)，然后取菌液分別添加至不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5)的滅菌豆汁中，使活菌數(shù)目為1×107-108cfu/ml，置于4℃冰箱中保存10周，檢測(cè)活菌數(shù)目變化。其中，計(jì)數(shù)方法根據(jù)樣品中含菌量的不同，作10倍系列濃度稀釋?zhuān)蛊桨澹?7℃恒溫培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)菌落數(shù)。存活率的計(jì)算存活率＝樣品的活菌數(shù)目/樣品中起始活菌數(shù)目×100％。
結(jié)果表明嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671在不同的pH值的豆汁中保存，存活率不同，pH 4.0下存活率最低(2％)，pH 5.0最高(11％)。在pH 4.5-pH5.5中保存，存活率變化不明顯都在9％左右。10周保存實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，pH 5.5下的存活率(9％)僅高于pH 4.5(8.2％)下的不足一倍。從活菌數(shù)目上看，10周后pH 4.0下活菌數(shù)目仍能維持在1×106cfu/ml以上水平，pH 4.5-5.5都在1×107cfu/ml以上水平。
重組菌的存活率在實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)pH(4.0、4.5、5.0、5.5)下變化不明顯，都在20％左右，活菌的數(shù)目較野生菌有明顯的提高，10周保存實(shí)驗(yàn)的活菌數(shù)目均在1×107cfu/ml以上水平。表明PHB的合成提高了細(xì)菌在酸性條件下的活菌數(shù)目。
重組的嗜酸乳桿菌在較低pH值(4.0、4.5)培養(yǎng)條件下具有較高的存活率和活菌數(shù)目在生產(chǎn)上具有重要的意義一方面可以提高存活率，使制劑具有較高的活菌數(shù)另一方面，較低的pH值環(huán)境可防止雜菌污染。
實(shí)施例28、從脂肪酸β-氧化途徑合成PHA的相關(guān)基因在熒光假單胞菌中的表達(dá)影響葡萄糖酸產(chǎn)量菌種熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55。
斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，pH7.0。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2％，玉米漿1％，尿素0.2％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉水解糖14％，玉米漿1.5％，輕質(zhì)碳酸鈣4％，pH 6.7。
在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pEE32(Fukui T，Doi Y.Cloning andanalysis of the poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)biosynthesis geneof Aeromonas caviae.J.Bacteriol.，1997，1794821-4830)為模板，用引物TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG擴(kuò)增出phaCJ基因，然后經(jīng)過(guò)KpnI和HindIII酶切處理后，插入到質(zhì)粒pBBR1MCS2的限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pBBRCJ。pBBRCJ以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55中獲得重組菌(含有pBBRCJ的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、230rpm下培養(yǎng)16小時(shí)后，以10％(v/v)接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500mL裝液量50mL，在30℃、230rpm下培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量。發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量＝25℃下發(fā)酵液旋光度絕對(duì)值/0.88。
結(jié)果表明熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55的發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量為13.6g/L，重組菌的產(chǎn)量為15.8g/L，提高了大約16％，phaCJ基因的導(dǎo)入，能夠在細(xì)胞內(nèi)積累PHA，有利于提高菌的的耐受力，生長(zhǎng)得更好，從而得到更高的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例29、從脂肪酸從頭合成途徑合成PHA的相關(guān)基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)影響肌苷的生物合成菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，玉米液7g/L，氯化鈉2.5g/L，尿素2g/L，pH值7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖140g/L，玉米液16g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L，硫酸銨16g/L，七水硫酸鎂4g/L，磷酸氫二鉀5g/L，碳酸鈣20g/L，pH值7.0。
在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pQH-CG(邱遠(yuǎn)征，聚羥基丁酸羥基己酸酯生物合成途徑的基因工程改造，清華大學(xué)，2005，博士論文。)為模板，用引物ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG擴(kuò)增出phaGC基因，然后經(jīng)過(guò)BamHI和BglII酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308的限制性?xún)?nèi)切酶BglII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pEUGC。pEUGC以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUGC的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在32℃、200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5％(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L，自動(dòng)控制溫度35℃，pH 6.5，攪拌速度600rpm，通氣量1L/min，發(fā)酵時(shí)間68小時(shí)(肌苷產(chǎn)量不再增加)，測(cè)定發(fā)酵液中肌苷含量。肌苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0.5％磷酸氫二鉀，流速1.2mL/min，色譜柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162的肌苷產(chǎn)量為19.7g/L，重組菌的產(chǎn)量為24.9g/L，提高了26.4％。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP，同時(shí)從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調(diào)控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制，因此NADPH的減少能促進(jìn)葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)化?？