專利名稱：使用腸細(xì)菌科菌株發(fā)酵生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用腸細(xì)菌科菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-蘇氨酸的方法，所用菌株中至少pckA基因是弱化的。
背景技術(shù)：
L-氨基酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。
已知可通過腸細(xì)菌菌株，尤其大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸。由于其極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性，或重要的調(diào)節(jié)代謝物缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于腸細(xì)菌科生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良，通過擴(kuò)增各個氨基酸生物合成基因并研究對生產(chǎn)的作用而進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)而提供新措施。
本發(fā)明提供了使用尤其已經(jīng)生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸細(xì)菌科微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-蘇氨酸的方法，所用細(xì)菌中編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEP羧激酶)(EC 4.1.1.49)的核苷酸序列(pckA基因)被弱化。
以下提及的L-氨基酸是指一或多種氨基酸，包括其鹽，選自L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，L-高絲氨酸和L-精氨酸。L-蘇氨酸是特別優(yōu)選的。
文中術(shù)語“弱化”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性的降低或抑制，例如通過用弱啟動子或編碼低活性相應(yīng)酶的基因或等位基因，或失活相應(yīng)酶(蛋白質(zhì))，及如果需要組合使用這些方法。
通過弱化措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
本發(fā)明方法的特征在于進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵腸細(xì)菌科微生物，其中至少pckA基因是弱化的，b)富集培養(yǎng)基中或腸細(xì)菌科微生物細(xì)胞中所需的L-氨基酸，及c)分離所需的L-氨基酸。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、任選地淀粉、任選地纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。此微生物可以是腸細(xì)菌科的代表菌，選自埃希氏菌屬，歐文氏菌屬(Erwinia)，普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬。優(yōu)選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。在埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬中分別尤其應(yīng)提及的是大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌。
適當(dāng)?shù)陌ＯＪ暇鷮儆绕浯竽c桿菌菌株、特別是生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株的例子是大腸桿菌TF427大腸桿菌H4578大腸桿菌KY10935大腸桿菌VNIIgenetika MG442大腸桿菌VNIIgenetika M1大腸桿菌VNIIgenetika 472T23大腸桿菌BKIIM B-3996大腸桿菌kat 13大腸桿菌KCCM-10132沙雷氏菌屬，尤其粘質(zhì)沙雷氏菌的適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)L-蘇氨酸菌株例如是粘質(zhì)沙雷氏菌HNr21粘質(zhì)沙雷氏菌TLr156粘質(zhì)沙雷氏菌T2000。
腸細(xì)菌科的生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株優(yōu)選具有選自以下的一或多種遺傳或表型特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，硫代賴氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋體素抗性，利福平抗性，纈氨酸類似物如氧肟酸纈氨酸抗性，脯氨酸類似物如6-二甲基氨脯氨酸抗性，需要L-甲硫氨酸，任選地部分及可補(bǔ)償?shù)匦枰狶-異亮氨酸，需要間-二氨基庚二酸，含蘇氨酸的二肽的輔源營養(yǎng)，L-蘇氨酸抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的蘇氨酸脫氫酶，任選地蔗糖利用能力，蘇氨酸操縱子的擴(kuò)增，高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的擴(kuò)增，優(yōu)選反饋抗性形式，高絲氨酸激酶的擴(kuò)增，蘇氨酸合酶的擴(kuò)增，天冬氨酸激酶的擴(kuò)增，任選地反饋抗性形式，天冬氨酸半醛脫氫酶的擴(kuò)增，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的擴(kuò)增，任選反饋抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)氫酶的擴(kuò)增，RhtB基因產(chǎn)物的擴(kuò)增，RhtC基因產(chǎn)物的擴(kuò)增，YfiK基因產(chǎn)物的擴(kuò)增，蘋果酸醌氧化還原酶的擴(kuò)增，和丙酮酸羧化酶的擴(kuò)增及乙酸形成的弱化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在編碼PEP羧激酶(EC4.1.1.49)的pckA基因弱化尤其關(guān)閉后，腸細(xì)菌科微生物生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-蘇氨酸得以增加。
大腸桿菌pckA基因的核苷酸序列已經(jīng)由Medina等公布(細(xì)菌學(xué)雜志172，7151-7156(1990))，并還可以得自由Blattner等公布的大腸桿菌基因組序列(科學(xué)277，1453-1462，(1997))。大腸桿菌pckA基因的核苷酸序列示作SEQ ID NO1，相應(yīng)基因產(chǎn)物的氨基酸序列示作SEQ ID NO2。
根據(jù)本發(fā)明可以使用上述參考文獻(xiàn)中所述pckA基因。還可以使用pckA基因的等位基因，所述等位基因得自遺傳密碼的簡并或中性有義突變。
弱化例如可以通過降低或關(guān)閉pckA基因的表達(dá)或所述酶蛋白的催化性質(zhì)而實(shí)現(xiàn)?？扇芜x組合使用這兩種措施。
可通過合適的培養(yǎng)方法，通過遺傳修飾(突變)用于基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)，或通過反義RNA技術(shù)，而降低基因表達(dá)。用于基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)例如是阻遏基因、激活基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在如下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)此方面的信息，例如Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物遺傳58，191-195(1998))，Carrier和Keasling(生物技術(shù)進(jìn)展，58-64(1999))，F(xiàn)ranch和Gerdes(微生物學(xué)通用觀點(diǎn)3，159-164(2000))，以及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書如Knippers的教科書(分子遺傳學(xué)，第6版，Georg Thieme Verlag，德國斯圖加特，1995)，或Winnacker的教科書(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)。
導(dǎo)致酶蛋白催化活性的變化或降低的突變是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，可提及的例子如Qiu和Goodman的論文(生物化學(xué)雜志2728611-8617(1997))，Yano等(美國科學(xué)院院報95，5511-5515(1998))及Wente和Schachmann(生物化學(xué)雜志266，20833-20839(1991))。Sugimoto等(生物科學(xué)生物技術(shù)和生物化學(xué)611760-1762(1997))。綜述可參見遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的已知教科書，如Hagemann的教科書(″普通遺傳學(xué)″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1996)。
可以考慮的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。根據(jù)交換氨基酸對酶活性的影響，使用術(shù)語錯義突變或無義突變。在基因中插入或缺失至少一個堿基對導(dǎo)致移碼突變，其結(jié)果是插入不正確的氨基酸或者翻譯過早終止。缺失兩個或多個密碼子典型地導(dǎo)致酶活性的完全喪失。產(chǎn)生此類突變的指導(dǎo)屬于現(xiàn)有技術(shù)并可在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的已知教科書中找到，如Knippers的教科書(分子遺傳學(xué)，第6版，GeorgThieme Verlag，德國斯圖加特，1995)，Winnacker的教科書(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)或Hagemann的教科書(″普通遺傳學(xué)″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1996)。
通過位點(diǎn)特異性誘變對大腸桿菌pckA基因進(jìn)行弱化尤其關(guān)閉的質(zhì)粒，例如是pMAK705ΔpckA(圖1)。其只含有pckA基因的部分5′區(qū)和部分3′區(qū)，編碼區(qū)的一個349bp節(jié)段丟失(缺失)?？捎糜谡T變pckA基因的這個DNA序列示作SEQ ID NO3。
pckA基因的缺失突變可以通過基因或等位基因交換摻入適當(dāng)菌株中。
一個常用的方法是使用條件復(fù)制pSC 101衍生物pMAK705進(jìn)行基因交換的方法，如Hamilton等所述(細(xì)菌學(xué)雜志174，4617-4622(1989))。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法，例如Martinez-Morales等(細(xì)菌學(xué)雜志7143-7148(1999))或Boyd等(細(xì)菌學(xué)雜志182，842-84792000))所述方法。
當(dāng)進(jìn)行交換時，SEQ ID NO4所示ΔpckA等位基因形式存在于提及的菌株中，所述等位基因也是本發(fā)明的一方面。
pckA基因中的突變或涉及pckA基因表達(dá)的突變，也可以通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)移至不同菌株中。
另外，為用腸細(xì)菌科菌株生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-蘇氨酸，除了弱化pckA基因之外，擴(kuò)增已知蘇氨酸生物合成途徑的一或多種酶，或回補(bǔ)代謝的酶，或生產(chǎn)還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，也是有益的。
