專利名稱：一種表達(dá)人血清白蛋白的載體和工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種表達(dá)人血清白蛋白的載體和工程菌。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(以下簡稱HSA)是血漿中的主要蛋白組分，由585個(gè)氨基酸殘基組成。人血清白蛋白在肝臟中合成后分泌進(jìn)入血液，主要作用是維持血液中的正常滲透壓，另外還具有結(jié)合和運(yùn)輸血液中小分子物質(zhì)的功能。目前的HSA制劑是由人血漿提取的一類血液制劑，主要用于臨床糾正因大手術(shù)、創(chuàng)傷、器官移植等引起的急性血容量減少及各種原因引起的水、電解質(zhì)和膠體平衡失調(diào)，以防止和控制休克；還用于急性胃腸出血、腎透析、以及嚴(yán)重的慢性疾患，如消化道吸收不良、肝硬變、腎病綜合癥、腦血管意外或腦局部缺血等內(nèi)科疾病，特別是合并水腫的病例。其唯一的原料來源是人血，由于肝炎、愛滋病獻(xiàn)血、獻(xiàn)漿員中的交叉感染，導(dǎo)致原料短缺和生產(chǎn)成本大大提高，開發(fā)一種新的HSA來源是非常必要的。
自上世紀(jì)九十年代以來，采用基因工程技術(shù)將HSA基因與適合酵母菌轉(zhuǎn)化載體重組，轉(zhuǎn)化于酵母菌中，獲得轉(zhuǎn)基因菌株，可提高HSA生產(chǎn)水平，并能較為有效而溫和地分離白蛋白，避免了使用人血漿生產(chǎn)白蛋白所帶來的盲目性和危害性。如US5707828介紹了將HSA表達(dá)質(zhì)粒pHSA413導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母GS115可獲得工程菌GS115pHSA 413-6，其不足在于利用該工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)HSA，HSA產(chǎn)量較低，HSA表達(dá)水平為3.39g/L培養(yǎng)基上清(細(xì)胞干重101g DCW/L，甲醇誘導(dǎo)237小時(shí))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種表達(dá)人血清白蛋白的載體。
本發(fā)明所提供的表達(dá)人血清白蛋白的載體，是在巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入有人血清白蛋白編碼序列的質(zhì)粒。
所述人血清白蛋白編碼序列的5′端緊密連接有分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列，得到具有序列表中序列1的人血清白蛋白基因片段。
序列1由1830個(gè)堿基組成，自5′端的第1位-72位堿基為所述分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列，自5′端的第73位-1830位堿基為人血清白蛋白編碼序列。
所述分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列的5′端緊密連接有巴斯德畢赤酵母AOX1基因的高表達(dá)特征序列GAAACG，得到具有序列表中序列2的自5′端第8位-1843位堿基的人血清白蛋白基因片段。
所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可為pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C、pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等。
所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為pPICZα-A。
所述表達(dá)人血清白蛋白的載體優(yōu)選為將具有序列表中序列2的核苷酸序列的人血清白蛋白基因片段插入pPICZα-A的NspV和EcoRI識別位點(diǎn)間得到的pAZP-HSA。
含有上述表達(dá)人血清白蛋白載體的巴斯德畢赤酵母菌株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述含有上述表達(dá)人血清白蛋白的載體的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360。
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360已于2005年04月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360，是將質(zhì)粒pAZP-HSA導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株得到的表達(dá)HSA的工程菌。
本發(fā)明構(gòu)建了可在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表達(dá)成熟人血清白蛋白的表達(dá)載體和工程菌，由于該表達(dá)載體中由AOX(醇氧化酶基因)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄，可通過甲醇嚴(yán)格地調(diào)控表達(dá)。在廉價(jià)的非選擇培養(yǎng)基上高密度連續(xù)培養(yǎng)本發(fā)明的表達(dá)人HSA的工程菌可獲得較高的人血清白蛋白產(chǎn)量(10g/L培養(yǎng)基上清，10L發(fā)酵罐批式發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)200小時(shí))，分泌的HSA占所有分泌蛋白的80％以上，利于工業(yè)規(guī)模的分離和下游加工。本發(fā)明的表達(dá)人血清白蛋白的載體和工程菌在HSA的生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為pAZP-HSA的物理圖譜圖2為不同菌株表達(dá)的HSA的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖3A為電噴霧質(zhì)譜測定巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCCNo.1360表達(dá)的HSA分子量結(jié)果圖3B為電噴霧質(zhì)譜測定血源HSA分子量結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、表達(dá)HSA的載體pAZP-HSA和工程菌巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360的構(gòu)建1、從人肝臟組織中分離HSA mRNA從事故死亡兒童的肝臟中分離信使RNA(mRNA)。