偟膩?lái)說(shuō)，肌苷合成是一個(gè)需要大量氧化力的生化代謝過(guò)程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)肌苷的合成。phaG C基因的引入，能夠促進(jìn)脂肪酸的從頭合成途徑，提高細(xì)胞內(nèi)的氧化力，因此能夠顯著的提高肌苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例30、在移動(dòng)假單胞菌中表達(dá)phbCAB基因影響乙醇產(chǎn)量菌種移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉15g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸銨1g/L，七水硫酸鎂1g/L，NaCl 1g/L，瓊脂15g/L，pH值7.0。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖100g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖200g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.0。
將按照實(shí)施例11的方法獲得的質(zhì)粒pBBRHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，在30℃、200rpm下培養(yǎng)16小時(shí)后，以10％(v/v)接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500mL裝液量50mL，在30℃、200rpm下培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量。乙醇濃度用高效液相色譜測(cè)量發(fā)酵液8000g離心十分鐘，取上清過(guò)濾后作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動(dòng)相為98％的濃硫酸∶H2O(體積比為0.5∶1000)，流速1mL/min。
結(jié)果表明野生菌的發(fā)酵液乙醇濃度為14％，重組菌的乙醇濃度為18％，提高了28％，phbCAB基因的引入，不僅可以改變細(xì)胞內(nèi)的代謝流，而且PHA的合成能夠提高細(xì)菌對(duì)高乙醇環(huán)境的耐受性，從而提高了乙醇的產(chǎn)量。
序列表<160>1<210>1<211>3884<212>DNA<213>Wautersia eutropha<400>1ataaagctta aggaggatgg cgaccggcaa aggcgcggca gcttccacgc aggaaggcaa 60gtcccaacca ttcaaggtca cgccggggcc attcgatcca gccacatggc tggaatggtc 120ccgccagtgg cagggcactg aaggcaacgg ccacgcggcc gcgtccggca ttccgggcct 180ggatgcgctg gcaggcgtca agatcgcgcc ggcgcagctg ggtgatatcc agcagcgcta 240catgaaggac ttctcagcgc tgtggcaggc catggccgag ggcaaggccg aggccaccgg 300tccgctgcac gaccggcgct tcgccggcga cgcatggcgc accaacctcc catatcgctt 360cgctgccgcg ttctacctgc tcaatgcgcg cgccttgacc gagctggccg atgccgtcga 420ggccgatgcc aagacccgcc agcgcatccg cttcgcgatc tcgcaatggg tcgatgcgat 480gtcgcccgcc aacttccttg ccaccaatcc cgaggcgcag cgcctgctga tcgagtcggg 540cggcgaatcg ctgcgtgccg gcgtgcgcaa catgatggaa gacctgacac gcggcaagat 600ctcgcagacc gacgagagcg cgtttgaggt cggccgcaat gtcgcggtga ccgaaggcgc 660cgtggtcttc gagaacgagt acttccagct gttgcagtac aagccgctga ccgacaaggt 720gcacgcgcgc ccgctgctga tggtgccgcc gtgcatcaac aagtactaca tcctggacct 780gcagccggag agctcgctgg tgcgccatgt ggtggagcag ggacatacgg tgtttctggt 840gtcgtggcgc aatccggacg ccagcatggc cggcagcacc tgggacgact acatcgagca 900cgcggccatc cgcgccatcg aagtcgcgcg cgacatcagc ggccaggaca agatcaacgt 960gctcggcttc tgcgtgggcg gcaccattgt ctcgaccgcg ctggcggtgc tggccgcgcg1020cggcgagcac ccggccgcca gcgtcacgct gctgaccacg ctgctggact ttgccgacac1080gggcatcctc gacgtctttg tcgacgaggg ccatgtgcag ttgcgcgagg ccacgctggg1140cggcggcgcc ggcgcgccgt gcgcgctgct gcgcggcctt gagctggcca ataccttctc1200gttcttgcgc ccgaacgacc tggtgtggaa ctacgtggtc gacaactacc tgaagggcaa1260cacgccggtg ccgttcgacc tgctgttctg gaacggcgac gccaccaacc tgccggggcc1320gtggtactgc tggtacctgc gccacaccta cctgcagaac gagctcaagg taccgggcaa1380gctgaccgtg tgcggcgtgc cggtggacct ggccagcatc gacgtgccga cctatatcta1440cggctcgcgc gaagaccata tcgtgccgtg gaccgcggcc tatgcctcga ccgcgctgct1500ggcgaacaag ctgcgcttcg tgctgggtgc gtcgggccat atcgccggtg tgatcaaccc1560gccggccaag aacaagcgca gccactggac taacgatgcg ctgccggagt cgccgcagca1620atggctggcc ggcgccatcg agcatcacgg cagctggtgg ccggactgga ccgcatggct1680