文中術(shù)語“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或用強(qiáng)啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶(蛋白質(zhì))的基因，及如果需要組合使用這些方法。
通過擴(kuò)增措施，尤其通過過表達(dá)，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度基于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最多1000％或2000％。
因此，例如選自以下的一或多個基因可以同時擴(kuò)增，尤其過表達(dá)·編碼天冬氨酸激酶，高絲氨酸脫氫酶，高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子(US-A-4278765)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(分子和普通遺傳學(xué)231，332(1992))，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(基因31，279-283(1984))，·編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因(歐洲生物化學(xué)雜志158，647-653(1986))，·編碼高絲氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0994190)·編碼蘇氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1013765)，·編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(基因27193-199(1984))。
另外，為生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-蘇氨酸，除了弱化pckA基因之外，弱化尤其關(guān)閉選自以下的一或多個基因或降低其表達(dá)是有益的·編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Ravnikar和Somerville，細(xì)菌學(xué)雜志169，4716-4721(1987))，·編碼蘋果酸脫氫酶(EC1.1.1.37)的mdh基因(Vogel等，微生物學(xué)公文149，36-42(1987))，·開放讀框(orf)yjfA的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美國)，登記號AAC77180，SEQ ID NO5)，·開放讀框(orf)ytfP的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美國)，登記號AAC77179，SEQ ID NO5)。
優(yōu)選弱化開放讀框yjfA和/或開放讀框ytfP。
根據(jù)本發(fā)明還可以獨(dú)立于pckA基因而弱化開放讀框yjfA和/或開放讀框ytfP，以實(shí)現(xiàn)氨基酸尤其L-蘇氨酸生產(chǎn)的改良。
本發(fā)明因此還提供了一種方法，特征在于進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵腸細(xì)菌科微生物，其中至少開放讀框yjfA和/或ytfP是弱化的，b)收集所述培養(yǎng)基或腸細(xì)菌科微生物細(xì)胞中的L-氨基酸，及c)分離L-蘇氨酸，發(fā)酵肉湯的成分及全部或部分生物量任選地作為固體產(chǎn)物與L-氨基酸一起分離。
通過位點(diǎn)特異性誘變可以弱化尤其關(guān)閉大腸桿菌開放讀框yjfA和ytfP的質(zhì)粒例如是質(zhì)粒pMAK705ΔyjfA(圖2)。其只含有ytfP-yjfA區(qū)的5′和3′側(cè)翼，包括開放讀框yjfA和ytfP的極少殘基。ytfP-yjfA區(qū)一個337bp長的部分丟失(缺失)?？捎糜谡T變ytfP-yjfA區(qū)的這個DNA序列示作SEQ ID NO6。
通過位點(diǎn)特異性誘變可以弱化尤其關(guān)閉大腸桿菌開放讀框yjfA和ytfP的質(zhì)粒另外例如是質(zhì)粒pMAK705Δ90bp(圖5)。其也只含有ytfP-yjfA區(qū)的5′和3′側(cè)翼，包括開放讀框yjfA和ytfP的極少殘基。ytfP-yjfA區(qū)一個90bp長的部分丟失(缺失)。可用于誘變ytfP-yjfA區(qū)的這個DNA序列示作SEQ ID NO7。
這種缺失突變可以通過基因或等位基因置換摻入適當(dāng)菌株中。還可以通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)將開放讀框yjfA和/或ytfP中的突變或影響這些開放讀框表達(dá)的突變移至各種菌株中。
當(dāng)進(jìn)行置換時，在所提及的菌株中存在SEQ ID NO6或SEQ IDNO7所示的ΔytfP和ΔyjfA等位基因形式，所述等位基因也是本發(fā)明的一方面。
另外，除單獨(dú)或聯(lián)合弱化pckA基因或開放讀框yjfA和/或ytfP之外，抑制非所需的二級反應(yīng)對L-氨基酸特別是L-蘇氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明制備的微生物還可通過分批方法或補(bǔ)料分批法培養(yǎng)。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(生物加工技術(shù)學(xué)1，生物工程指導(dǎo))(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器和外周設(shè)備)(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和任選地纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在25℃～45℃，優(yōu)選30℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸或L-蘇氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍達(dá)到。
L-氨基酸的分析方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等(分析化學(xué)，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用進(jìn)行，或通過反相HPLC，如Lindroth等(分析化學(xué)(1979)511167-1174)。
大腸桿菌K-12菌株DH5α/pMAK705的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2000年9月12日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)，保藏號DSM 13720。
大腸桿菌K-12菌株MG442ΔpckA的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2000年10月2日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)，保藏號DSM 13761。
大腸桿菌K-12菌株B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2001年3月9日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)，保藏號DSM 14150。
大腸桿菌K-12菌株MG442Δ90yjfA的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2001年5月9日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)，保藏號DSM 14289。
根據(jù)本發(fā)明還可以單獨(dú)弱化開放讀框ytfP和yjfA，以改良L-氨基酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵制備L-氨基酸，例如L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-高絲氨酸和L-賴氨酸，尤其L-蘇氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳述闡述。
從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA及所有限制，Klenow處理和堿性磷酸酶處理方法，均如Sambrook等所述進(jìn)行(分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。除非特別說明，大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法如Chung等所述進(jìn)行(美國科學(xué)院院報86，2172-2175(1989))。
制備菌株和轉(zhuǎn)化體的溫育溫度是37℃。Hamilton等所述基因交換方法中使用的穩(wěn)定為30℃和44℃。


本發(fā)明包括如下附圖圖1pMAK705ΔpckA(＝pMAK705deltapckA)圖2pMAK705ΔyjfA(＝pMAK705deltayjfA)圖3pMW218gdhA圖4pMW219rhtC圖5pMAK705Δ90bp(＝pMAK705delta90bp)。
長度數(shù)據(jù)是大約值。所采用的縮寫和符號有如下含義cat氯霉素抗性基因rep-ts質(zhì)粒pSC101的溫度敏感性復(fù)制區(qū)pck1pckA基因的5′區(qū)部分pck2pckA基因的3′區(qū)部分ytfP’-yjfA’含有ytfP和yjfA截短的編碼區(qū)的DNA序列kan卡那霉素抗性基因gdhA谷氨酸脫氫酶基因rhtC賦予蘇氨酸抗性的基因限制酶縮寫具有如下含義BamHI來自Bacillus amyloliquefaciens的限制性內(nèi)切酶BglII來自Bacillus globigii的限制性內(nèi)切酶ClaI來自Caryphanon latum的限制性內(nèi)切酶EcoRI來自大腸桿菌的限制性內(nèi)切酶EcoRV來自大腸桿菌的限制性內(nèi)切酶HindIII來自Haemophilus influenzae的限制性內(nèi)切酶KpnI來自Klebsiella pneumoniae的限制性內(nèi)切酶PstI來自Providencia stuartii的限制性內(nèi)切酶PvuI來自Proteus vulgaris的限制性內(nèi)切酶SacI來自Streptomyces achromogenes的限制性內(nèi)切酶SalI來自Streptomyces albus的限制性內(nèi)切酶SmaI來自粘質(zhì)沙雷氏菌的限制性內(nèi)切酶XbaI來自Xanthomonas badrii的限制性內(nèi)切酶XhoI來自Xanthomonas holcicola的限制性內(nèi)切酶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1構(gòu)建pckA基因的缺失突變體將大腸桿菌K12的pckA基因的5′和3′區(qū)的一部分使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸擴(kuò)增。基于大腸桿菌K12 MG1655中的pckA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，合成以下PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，德國)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′5′-25′-GCATGCGCTCGGTCAGGTTA-3′pckA′3′-15′-AGGCCTGAAGATGGCACTATCG-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA用“QiagenGenomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德國)，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離。pckA基因5′區(qū)的一個大約500bp DNA片段(示為pck1)和pckA基因3′區(qū)的一個大約600bp DNA片段(示為pck2)，可以使用Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，德國)，在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)用特異引物擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商指導(dǎo)與載體pCR2.1TOPO(TOPO TA克隆試劑盒，Invitrogen，Groningen，荷蘭)連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株TOP10F′中。在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA后，將載體pCR2.1TOPOpck2用限制酶StuI和XbaI酶切，并在0.8％瓊脂糖凝膠中分離后，將pck2片段借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)分離。在分離質(zhì)粒DNA后，將載體pCR2.1TOPOpck1用酶EcoRV和XbaI酶切，并與分離的pck2片段連接。將大腸桿菌菌株DH5α用所述連接混合物轉(zhuǎn)化，并在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA后，用酶SpeI和XbaI控制酶切，用于檢測含有克隆形式的SEQ ID NO3所示突變DNA序列的質(zhì)粒。將一個這種質(zhì)粒稱為pCR2.1TOPOΔpckA。