具體方法如下在10.5g冷凍的人肝組織中加入210ml裂解液(4mol/L硫氰胍，0.1mol/LTris-HCl，0.1mol/L 2-巰基乙醇，pH7.5)勻漿。在10000rpm，4℃條件下離心10分鐘沉淀細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入是上清0.04倍體積的1mol/L磷酸和是上清0.5倍體積的95％乙酸，-20℃放置2小時(shí)。而后7500rpm，4℃離心10分鐘。沉淀物重懸于50ml洗滌液(6mol/L鹽酸胍，10mmol/L Na2EDTA，10mmol/L DTT，pH7.0)中，5500rpm離心10分鐘。上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心杯中。加入是上清0.04倍體積的1mol/L醋酸和是上清0.5倍體積的95％乙醇。-20℃放置2小時(shí)后7200rpm離心20分鐘。沉淀重懸于20ml洗滌液中，加入是沉淀0.04倍體積的1mol/L醋酸和是沉淀0.5倍體積的95％乙醇，-20℃放置12小時(shí)。4℃，8000rpm離心10分鐘。沉淀用15ml ddH2O重懸，加入等體積的氯仿∶正丁醇(4∶1)進(jìn)行抽提，將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入是水相0.1倍體積的2.4mol/L NaAc和是水相2.5倍體積的95％乙醇。-20℃放置2.5小時(shí)，RNA通過離心沉淀下來，并重懸于2ml ddH2O中，總共得到19.2mg RNA。
采用常規(guī)使用的寡聚dT-纖維素和層析法從總RNA中分離mRNA。將裝有5g寡聚dT-纖維素的層析柱用等柱體積的0.1mol/L NaOH洗滌以使RNase變性。然后用高鹽緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，0.5％SDS，pH7.5)平衡。溶于2ml ddH2O內(nèi)的總RNA，70℃加熱1分鐘，然后冰浴降至室溫。下一步將0.2ml的5mol/L NaCl，0.04ml 0.5mol/L Tris-HCl pH7.5，以及0.1ml 1％SDS加入到RNA中。然后加入8ml高鹽緩沖液，以10滴/分鐘的速率上樣。樣品上完后，用高鹽緩沖液洗去未結(jié)合的RNA，部分收集洗脫液(0.5ml/管)。在分光光度計(jì)上測A260。一直到A260低于0.05時(shí)停止用高鹽緩沖液洗脫。然后進(jìn)一步用低鹽緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.1％SDS，pH7.4)洗滌，剩余的非結(jié)合RNA同上洗至A260小于0.05。
下一步即用洗脫緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1％SDS，pH7.4)將mRNA從介質(zhì)中洗脫下來。部分收集(1ml)洗脫液直至A260＜0.05，開始的15個(gè)管(A260較高)集中在一起。加入是15個(gè)管洗脫液(15ml)的0.1倍體積的2.4mol/LNaAc和是15個(gè)管洗脫液的2.5倍體積的95％乙醇，-20℃放12小時(shí)，沉淀mRNA。洗脫液的mRNA離心沉淀并重懸于800μl洗脫液中。將懸液70℃加熱90秒，冰浴，然后加入是懸液0.1倍體積的5mol/L NaCl和是懸液0.05倍體積的10％SDS，第二次過寡聚dT-纖維素柱作進(jìn)一步純化。用NaOH洗滌裝有0.1g寡聚dT-纖維素的層析柱，然后按照第一次純化的方法得到二次純化的mRNA。
2、HSA cDNA第一條鏈的合成；以步驟1純化的mRNA為模板首先合成第一條cDNA鏈，以引物25’gcggaattcttataagcctaaggcagc 3’作為引物，按以下步驟進(jìn)行在冰浴條件下制備如下混合物0.5mol/L Tris-HCl pH8.3 20μl1.4mol/L KCl10μl0.25mol/L MgCl28μl0.05mol/L dNTP pH7.0 2μl0.01mol/L DTT 4μlddH2O 56μl總反應(yīng)體積 100μl然后加入如下組分引物25’gcggaattcttataagcctaaggcagc 3’ 20μl10μg mRNA 20μlddH2O 37μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶(16u/μl)7μl總反應(yīng)體積 200μl注禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶需要在-80℃存放，使用前溶化并盡快加入反應(yīng)體系中(在所有組分加完后)。
將反應(yīng)混合物冰浴5分鐘，然后將反應(yīng)液46℃溫育30分鐘。加入20μl0.5mol/L EDTA，pH8.0終止反應(yīng)。最后用等體積的酚∶氯仿(1∶1)抽提反應(yīng)混合物，得到cDNA的第一條鏈。
3、HSA cDNA擴(kuò)增及序列分析將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一條鏈作為PCR反應(yīng)的模板，使用pfu DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下10×PCR緩沖液 10μldNTP 10μlcDNA第一條鏈 8μlddH2O 67μl引物 12μl引物2 2μlpfu DNA聚合酶(10u/μl) 1μl總反應(yīng)體積 100μl其中，pfu DNA聚合酶和dNTP均為上海生工公司產(chǎn)品，10×PCR緩沖液為上海生工公司pfu DNA聚合酶產(chǎn)品所附帶。引物15’cggttcgaaacgatgaagtgggtaacc3’(含有限制性內(nèi)切酶Nsp V位點(diǎn)，為HSA表達(dá)區(qū)上游引物)；引物25’gcggaattcttataagcctaaggcagc 3’(含有限制性內(nèi)切酶EcoRI位點(diǎn)，為HSA表達(dá)區(qū)下游引物)反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4分鐘94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃擴(kuò)增3分鐘；30循環(huán)72℃加入1UTaqDNA聚合酶(購自上海生工公司)加尾60分鐘4℃保存。