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1.一種調(diào)控微生物代謝的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述phbCAB基因?yàn)榫哂行蛄斜碇蠸EQ ID NO1的DNA序列；所述PhaG基因?yàn)锳F052507；所述phaC基因來(lái)自于AY093685，所述phaJ基因來(lái)自于AY093685。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述調(diào)控微生物代謝為調(diào)控微生物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物為細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌；所述發(fā)酵產(chǎn)物包括有機(jī)酸，醇類(lèi)，抗生素，氨基酸和維生素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述微生物為獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)，優(yōu)選為獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸和透明質(zhì)酸；所述微生物為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)，優(yōu)選為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019，所述發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮酸；所述微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338，所述發(fā)酵產(chǎn)物為麥角固醇；所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；所述微生物為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)，優(yōu)選為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B，所述發(fā)酵產(chǎn)物為彈性蛋白酶；所述微生物為紅酵母(Rhodotorula glutinis)，優(yōu)選為紅酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353，所述發(fā)酵產(chǎn)物為類(lèi)胡蘿卜素；所述微生物為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷氨酰胺；所述微生物為乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)，優(yōu)選為乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269，所述發(fā)酵產(chǎn)物為賴(lài)氨酸；所述微生物為大腸桿菌(Escherichia.coli)，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichia.coli)ATCC 31882，所述發(fā)酵產(chǎn)物為苯丙氨酸；所述微生物為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，優(yōu)選為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556，所述發(fā)酵產(chǎn)物為α-淀粉酶；所述微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇；所述微生物為克魯斯假絲酵母(Candida krusei)，優(yōu)選為克魯斯假絲酵母(Candida krusei)ACCC 2196，所述發(fā)酵產(chǎn)物為甘油；所述微生物為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，優(yōu)選為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH22248，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十二碳二元酸；所述微生物為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，優(yōu)選為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)T25-14，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十五碳二元酸；所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220，所述發(fā)酵產(chǎn)物為鳥(niǎo)苷；所述微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷胱甘肽；所述微生物為球擬酵母(ToruLopsis sp)，優(yōu)選為球擬酵母(ToruLopsis sp)B845，所述發(fā)酵產(chǎn)物為赤蘚糖醇；所述微生物為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，優(yōu)選為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095，所述發(fā)酵產(chǎn)物為D-核糖；所述微生物為丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)，優(yōu)選為丁酸梭芽孢桿菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260，所述發(fā)酵產(chǎn)物為1，3-丙二醇；所述微生物為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，優(yōu)選為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；所述微生物為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。
7.一種提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述1)，2)和3)中的任意一種1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述phbCAB基因優(yōu)選為具有序列表中SEQID NO1的DNA序列；所述PhaG基因優(yōu)選為AF052507，所述phaC基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685，所述phaJ基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的方法，其特征在于所述微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述逆境脅迫為冷脅迫或熱脅迫；所述微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109，所述逆境脅迫為重金屬離子脅迫；所述重金屬離子為Hg2+；所述微生物為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫；所述微生物為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，優(yōu)選為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671，所述逆境脅迫為低pH脅迫；所述微生物為芽孢桿菌，優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，尤其優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068；所述微生物為芽孢桿菌，優(yōu)選為芽孢桿菌(Bacillus sp)L-23；所述逆境脅迫為原油脅迫。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。將本發(fā)明的方法應(yīng)用到各種微生物生產(chǎn)菌中，可以有效的影響生產(chǎn)菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質(zhì)酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類(lèi)胡蘿卜素、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇云金桿菌粉劑、鳥(niǎo)苷、谷胱甘肽、赤蘚糖醇、D－核糖，1，3－丙二醇等生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1810968SQ20051006811
公開(kāi)日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 張晉宇, 吳瓊 申請(qǐng)人:清華大學(xué)