實(shí)施例2構(gòu)建交換載體pMAK705ΔpckA在用酶SpeI和XbaI限制及在0.8％瓊脂糖凝膠中分離后，將實(shí)施例1所述pckA等位基因從載體pCR2.1TOPOΔpckA中分離，并連接進(jìn)已經(jīng)用酶XbaI消化的質(zhì)粒pMAK705(Hamilton等，細(xì)菌學(xué)雜志174，4617-4622(1989))。將DH5α用所述連接混合物轉(zhuǎn)化，并在含有20μg/ml氯霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA及用酶HpaI，KpnI，HindIII，SalI和PstI酶切后，檢測成功克隆情況。形成的交換載體pMAK705ΔpckA(＝pMAK705deltapckA)示于圖1。
實(shí)施例3在大腸桿菌菌株MG442中位點(diǎn)特異性誘變pckA基因L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株MG442在專利US-A-4278765中闡述，并保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，俄羅斯莫斯科)，保藏號CMIM B-1628。
菌株MG442具有α-氨基-β-羥戊酸抗性，并任選地部分和可補(bǔ)償?shù)匦枰狶-異亮氨酸。
為用所述質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體交換染色體pckA基因，用質(zhì)粒pMAK705ΔpckA轉(zhuǎn)化MG442。通過Hamilton等所述選擇方法進(jìn)行基因交換(細(xì)菌學(xué)雜志174，4617-4622(1989))，并使用以下寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法核實(shí)(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′。
獲得的菌株稱為MG442ΔpckA。
實(shí)施例4用菌株MG442ΔpckA生產(chǎn)L-蘇氨酸將MG442ΔpckA在具有以下組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3.5g/lNa2HPO4.2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4.7H2O，2g/l葡萄糖和20g/l瓊脂。在100ml Erlenmeyer燒瓶中含有的10ml分批培養(yǎng)物中檢測L-蘇氨酸的形成。將這些分批培養(yǎng)物接種于具有以下組分的10ml預(yù)培養(yǎng)基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，15g/l CaCO3和20g/l葡萄糖，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR溫育器上溫育16小時。將250μl此預(yù)培養(yǎng)物移至10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/l FeSO4.7H2O，0.018g/l MnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖)，在37℃溫育48小時。在溫育后，用得自Dr.Lange(德國柏林)的LP2W光度計測定培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)，測定波長為660nm。
隨后在過濾滅菌的培養(yǎng)上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和用茚三酮檢測柱后反應(yīng)，測定形成的L-蘇氨酸濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表1。
表1

實(shí)施例5用菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA生產(chǎn)L-蘇氨酸5.1 gdhA基因的擴(kuò)增和克隆使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸擴(kuò)增大腸桿菌K12的谷氨酸脫氫酶基因。基于大腸桿菌K12 MG1655的gdhA基因的核苷酸序列(基因文庫登記號No.AE000270和No.AE000271)合成PCR引物(NWG Biotech，Ebersberg，德國)Gdh15 ′-TGAACACTTCTGGCGGTACG-3′
Gdh25′-CCTCGGCGAAGCTAATATGG-3′根據(jù)廠商指導(dǎo)，用“QIAGEN Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德國)分離用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA。包含gdhA編碼區(qū)和大約350bp 5′-側(cè)翼序列和大約450bp 3′-側(cè)翼序列的一個大約2150bp的DNA片段，可以用特異引物在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis等，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)，用Pfu-DNA聚合酶(Promega公司，Madison，美國)擴(kuò)增得到。將所述PCR產(chǎn)物克隆在質(zhì)粒pCR2.1TOPO中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭，產(chǎn)品描述TOPO TA克隆試劑盒，Cat.No.K4500-01)。用限制酶EcoRI和EcoRV酶切質(zhì)粒pCR2.1TOPOgdhA證實(shí)成功克隆。為此，所述質(zhì)粒DNA通過“QIAprepSpin質(zhì)粒試劑盒”(QIAGEN，Hilden，德國)分離，并在酶切后在0.8％瓊脂糖凝膠中分離。
5.2在質(zhì)粒載體pMW218中克隆gdhA基因?qū)①|(zhì)粒pCR2.1TOPOgdhA用酶EcoRI酶切，并將酶切混合物在0.8％瓊脂糖凝膠中分離，借助于“QIAquick凝膠提取試劑盒”(QIAGEN，Hilden，德國)分離大小為2.1kbp的gdhA片段。質(zhì)粒pMW218(Nippon基因，日本富山)用酶EcoRI酶切，并與gdhA片段連接。大腸桿菌菌株DH5α用所述連接混合物轉(zhuǎn)化，并鋪板于加入20μg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox，病毒學(xué)1955，1∶190)上選擇攜帶pMW218的細(xì)胞。
在分離質(zhì)粒DNA及用EcoRI和EcoRV控制酶切后，可以證實(shí)gdhA基因的成功克隆。該質(zhì)粒稱為pMW218gdhA(圖3)。
5.3菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA的制備將實(shí)施例3中獲得的菌株MG442ΔpckA和菌株MG442用質(zhì)粒pMW218gdhA轉(zhuǎn)化，并在補(bǔ)加20μg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。以此方式形成菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA和MG442/pMW218gdhA。
5.4生產(chǎn)L-蘇氨酸如實(shí)施例4所述測試菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA和MG442/pMW218gdhA生產(chǎn)L-蘇氨酸情況。基本培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)基額外補(bǔ)加20μg/l卡那霉素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表2。
表2

實(shí)施例6用菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC生產(chǎn)L-蘇氨酸6.1 rhtC基因的擴(kuò)增使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸擴(kuò)增大腸桿菌K12的rhtC基因?；诖竽c桿菌K12 MG1655的rhtC基因的核苷酸序列(基因文庫登記號No.AE000458，Zakataeva等(FEBS通訊452，228-232(1999))，合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，德國)RhtC15′-CTGTTAGCATCGGCGAGGCA-3′RhtC25′-GCATGTTGATGGCGATGACG-3′根據(jù)廠商指導(dǎo)，用“QIAGEN Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德國)分離用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA。一個大約800bp的DNA片段，可以用特異引物在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis等，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)，用Pfu-DNA聚合酶(Promega公司，Madison，美國)擴(kuò)增得到。
6.2在質(zhì)粒載體pMW219中克隆rhtC基因?qū)①|(zhì)粒pMW219(Nippon基因，日本富山)用酶SamI酶切，并與rhtC-PCR片段連接。大腸桿菌菌株DH5α用所述連接混合物轉(zhuǎn)化，并鋪板于加入20μg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox，病毒學(xué)1955，1∶190)上選擇攜帶pMW219的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA及用KpnI，HindIII和NcoI控制酶切后，可以證實(shí)成功克隆。質(zhì)粒pMW219rhtC示于圖4。
6.3菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC的制備將實(shí)施例3中獲得的菌株MG442ΔpckA和菌株MG442用質(zhì)粒pMW219rhtC轉(zhuǎn)化，并在補(bǔ)加20μg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。以此方式形成菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC和MG442/pMW219rhtC。