將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用上海生工公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA片段的回收，和pGEM-T Easy Vector(購自Promega公司)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)藍(lán)白斑法篩選重組克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行交上海生工公司進(jìn)行DNA測序，經(jīng)比對分析后發(fā)現(xiàn)3號克隆測序結(jié)果正確，其含有具有序列表中序列2的DNA序列的PCR擴(kuò)增片段，命名為pGEM-HSA3。
4、重組質(zhì)粒pAZP-HSA的構(gòu)建將pGEM-HSA3和pPICZα-A(購自Invitrogen公司)載體分別利用限制性內(nèi)切酶Nsp V和EcoRI共同消化，分別回收1.9Kb DNA片段和3.2KbDNA片段，將以上回收到的DNA片段采用寶生物公司的DNA連接試劑盒進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在含有25μg/ml的Zeocin(Invitrogen公司產(chǎn)品)的低鹽LB(配方見Invitrogen公司EasySelectTMPichia Expression Kit產(chǎn)品說明書)平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株，篩選到含有HSA基因的重組質(zhì)粒的菌株，將該含有HSA基因的重組質(zhì)粒命名為pAZP-HSA(圖1)。
5、工程菌的獲得選擇巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株(購自Invitrogen公司)作為宿主菌，將質(zhì)粒pAZP-HSA經(jīng)限制性內(nèi)切酶ScaI消化，按照以下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作將100ul甘油管保存的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株接種于裝有5ml YPD培養(yǎng)基的試管中，30℃震蕩培養(yǎng)10小時(shí)后轉(zhuǎn)接至裝有50ml YPD培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30℃培養(yǎng)12小時(shí)；將50ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中離心收獲菌體(3000g，15min)，用超純水洗滌菌體2次，用1mol/L山梨醇洗滌菌體一次，2ml1mol/L山梨醇重懸洗滌后的菌體。取80ul菌體轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯(購自Bio-Rad公司)中，加入線性化過的DNA 10ul混勻，使用Gene Pulser(購自Bio-Rad公司)于1500v、25uF、200Ω條件下電擊4毫秒，將電擊過的菌體溶于1ml 1mol/L山梨醇中，30℃恢復(fù)1.5小時(shí)。取300ul涂含有100μg/ml的Zeocin的YPDS(配方見Invitrogen公司EasySelectTMPichia Expression Kit產(chǎn)品說明書)平板，30℃培養(yǎng)3-4天，將生長出的100個(gè)克隆點(diǎn)接到100μg/ml的Zeocin的YPDS平板并編號。
將轉(zhuǎn)化得到的克隆分別接種到BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，取4ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)96小時(shí)后，將發(fā)酵液在7500rpm，4℃離心10分鐘，取上清，通過Bradford方法測定蛋白表達(dá)量，選擇高表達(dá)的菌株發(fā)酵液的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，部分表達(dá)HSA菌株的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2中，箭頭示HSA條帶。圖中，M0.25表示含量為0.25g/L的標(biāo)準(zhǔn)人血清白蛋白樣品(購自Sigma公司)，M0.5表示含量為0.5g/L的標(biāo)準(zhǔn)人血清白蛋白樣品，其余泳道為不同菌株編號。完成初篩后選擇高表達(dá)HSA菌株進(jìn)行復(fù)篩，最后選定編號75-10的菌株，命名為HSA75-10，即巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360，作為工程菌株。
6、用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360菌株進(jìn)行搖瓶表達(dá)HSA將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360接入裝有40ml BMGY培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30℃100rpm搖培24小時(shí)，取10ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入裝有100mlBMMY培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)，30℃220rpm搖培96小時(shí)后，將發(fā)酵液在7500rpm，4℃離心10分鐘，取發(fā)酵液的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明該菌株的搖瓶發(fā)酵HSA表達(dá)水平為0.8g/L，HSA的含量占所有分泌蛋白的85％。