6.4生產(chǎn)L-蘇氨酸如實(shí)施例4所述測試菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC和MG442/pMW219rhtC生產(chǎn)L-蘇氨酸情況。基本培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)基額外補(bǔ)加20μg/l卡那霉素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表3。
表3

實(shí)施例7用菌株B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40生產(chǎn)L-蘇氨酸生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株B-3996在US-A-5175107中闡述，并保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，俄羅斯莫斯科)。
菌株B-3996特別具有α-氨基-β-羥戊酸抗性，具有弱化的尤其關(guān)閉的或缺陷的蘇氨酸脫氫酶，具有反饋抗性形式的增強(qiáng)的高絲氨酸脫氫酶I天冬氨酸激酶I，任選地部分和可補(bǔ)償?shù)匦枰狶-異亮氨酸，及具有蔗糖利用能力。
7.1制備菌株B-3996kurΔtdhΔpck/pVIC40在無抗生素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約10代后，分離不再含有質(zhì)粒pVIC40的菌株B-3996衍生物。形成的菌株是鏈霉素敏感的，稱為B-3996kur。
使用Hamilton等所述方法(細(xì)菌學(xué)雜志(1989)1714617-4622)，在tdh基因中摻入缺失，所述方法基于使用具有溫度敏感復(fù)制子的質(zhì)粒pMAK705。質(zhì)粒pDR121(Ravnikar和Somerville，細(xì)菌學(xué)雜志(1987)1694716-4721)含有編碼tdh基因的一個大小為3.7kbp的大腸桿菌DNA片段。為產(chǎn)生tdh基因區(qū)缺失，將pDR121用限制酶ClaI和EcoRV酶切，在用Klenow酶處理后，連接分離的大小為5kbp的DNA片段。將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，并在加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
在分離質(zhì)粒DNA及用EcoRI控制酶切后，可以證實(shí)tdh基因的成功缺失。分離大小為1.7kbp的EcoRI片段，并與用EcoRI部分消化的質(zhì)粒pMAK705連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化DH5α并在加入20μg/ml氯霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA及用EcoRI酶切后，證實(shí)克隆成功。形成的pMAK705衍生物稱為pDM32。
為進(jìn)行基因置換，B-3996kur用質(zhì)粒pDM32轉(zhuǎn)化。用所述質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體置換染色體tdh基因通過Hamilton等所述選擇方法進(jìn)行，并使用以下寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)核實(shí)Tdh15′-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3′Tdh25′-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3′對形成的菌株測試其卡那霉素敏感性，并稱為B-3996kurΔtdh。
為進(jìn)行pckA基因的位點(diǎn)特異性誘變，B-3996kurΔtdh用實(shí)施例2所述置換載體pMAK705ΔpckA轉(zhuǎn)化。染色體pckA基因由所述質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體的置換如實(shí)施例3所述進(jìn)行。獲得的菌株稱為B-3996kurΔtdhΔpckA。
B-3996kurΔtdh和B-3996kurΔtdhΔpckA用分離自B-3996的質(zhì)粒pVIC40轉(zhuǎn)化，并在具有20μg/ml鏈霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。各自選擇的一個菌落稱為B-3996kurΔtdh/pVIC40和B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40。
7.2生產(chǎn)L-蘇氨酸如實(shí)施例4所述測試菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40和B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40生產(chǎn)L-蘇氨酸情況。基本培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)基額外補(bǔ)加20μg/l鏈霉素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表4。
表4

實(shí)施例8用菌株TOC21RΔpckA生產(chǎn)L-賴氨酸生產(chǎn)L-賴氨酸的大腸桿菌菌株pDAl/TOC21R在專利申請F(tuán)-A-2511032中闡述，并保藏于國立微生物保藏中心(CNCM，Pasteur研究所，法國巴黎)，保藏號I-167。所述菌株及無質(zhì)粒宿主也由Dauce-Le Reverend等所述(歐洲應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)學(xué)雜志15227-231(1982))，名稱為TOCR21/pDA1。
8.1大腸桿菌菌株TOC21R的pckA基因的位點(diǎn)特異性誘變在無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約6代后，分離不再含有質(zhì)粒pDA1的菌株pDA1/TOC21R衍生物。形成的菌株是四環(huán)素敏感的，并稱之為TOC21R。
為了用所述質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體置換染色體pckA基因，TOC21R用質(zhì)粒pMAK705ΔpckA(實(shí)施例2)轉(zhuǎn)化。基因置換通過Hamilton等所述選擇方法(細(xì)菌學(xué)雜志(1989)，174，4617-4622)進(jìn)行，并使用以下寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)核實(shí)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′獲得的菌株稱之為TOC21RΔpckA。
8.2用菌株TOC21RΔpckA生產(chǎn)L-賴氨酸菌株TOC21RΔpckA和TOC21R形成L-賴氨酸的情況在100ml錐形瓶中的10ml分批培養(yǎng)物中檢測。為此，接種具有以下組分的10ml預(yù)培養(yǎng)基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4.7H20，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR溫育器上溫育16小時。將250μl此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接種于10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/l FeSO4.7H2O，0.018g/lMnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，25mg/ml L-異亮氨酸和5mg/ml硫胺素)，在37℃溫育72小時。在溫育后，用得自Dr.Lange(德國柏林)的LP2W光度計測定培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)，測定波長為660nm。
隨后在過濾滅菌的培養(yǎng)上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和用茚三酮檢測柱后反應(yīng)，測定形成的L-賴氨酸濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表5。
表2 HBsAg陰性/抗-HBc陽性的HBV新加坡成人和經(jīng)接種的未成年人中的HBsAg突變體

如實(shí)施例4所述在測試條件下測試菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40和B-3996kurΔtdhilvA+/pVIC40生產(chǎn)L-異亮氨酸情況?；九囵B(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基額外補(bǔ)加20μg/ml鏈霉素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表6。
表6

實(shí)施例10用菌株B-12288ΔpckA生產(chǎn)L-纈氨酸生產(chǎn)L-纈氨酸的大腸桿菌菌株AJ 11502在專利申請US-A-4391907中闡述，并保藏于國家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(Peoria，Illinois，美國)，NRRL B-12288。
10.1大腸桿菌菌株B-12288中pckA基因的位點(diǎn)特異性誘變在無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約6代后，分離菌株AJ11502衍生物。形成的菌株是四環(huán)素敏感的，并稱之為AJ11502kur。
為用所述質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體置換染色體pckA基因，AJ11502kur用質(zhì)粒pMAK705ΔpckA(實(shí)施例2)轉(zhuǎn)化?；蛑脫Q通過Hamilton等所述選擇方法(細(xì)菌學(xué)雜志(1989)，174，4617-4622)進(jìn)行，并使用以下寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)核實(shí)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′獲得的菌株稱之為AJ11502kurΔpckA。專利申請US-A-4391907闡述的質(zhì)粒，其攜帶與纈氨酸生產(chǎn)相關(guān)的遺傳信息，分離自菌株NRRL B-12288。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株AJ11502kurΔpckA。將所得的轉(zhuǎn)化體之一稱為B-12288ΔpckA。
10.2用菌株B-12288ΔpckA生產(chǎn)L-纈氨酸菌株B-12288ΔpckA和NRRL B-12288形成L-纈氨酸的情況在100ml錐形瓶中的10ml分批培養(yǎng)物中檢測。為此，接種具有以下組分的10ml預(yù)培養(yǎng)基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖和50mg/l氨芐青霉素，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR溫育器上溫育16小時。將250μl此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接種于10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(25g/l (NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/lFeSO4.7H2O，0.018g/l MnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，5mg/ml硫胺素和50mg/l氨芐青霉素)，在37℃溫育72小時。在溫育后，用得自Dr.Lange(德國柏林)的LP2W光度計測定培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)，測定波長為660nm。
隨后在過濾滅菌的培養(yǎng)上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和用茚三酮檢測柱后反應(yīng)，測定形成的L-纈氨酸濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表7。
表7

實(shí)施例11ytfP-yjfA基因區(qū)缺失突變體的構(gòu)建將大腸桿菌K12的ytfP-yjfA基因區(qū)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸擴(kuò)增。從大腸桿菌K12 MG1655中ytfP-yjfA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO5)開始，合成以下PCR引物(MWGBiotech，Ebersberg，德國)ytfP-15′-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3′ytfP-25′-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3′用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA用“QiagenGenomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德國)，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離。一個大約1300bp DNA片段可以使用Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，德國)，在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下用特異引物擴(kuò)增(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)。將PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商指導(dǎo)，與載體pCR2.1TOPO(TOPO TA克隆試劑盒，Invitrogen，Groningen，荷蘭)連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株TOP10F’中。在加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA后，用限制酶EcoRI和NsiI檢測所述PCR產(chǎn)物的成功克隆。
為在ytfP-yjfA區(qū)域中產(chǎn)生一個337bp缺失，將載體pCR2.1TOPOytfP-yjfA用限制酶NdeI和SspI酶切，并在用Klenow酶處理后，連接4.8kbp的DNA片段。
為產(chǎn)生一個90bp缺失，將載體pCR2.1TOPOytfP-yjfA用限制酶NdeI和SplI酶切，并在用Klenow酶處理后，連接5kbp的DNA片段。
用所述連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，并在加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA后，通過用限制酶EcoRI控制酶切檢測其中克隆有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示突變DNA序列的那些質(zhì)粒。所述質(zhì)粒稱為pCR2.1TOPOΔyjfA和pCR2.1TOPOΔ90bp。
實(shí)施例12置換載體pMAK705ΔyjfA和pMAK705Δ90bp的構(gòu)建在用酶SacI和XbaI限制及在0.8％瓊脂糖凝膠中分離后，從載體pCR2.1TOPOΔyjfA和pCR2.1TOPOΔ90bp中分離實(shí)施例11所述ytfP-yjfA等位基因，并與用酶SacI和XbaI消化的質(zhì)粒pMAK705(Hamilton等(1989)，細(xì)菌學(xué)雜志174，4617-4622)連接。在DH5α中轉(zhuǎn)化所述連接混合物，并在加入20μg/ml氯霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA及用酶SacI和XbaI酶切后，證實(shí)克隆成功。形成的置換載體pMAK705ΔyjfA(＝pMAK705deltayjfA)和pMAK705Δ90bp(＝pMAK705delta90bp)示于圖2和圖5。
實(shí)施例13ytfP-yjfA基因區(qū)在大腸桿菌菌株MG442中的位點(diǎn)特異性誘變?yōu)橛盟鲑|(zhì)粒編碼的90bp缺失構(gòu)建體置換染色體ytfP-yjfA區(qū)，MG442用質(zhì)粒pMAK705Δ90bp轉(zhuǎn)化。所述基因置換如Hamilton等所述選擇方法進(jìn)行(細(xì)菌學(xué)雜志(1989)，174，4617-4622)，并使用以下寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法核實(shí)(Innis等(1990)，PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社)ytfP-15′-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3′ytfP-25′-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3′所得菌株稱為MG442Δ90yjfA。
實(shí)施例14用菌株MG442Δ90yjfA生產(chǎn)L-蘇氨酸如實(shí)施例4所述測試菌株MG442Δ90yjfA生產(chǎn)L-蘇氨酸的情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表8。
表8

(8)類諾瓦克病毒人工標(biāo)準(zhǔn)RNA的上升時間(熒光中比率增加到陰性對照樣品的平均值加上3個標(biāo)準(zhǔn)誤的和的1.2倍所需要的時間)的結(jié)果在表3中顯示。表明使用本發(fā)明的寡核苷酸組合，在30分鐘內(nèi)檢測到GI的四種標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品。
表3

表3顯示了使用實(shí)施例2中所用寡核苷酸組合測定類諾瓦克病毒人工標(biāo)準(zhǔn)RNA(GI的四個樣品)的結(jié)果。實(shí)施例2中所用寡核苷酸組合在30分鐘內(nèi)檢測到GI的四個標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品。
工業(yè)可應(yīng)用性如上所述，本發(fā)明的檢測方法有效用于快速和高度靈敏地檢測類諾瓦克病毒的所有GI亞型和所有GII亞型的檢測。本發(fā)明的寡核苷酸不限于序列表中所列的堿基序列(具有18到23個堿基)，而是可以是由這些序列中至少10個相鄰堿基組成的核苷酸。這是因?yàn)楹苊黠@約10個堿基的堿基序列在相對低溫(優(yōu)選43℃)條件下足以保證對引物或探針的目標(biāo)核酸的特異性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白盡管將本發(fā)明與特定實(shí)施方案和實(shí)施例一起描述，但是本發(fā)明不一定被如此限制并且可以得到與這些實(shí)施方案、實(shí)施例和用途相偏離但不脫離本發(fā)明范圍的多種其他實(shí)施方案、實(shí)施例、用途、修改方案。
序列表<110>德古薩股份公司<120>使用腸細(xì)菌科菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>000425 BT<140>
<141>
<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(1620)<223>pckA<400>1atg cgc gtt aac aat ggt ttg acc ccg caa gaa ctc gag gct tat ggt 48Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15atc agt gac gta cat gat atc gtt tac aac cca agc tac gac ctg ctg 96Ile Ser Asp Val His Asp Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Asp Leu Leu20 25 30tat cag gaa gag ctc gat ccg agc ctg aca ggt tat gag cgc ggg gtg 144Tyr Gln Glu Glu Leu Asp Pro Ser Leu Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Val35 40 45tta act aat ctg ggt gcc gtt gcc gtc gat acc ggg atc ttc acc ggt 192Leu Thr Asn Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly50 55 60cgt tca cca aaa gat aag tat atc gtc cgt gac gat acc act cgc gat 240Arg Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Asp65 70 75 80act ttc tgg tgg gca gac aaa ggc aaa ggt aag aac gac aac aaa cct 288Thr Phe Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lys Pro85 90 95ctc tct ccg gaa acc tgg cag cat ctg aaa ggc ctg gtg acc agg cag 336Leu Ser Pro Glu Thr Trp Gln His Leu Lys Gly Leu Val Thr Arg Gln100 105 110crt tcc ggc aaa cgt ctg ttc gtt gtc gac gct ttc tgt ggt gcg aac 384Leu Ser Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Asn115 120 125ccg gat act cgt ctt tcc gtc cgt ttc atc acc gaa gtg gcc tgg cag 432Pro Asp Thr Arg Leu Ser Val Arg Phe Ile Thr Glu Val Ala Trp Gln130 135 140