7、用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360進(jìn)行批式發(fā)酵表達(dá)HSA按照Invitrogen公司公開的“Pichia Fermentation Process Guidelines”進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體工藝如下1).培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基2％的細(xì)菌胨、1％的酵母抽提物、2％的甘油。
批次發(fā)酵培養(yǎng)基每L中含有甘油 50.0gH3PO4(85％) 14.0mlCaSO4.2H2O0.6gK2SO49.5gMgSO4.7H2O7.8gKOH 2.6g0.2g/L生物素溶液 1.6mlYTB溶液 2ml(YTB溶液每1L含F(xiàn)eSO4.7H2O 65.0g，CuSO4.5H2O 6.0g，ZnSO4.7H2O20.0g，MnSO4.5H2O 3.0g，H2SO45.0ml)補(bǔ)料培養(yǎng)基甘油 2000mlYTB溶液 2ml甲醇 2000ml2).種子培養(yǎng)從冷凍管中取出1ml含巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCCNo.1360的菌液，接入含200ml種子培養(yǎng)基的1000ml帶擋板的搖瓶中，在30℃條件下，搖床培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)。
3).發(fā)酵培養(yǎng)把200ml種子培養(yǎng)液接入含5L批次發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐(購自B.BRAUN公司)中，通氣攪拌培養(yǎng)。主發(fā)酵在恒定30℃下進(jìn)行。攪拌轉(zhuǎn)速的低限與高限分別為200與1000rpm，主發(fā)酵溶氧控制在飽和溶氧的50％。當(dāng)批次發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油消耗完，此時(shí)溶氧值迅速升至100％，即開始補(bǔ)料，補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之間，發(fā)酵過程中，pH控制在5.5，在發(fā)酵過程中泡沫過大時(shí)加入泡敵消泡。
利用10L發(fā)酵罐進(jìn)行批式發(fā)酵試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為200小時(shí)左右，將發(fā)酵液在7500rpm，4℃離心10分鐘，取發(fā)酵液的上清液稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE分析，將電泳圖譜進(jìn)行掃描后利用Image Master軟件分析計(jì)算得到HSA表達(dá)水平，結(jié)果數(shù)據(jù)參見表1。
表1 不同菌株發(fā)酵表達(dá)HSA的水平比較

*GS115Albumin為Invitrogen公司EasySelectTMPichia Expression Kit中所附帶的HSA表達(dá)菌株。
表2數(shù)據(jù)表明巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360的HSA表達(dá)水平均可達(dá)到10g/L培養(yǎng)基上清，HSA的含量占所有分泌蛋白的85％。以上表達(dá)水平明顯高于已經(jīng)報(bào)道的利用相同Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人血清白蛋白(HSA)的表達(dá)水平(US patent 5707828，5756313)。
實(shí)施例2、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的分子量測定1、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的純化在純化過程中所用的各種緩沖液如表2所示。
表2.緩沖液


(1)發(fā)酵液的加熱處理將7L按照實(shí)施例1步驟7的方法制備的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10CGMCC No.1360的發(fā)酵上清液用0.22um膜(MILLIPORE公司生產(chǎn))過濾，然后加入2％活性碳，加入辛酸鈉和EDTA，使辛酸鈉的終濃度為5mmol/L、EDTA的終濃度為5mmol/L，調(diào)pH值至5.8-7.0，在72℃下加熱20分鐘，快速冷卻，然后用乙酸調(diào)pH值4.5。
(2)高鹽陽離子層析分離將上述經(jīng)過處理的樣品經(jīng)膜過濾后直接以150cm/h流速上樣高鹽陽離子CST-II FF柱(XK50/60，Vt＝300ml，Amersham Biosciences公司制造，預(yù)先用溶液A平衡)上樣結(jié)束后，用溶液A洗滌2柱體積；然后用pH值4.5，含2mol/L氯化鈉的25mmol/L乙酸鈉溶液洗滌2柱體積；再用溶液A洗滌2柱體積；最后用溶液B洗脫，得CST-II BD組分。
(3)加熱處理向所得CST-II BD組分中加入辛酸鈉和半胱氨酸，至辛酸鈉最終濃度為5mmol/L和半胱氨酸最終濃度為10mmol/L，在60℃加熱60分鐘，迅速冷卻。
(4)疏水層析分離和濃縮加熱后樣品分別經(jīng)0.45和0.22um的膜過濾，進(jìn)入Phenyl SepharoseTMFastFlow(high sub)介質(zhì)(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，預(yù)先用溶液C平衡)。在此條件下，HSA未被吸附，在流穿部分，收集上樣流出液，用分子截留量3萬的濃縮膜包(Millipore公司生產(chǎn))進(jìn)行濃縮至100mg/ml。
(5)硼酸/硼酸鹽脫糖處理向濃縮組分中加入四硼酸鈉和氯化鈣，使它們的最終濃度均為50-100mmol/L，調(diào)pH值9.0，靜置過夜。離心分離，用截留分子量30000的超濾膜濃縮，然后用溶液C換液。