gcg cat ttt gtc aaa aac atg ttt att cgc ccg agc gat gaa gaa ctg480Ala His Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu145 150 155 160gca ggt ttc aaa cca gac ttt atc gtt atg aac ggc gcg aag tgc act528Ala Gly Phe Lys Pro Asp Phe Ile Val Met Asn Gly Ala Lys Cys Thr165 170 175aac ccg cag tgg aaa gaa cag ggt ctc aac tcc gaa aac ttc gtg gcg576Asn Pro Gln Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala180 185 190ttt aac ctg acc gag cgc atg cag ctg att ggc ggc acc tgg tac ggc624Phe Ash Leu Thr Glu Arg Met Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly195 200 205ggc gaa atg aag aaa ggg atg ttc tcg atg atg aac tac ctg ctg ccg672Gly Glu Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Leu Leu Pro210 215 220ctg aaa ggt atc gct tct atg cac tgc tcc gcc aac gtt ggt gag aaa720Leu Lys Gly Ile Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu Lys225 230 235 240ggc gat gtt gcg gtg ttc ttc ggc ctt tcc ggc acc ggt aaa acc acc768Gly Asp Val Ala Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr245 250 255ctt tcc acc gac ccg aaa cgt cgc ctg att ggc gat gac gaa cac ggc816Leu Ser Thr Asp Pro Lys Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly260 265 270tgg gac gat gac ggc gtg ttt aac ttc gaa ggc ggc tgc tac gca aaa864Trp Asp Asp Asp Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys275 280 285act atc aag ctg tcg aaa gaa gcg gaa cct gaa atc tac aac gct atc912Thr Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Ile Tyr Asn Ala Ile290 295 300cgt cgt gat gcg ttg ctg gaa aac gtc acc gtg cgt gaa gat ggc act960Arg Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Thr Val Arg Glu Asp Gly Thr305 310 315 320atc gac ttt gat gat ggt tca aaa acc gag aac acc cgc gtt tct tat1008Ile Asp Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr325 330 335ccg atc tat cac atc gat aac att gtt aag ccg gtt tcc aaa gcg ggc1056Pro Ile Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Gly340 345 350cac gcg act aag gtt atc ttc ctg act gct gat gct ttc ggc gtg ttg1104His Ala Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu355 360 365ccg ccg gtt tct cgc ctg act gcc gat caa acc cag tat cac ttc ctc1152Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Ala Asp Gln Thr Gln Tyr His Phe Leu370 375 380tct ggc ttc acc gcc aaa ctg gcc ggt act gag cgt ggc atc acc gaa1200Ser Gly Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu
385 390 395 400ccg acg cca acc ttc tcc gct tgc ttc ggc gcg gca ttc ctg tcg ctg1248Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu405 410 415cac ccg act cag tac gca gaa gtg ctg gtg aaa cgt atg cag gcg gcg1296His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala420 425 430ggc gcg cag gct tat ctg gtt aac act ggc tgg aac ggc act ggc aaa1344Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys435 440 445cgt atc tcg att aaa gat acc cgc gcc att atc gac gcc atc ctc aac1392Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn450 455 460ggt tcg ctg gat aat gca gaa acc ttc act ctg ccg atg ttt aac ctg1440Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu465 470 475 480gcg atc cca acc gaa ctg ccg ggc gta gac acg aag att ctc gat ccg1488Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro485 490 495cgt aac acc tac gct tct ccg gaa cag tgg cag gaa aaa gcc gaa acc1536Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr500 505 510ctg gcg aaa ctg ttt atc gac aac ttc gat aaa tac acc gac acc cct1584Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro515 520 525gcg ggt gcc gcg ctg gta gcg gct ggt ccg aaa ctg taa1623Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Pro Lys Leu530 535 540<210>2<211>540<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15Ile Ser Asp Val His Asp Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Asp Leu Leu20 25 30Tyr Gln Glu Glu Leu Asp Pro Ser Leu Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Val35 40 45Leu Thr Asn Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly50 55 60Arg Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Asp65 70 75 80Thr Phe Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lys Pro85 90 95
Leu Ser Pro Glu Thr Trp Gln His Leu Lys Gly Leu Val Thr Arg Gln100 105 110Leu Ser Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Asn115 120 125Pro Asp Thr Arg Leu Ser Val Arg Phe Ile Thr Glu Val Ala Trp Gln130 135 140Ala His Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu145 150 155 160Ala Gly Phe Lys Pro Asp Phe Ile Val Met Asn Gly Ala Lys Cys Thr165 170 175Asn Pro Gln Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala180 185 190Phe Asn Leu Thr Glu Arg Met Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly195 200 205Gly Glu Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Leu Leu Pro210 215 220Leu Lys Gly Ile Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu Lys225 230 235 240Gly Asp Val Ala Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr245 250 255Leu Ser Thr Asp Pro Lys Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly260 265 270Trp Asp Asp Asp Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys275 280 285Thr Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Ile Tyr Asn Ala Ile290 295 300Arg Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Thr Val Arg Glu Asp Gly Thr305 310 315 320Ile Asp Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr325 330 335Pro Ile Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Gly340 345 350His Ala Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu355 360 365Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Ala Asp Gln Thr Gln Tyr His Phe Leu370 375 380Ser Gly Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu385 390 395 400Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu405 410 415His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala
420 425 430Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Ash Gly Thr Gly Lys435 440 445Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn450 455 460Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu465 470 475 480Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro485 490 495Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr500 505 510Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro515 520 525Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Pro Lys Leu530 535 540<210>3<21l>1156<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1156)<223>Mutagene DNA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(35)<223>Technical DNA/多接頭序列的殘基<220>
<221>misc_feature<222>(36)..(522)<223>pckA基因的5′區(qū)(pck1)的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(523)..(542)<223>Technical DNA/多接頭序列的殘基<220>
<221>misc_feature<222>(543)..(1105)<223>pckA基因的3′區(qū)(pck2)的一部分<220>
<221>misc_feature<222>(1106)..(1156)<223>Technical DNA/多接頭序列的殘基<400>3ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc ggcttgatcc gagcctgaca ggttatgagc 60gcggggtgtt aactaatctg ggtgccgttg ccgtcgatac cgggatcttc accggtcgtt 120
caccaaaaga taagtatatc gtccgtgacg ataccactcg cgatactttc tggtgggcag 180acaaaggcaa aggtaagaac gacaacaaac ctctctctcc ggaaacctgg cagcatctga 240aaggcctggt gaccaggcag ctttccggca aacgtctgtt cgttgtcgac gctttctgtg 300gtgcgaaccc ggatactcgt ctttccgtcc gtttcatcac cgaagtggcc tggcaggcgc 360attttgtcaa aaacatgttt attcgcccga gcgatgaaga actggcaggt ttcaaaccag 420actttatcgt tatgaacggc gcgaagtgca ctaacccgca gtggaaagaa cagggtctca 480actccgaaaa cttcgtggcg tttaacctga ccgagcgcat gcaagccgaa ttctgcagat 540cctgaagatg gcactatcga ctttgatgat ggttcaaaaa ccgagaacac ccgcgtttct 600tatccgatct atcacatcga taacattgtt aagccggttt ccaaagcggg ccacgcgact 660aaggttatct tcctgactgc tgatgctttc ggcgtgttgc cgccggtttc tcgcctgact 720gccgatcaaa cccagtatca cttcctctct ggcttcaccg ccaaactggc cggtactgag 780cgtggcatca ccgaaccgac gccaaccttc tccgcttgct tcggcgcggc attcctgtcg 840ctgcacccga ctcagtacgc agaagtgctg gtgaaacgta tgcaggcggc gggcgcgcag 900gcttatctgg ttaacactgg ctggaacggc actggcaaac gtatctcgat taaagatacc 960cgcgccatta tcgacgccat cctcaacggt tcgctggata atgcagaaac cttcactctg 1020ccgatgttta acctggcgat cccaaccgaa ctgccgggcg tagacacgaa gattctcgat 1080ccgcgtaaca cctacgcttc tccggaagcc gaattctgca gatatccatc acactggcgg 1140ccgctcgagc atgcat 1156<210>4<211>1294<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>delta pckA等位基因的起始密碼子<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(598)<223>delta pckA等位基因的5′區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(599)..(618)<223>Technical DNA/多接頭序列的殘基<220>
<221>misc_feature<222>(619)..(1291)<223>delta pckA等位基因的3′區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(1292)..(1294)<223>delta pckA等位基因的終止密碼子<400>4atgcgcgtta acaatggttt gaccccgcaa gaactcgagg cttatggtat cagtgacgta 60catgatatcg tttacaaccc aagctacgac ctgctgtatc aggaagagct cgatccgagc 120ctgacaggtt atgagcgcgg ggtgttaact aatctgggtg ccgttgccgt cgataccggg 180atcttcaccg gtcgttcacc aaaagataag tatatcgtcc gtgacgatac cactcgcgat 240actttctggt gggcagacaa aggcaaaggt aagaacgaca acaaacctct ctctccggaa 300acctggcagc atctgaaagg cctggtgacc aggcagcttt ccggcaaacg tctgttcgtt 360gtcgacgctt tctgtggtgc gaacccggat actcgtcttt ccgtccgttt catcaccgaa 420gtggcctggc aggcgcattt tgtcaaaaac atgtttattc gcccgagcga tgaagaactg 480gcaggtttca aaccagactt tatcgttatg aacggcgcga agtgcactaa cccgcagtgg 540aaagaacagg gtctcaactc cgaaaacttc gtggcgttta acctgaccga gcgcatgcaa 600gccgaattct gcagatcctg aagatggcac tatcgacttt gatgatggtt caaaaaccga 660gaacacccgc gtttcttatc cgatctatca catcgataac attgttaagc cggtttccaa 720
agcgggccac gcgactaagg ttatcttcct gactgctgat gctttcggcg tgttgccgcc 780ggtttctcgc ctgactgccg atcaaaccca gtatcacttc ctctctggct tcaccgccaa 840actggccggt actgagcgtg gcatcaccga accgacgcca accttctccg cttgcttcgg 900cgcggcattc ctgtcgctgc acccgactca gtacgcagaa gtgctggtga aacgtatgca 960ggcggcgggc gcgcaggctt atctggttaa cactggctgg aacggcactg gcaaacgtat 1020ctcgattaaa gatacccgcg ccattatcga cgccatcctc aacggttcgc tggataatgc 1080agaaaccttc actctgccga tgtttaacct ggcgatccca accgaactgc cgggcgtaga 1140cacgaagatt ctcgatccgc gtaacaccta cgcttctccg gaacagtggc aggaaaaagc 1200cgaaaccctg gcgaaactgt ttatcgacaa cttcgataaa tacaccgaca cccctgcggg 1260tgccgcgctg gtagcggctg gtccgaaact gtaa 1294<210>5<211>1248<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>基因<222>(376)..(714)<223>ORF ytfP<220>
<221>基因<222>互補(bǔ)體((461)..(727))<223>ORF yjfA<400>5ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggc tggagagcga 60tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagacgtt tggcgtaagc aatttagcgc tcgacaccca 180gggagtaggc gactcctccc aggtagtggt cagcggctat gtattgccag gtctgcaagt 240gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacactc acgttacgtt atcgcctgat 300gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360gttcgagttt tagcaatgcg aatatttgtc tacggcagtt tacgccacaa acaaggcaac 420agtcactgga tgaccaatgc ccagttactg ggcgatttca gtatcgataa ctaccagttg 480tatagcctgg gccactatcc aggcgcagtt ccggggaacg gaacggtaca cggtgaagtt 540tatcgtattg acaacgccac gctggccgaa cttgatgcct tgcgcaccag gggcggtgaa 600tacgcgcgcc agttgattca gacgccgtac gggagtgcat ggatgtacgt ttatcaacga 660cccgtcgatg gattaaagct aattgaaagc ggcgactggt tagacaggga taagtaacca 720tatgcatacg ccaccttcgg gtggcgttgt tttttgcgag acgactcgca ttctgttttg 780taattccctc accttttgct tttctctccg agccgctttc catatctatt aacgcataaa 840aaactctgct ggcattcaca aatgcgcagg ggtaaaacgt ttcctgtagc accgtgagtt 900atactttgta taacttaagg aggtgcagat gcgtattacc ataaaaagat gggggaacag 960tgcaggtatg gtcattccca atatcgtaat gaaagaactt aacttacagc cggggcagag 1020cgtggaggcg caagtgagca acaatcaact gattctgaca cccatctcca ggcgctactc 1080gcttgatgaa ctgctggcac agtgtgacat gaacgccgcg gaacttagcg agcaggatgt 1140ctggggtaaa tccacccctg cgggtgacga aatatggtaa agaaaagtga atttgaacgg 1200ggagacattg tgctggttgg ctttgatcca gcaagcggcc atgaacag 1248<210>6<211>911<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(911)<223>攜帶缺失的ytfP-yjfA區(qū)<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(383)<223>ytfP-yj fA區(qū)的5′側(cè)翼<220>
<221>misc_feature<222>(384)..(911)<223>ytfP-yjfA區(qū)的3′側(cè)翼<220>
<221>misc_feature<222>(376)..(378)<223>截短的ORF ytfP的ATG密碼子<220>