(6)弱陰離子層析分離將上述濃縮組分直接進(jìn)入Aminobutyl SepharoseTMFast Flow柱(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司制造，用溶液C平衡)，上樣結(jié)束后，用溶液C洗滌2倍柱體積，然后用溶液D進(jìn)行洗脫，得Amino-BD組分。
(7)濃縮換液由用截留分子量30000的超濾膜濃縮，然后用含辛酸鈉的氯化鈉溶液換液，得到最終含HSA 20％的終產(chǎn)品。
2、測定巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的分子量對血源人血清白蛋白產(chǎn)品pHSA(購自Sigma公司)和步驟1純化的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA用G-25柱(5ml，Pharmacia公司產(chǎn)品)進(jìn)行脫鹽處理，然后用電噴霧質(zhì)譜方法測定分子量，結(jié)果如圖3A和圖3B所示，表明巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCCNo.1360表達(dá)的HSA分子量為66530Da，pHSA的分子量為66606Da，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA分子量與其理論值66472 Da更接近。圖3A和圖3B中，箭頭示目的峰。
實(shí)施例3、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的C末端和N末端序列測定將步驟二中1純化的HSA分別交中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所和北京大學(xué)蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行C末端和N末端測序，C末端測序結(jié)果表明巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的C末端序列為AALGL，N末端測序結(jié)果表明巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360表達(dá)的HSA的N末端序列為DAHKSEVAHRFKDLG，與人血液中純化的HSA的C末端和N末端序列一致。
序列表<160>2<210>1<211>1830<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320
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1.表達(dá)人血清白蛋白的載體，是在巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入有人血清白蛋白編碼序列的質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體，其特征在于所述人血清白蛋白編碼序列的5′端緊密連接有分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列，得到具有序列表中序列1的人血清白蛋白基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體，其特征在于所述分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列的5′端緊密連接有巴斯德畢赤酵母AOX1基因的高表達(dá)特征序列GAAACG，得到具有序列表中序列2的自5′端第8位-1843位堿基的人血清白蛋白基因片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C、pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為pPICZα-A。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體，其特征在于所述表達(dá)人血清白蛋白的載體為將具有序列表中序列2的核苷酸序列的人血清白蛋白基因片段插入pPICZα-A的Nsp V和EcoRI識別位點(diǎn)間得到的pAZP-HSA。
7.含有權(quán)利要求1-6中任一所述的表達(dá)人血清白蛋白的載體的巴斯德畢赤酵母菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的菌株，其特征在于含有所述表達(dá)人血清白蛋白的載體的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)HSA75-10 CGMCC No.1360。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)人血清白蛋白的載體和工程菌。本發(fā)明所提供的表達(dá)人血清白蛋白的載體，是在巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入有人血清白蛋白編碼序列的質(zhì)粒。該人血清白蛋白編碼序列的5′端緊密連接有分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列，分泌信號肽及前導(dǎo)肽編碼序列的5′端緊密連接有巴斯德畢赤酵母AOX1基因的高表達(dá)特征序列GAAACG。含有上述表達(dá)人血清白蛋白的載體的巴斯德畢赤酵母菌株，特別是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75－10 CGMCCNo.1360在廉價(jià)的非選擇培養(yǎng)基上高密度連續(xù)培養(yǎng)可獲得較高的人血清白蛋白產(chǎn)量(10g/L培養(yǎng)基上清)，分泌的HSA占所有分泌蛋白的80％以上，利于工業(yè)規(guī)模的分離和下游加工。
文檔編號C12R1/84GK1854301SQ20051006818
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者高健, 賈茜, 李梅彥, 鄧建慧 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司