<221>misc_feature<222>互補(bǔ)體((388)..(390))<223>截短的的ORF yjfA的ATG密碼子<400>6ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggc tggagagcga 60tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagacgtt tggcgtaagc aatttagcgc tcgacaccca 180gggagtaggc gactcctccc aggtagtggt cagcggctat gtattgccag gtctgcaagt 240gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacactc acgttacgtt atcgcctgat 300gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360gttcgagttt tagcaatgcg aattatgcat acgccacctt cgggtggcgt tgttttttgc 420gagacgactc gcattctgtt ttgtaattcc ctcacctttt gcttttctct ccgagccgct 480ttccatatct attaacgcat aaaaaactct gctggcattc acaaatgcgc aggggtaaaa 540cgtttcctgt agcaccgtga gttatacttt gtataactta aggaggtgca gatgcgtatt 600accataaaaa gatgggggaa cagtgcaggt atggtcattc ccaatatcgt aatgaaagaa 660cttaacttac agccggggca gagcgtggag gcgcaagtga gcaacaatca actgattctg 720acacccatct ccaggcgcta ctcgcttgat gaactgctgg cacagtgtga catgaacgcc 780gcggaactta gcgagcagga tgtctggggt aaatccaccc ctgcgggtga cgaaatatgg 840taaagaaaag tgaatttgaa cggggagaca ttgtgctggt tggctttgat ccagcaagcg 900gccatgaaca g 911<210>7<211>1158<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1158)<223>攜帶缺失的ytfP-yjfA區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(630)<223>ytfP-yjfA區(qū)的5′側(cè)翼<220>
<221>misc_feature<222>(631)..(1158)<223>ytfP-yjfA區(qū)的3′側(cè)翼<220>
<221>misc_feature<222>(376)..(378)<223>截短的ORF ytfP的ATG密碼子<220>
<221>misc_feature<222>complement((635)..(637))<223>截短的ORF yjfA的ATG密碼子<400>7ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggc tggagagcga 60tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagacgtt tggcgtaagc aatttagcgc tcgacaccca 180gggagtaggc gactcctccc aggtagtggt cagcggctat gtattgccag gtctgcaagt 240gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacactc acgttacgtt atcgcctgat 300gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360gttcgagttt tagcaatgcg aatatttgtc tacggcagtt tacgccacaa acaaggcaac 420agtcactgga tgaccaatgc ccagttactg ggcgatttca gtatcgataa ctaccagttg 480tatagcctgg gccactatcc aggcgcagtt ccggggaacg gaacggtaca cggtgaagtt 540tatcgtattg acaacgccac gctggccgaa cttgatgcct tgcgcaccag gggcggtgaa 600tacgcgcgcc agttgattca gacgccgtac tatgcatacg ccaccttcgg gtggcgttgt 660tttttgcgag acgactcgca ttctgttttg taattccctc accttttgct tttctctccg 720agccgctttc catatctatt aacgcataaa aaactctgct ggcattcaca aatgcgcagg 780ggtaaaacgt ttcctgtagc accgtgagtt atactttgta taacttaagg aggtgcagat 840gcgtattacc ataaaaagat gggggaacag tgcaggtatg gtcattccca atatcgtaat 900gaaagaactt aacttacagc cggggcagag cgtggaggcg caagtgagca acaatcaact 960gattctgaca cccatctcca ggcgctactc gcttgatgaa ctgctggcac agtgtgacat 1020gaacgccgcg gaacttagcg agcaggatgt ctggggtaaa tccacccctg cgggtgacga 1080aatatggtaa agaaaagtga atttgaacgg ggagacattg tgctggttgg ctttgatcca 1140gcaagcggcc atgaacag1158<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物pckA′5′-1<400>8gatccgagcc tgacaggtta 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物pckA′5′-2<400>9gcatgcgctc ggtcaggtta 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物pckA′3′-1<400>10
aggcctgaag atggcactat cg22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物pckA′3′-2<400>11ccggagaagc gtaggtgtta 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物Gdh1<400>12tgaacacttc tggcggtacg 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物Gdh2<400>13cctcggcgaa gctaatatgg 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物RhtC1<400>14ctgttagcat cggcgaggca 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物RhtC2<400>15gcatgttgat ggcgatgacg 20
<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物Tdh1<400>16tcgcgaccta taagtttggg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物Tdh2<400>17aataccagcc cttgttcgtg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ytfP-1<400>18ggcgatgtcg caacaagctg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ytfP-2<400>19ctgttcatgg ccgcttgctg 20
權(quán)利要求
1.發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、尤其L-蘇氨酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a) 發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的腸細(xì)菌科微生物，該微生物中至少開放讀框(orf)yjfA和/或ytfP或編碼其的核苷酸序列被弱化，尤其是關(guān)閉，b)富集所述培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中L-氨基酸，及c)分離L-氨基酸，發(fā)酵肉湯的組分及全部或部分生物量任選地作為固體產(chǎn)物與L-氨基酸一起分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-賴氨酸或L-蘇氨酸。
3.生產(chǎn)L-氨基酸的腸細(xì)菌科微生物，其中至少開放讀框yjfA和/或ytfP或編碼其的核苷酸序列被弱化。
4.權(quán)利要求3的生產(chǎn)L-氨基酸的腸細(xì)菌科微生物，其中至少開放讀框yjfA和/或ytfP或編碼其的核苷酸序列被關(guān)閉。
5.權(quán)利要求3的生產(chǎn)L-氨基酸的腸細(xì)菌科微生物，其額外具有一或多個選自以下一組的特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，反饋抗性形式的擴(kuò)增的高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I，任選地可補(bǔ)償?shù)夭糠中枰狶-異亮氨酸，弱化的蘇氨酸脫氫酶，及蔗糖利用能力。
6.圖2所示質(zhì)粒pMAK705ΔyjfA，其含有相應(yīng)于SEQ ID NO6的ytfP-yjfA區(qū)的5′和3′側(cè)翼，包括開放讀框yjfA和ytfP的極少殘基。
7.圖5所示質(zhì)粒pMAK705Δ90bp，其含有相應(yīng)于SEQ ID NO7的ytfP-yjfA區(qū)的5′和3′側(cè)翼，包括開放讀框yjfA和ytfP的極少殘基。
8.來自腸細(xì)菌科微生物的分離的多核苷酸，含有ytfP-yjfA區(qū)的5′和3′側(cè)翼，如SEQ ID NO6所示，所述多核苷酸特別適于作為位點(diǎn)特異性誘變開放讀框ytfP和/或yjfA的質(zhì)粒的組分。
9.生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸細(xì)菌科菌株，其含有相應(yīng)于SEQ ID NO6或7的開放讀框ytfP中的一個缺失突變。
10.生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸細(xì)菌科菌株，其含有相應(yīng)于SEQ ID NO6或7的開放讀框yjfA中的一個缺失突變。
11.權(quán)利要求9或10的生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸細(xì)菌科菌株，其中它們具有選自以下一組的一或多個特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，反饋抗性形式的擴(kuò)增的高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I，任選地可補(bǔ)償?shù)夭糠中枰狶-異亮氨酸，弱化的蘇氨酸脫氫酶，及蔗糖利用能力。
12.大腸桿菌K-12菌株MG442Δ90yjfA，保藏在德意志微生物保藏中心，保藏號DSM 14289。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸尤其L－蘇氨酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L－氨基酸的腸細(xì)菌科微生物，該微生物中至少pckA基因或編碼其的核苷酸序列被弱化，尤其是被關(guān)閉，b)富集所述培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L－氨基酸，及c)分離L－氨基酸。
文檔編號C12N15/60GK1680547SQ20051006886
公開日2005年10月12日 申請日期2001年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月30日
發(fā)明者梅希特希爾德·里平, 克里斯蒂娜·巴斯圖克, 托馬斯·赫爾曼, 格奧爾格·蒂爾巴赫 申請人:德古薩股份公司