專利名稱：一種黃瓜霜霉病菌菌株的保存方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護領域中一種專性寄生菌的保存方法，特別是涉及黃瓜霜霉病菌菌株的一種保存方法。
背景技術：
黃瓜是我國蔬菜產區(qū)露地和保護地栽培的主要種植品種，在多數地區(qū)可以整年種植。霜霉病是黃瓜生產上最重要的病害之一，凡栽培黃瓜的地區(qū)均有發(fā)生，在我國尤以北方地區(qū)受害最重，露地栽培以春茬黃瓜發(fā)病最重，保護地栽培則春季或冬季發(fā)病較重。該病主要由氣流傳播，具有侵染頻繁、潛育期短的特點，流行危害嚴重，能在幾日內導致植物全部死亡，俗稱“跑馬干”，也因在其發(fā)病后，黃瓜葉背出現大量紫褐色的霉狀物，而稱之為“黑毛病”。
黃瓜霜霉病的病原菌為古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis(Berk.EtCert.)Rostr.)，該菌是一種專性寄生菌，其孢子萌發(fā)后菌絲主要在寄主細胞間隙擴展，不能在人工培養(yǎng)基上生長，因此該菌株難于在離體條件下進行長期的保存。國內外的許多研究機構和農化企業(yè)現正加緊研制對該致病菌具有有效防治效果的新型殺菌劑。在用所研制的不同殺菌劑對黃瓜霜霉病菌進行毒力測定時需要用到大量的該活體致病菌，因此迫切需要一種黃瓜霜霉病菌菌株的長期保存方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種黃瓜霜霉病菌菌株的較長期的保存方法。
本發(fā)明所提供的黃瓜霜霉病菌菌株的保存方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-6葉位上的健康離體葉片制成葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液，然后將其在17-20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20-28h，再于17-20℃、濕度RH大于80％、10-14h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，待葉碟背面產生黑色霉層后，置于-30℃至-80℃下密閉保存。
上述方法中，所述健康離體葉片優(yōu)選為黃瓜植株第4葉位上的葉片；葉碟的尺寸為Φ1.2-2.0cm，優(yōu)選為Φ1.5cm；黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1×104-1×105個孢子囊/mL，優(yōu)選為1.0×104個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL；背面滴加有黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養(yǎng)條件優(yōu)選為先在19℃的黑暗條件下保濕培養(yǎng)24h，再于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)；保存溫度優(yōu)選為-80℃。
所述孢子囊懸浮液的獲得方法為；田間采集葉背面有黑色霉層的病葉，室內將病葉上的雜質和老熟的孢子囊洗凈后，在19℃下暗培養(yǎng)誘導產生新的孢子囊，再將新生孢子囊接種到無菌的健康離體黃瓜葉片背面，置于17-20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20-28h，再于17-20℃、濕度RH大于80％、10-14h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，待葉片背面產生黑色霉層后，挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，并將單孢囊梗及其著生的孢子囊轉接到健康黃瓜第3-5葉位上的離體葉片背面在17-20℃下保濕培養(yǎng)，發(fā)病后洗脫病斑上的孢子囊配成孢子囊懸浮液。
在上述孢子囊懸浮液的獲得方法中，新生孢子囊的接種方法為液滴法，用液滴法接種時所用的新生孢子囊懸浮液的濃度優(yōu)選為1.0×104個孢子囊/mL，接種體積為10μL；背面接種有黃瓜霜霉病菌孢子囊的黃瓜葉片的培養(yǎng)條件優(yōu)選為先在19℃的黑暗條件下保濕培養(yǎng)24h，再于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替條件下培養(yǎng)。
在實際應用中，可將上述方法保存的黃瓜霜霉病菌菌株放入冰盒中使其緩慢升溫，以免孢子囊驟熱而開裂，然后洗脫孢子囊，制成孢子囊懸浮液即可使用。
本發(fā)明根據黃瓜霜霉病菌在低溫下能存活的特點，提供了一種低溫冷藏條件下保存黃瓜霜霉病菌菌株的簡便、長久的方法?？墒裹S瓜霜霉病菌菌株在60天內均保持較高活性，可用葉盤漂浮法等常規(guī)的毒力測定法對其進行毒力測定，測定結果表明用該法保存的菌株在60d內的致病力均與空白對照一致，無明顯差異，可用于殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力測定，為研究黃瓜霜霉病的防治提供了極大方便。本發(fā)明具有較高的實際應用價值。


圖1為從田間發(fā)病植株采集的葉背面有明顯褐色霉層的病葉圖2為在病葉上誘導產生的新孢子囊圖3為接種有新生孢子囊懸浮液的健康離體黃瓜葉片圖4為將接種有新生孢子囊懸浮液的健康離體的黃瓜植株的葉片進行暗培養(yǎng)后于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替的條件下培養(yǎng)具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
供試植物材料將感病黃瓜品種長春密刺栽培于Φ15cm，高12cm的育苗缽內，置于玻璃溫室中培養(yǎng)，待植株長到6葉期后采集健康植株第4葉位的葉片，用于黃瓜霜霉病菌的培養(yǎng)及菌株的低溫冷凍保藏。
實施例1、黃瓜霜霉病菌的分離培養(yǎng)和保存1、黃瓜霜霉病樣采集和病菌的分離培養(yǎng)從北京郊區(qū)的平谷東高村崔莊子科技園、懷柔王化村西菜地、延慶永寧鎮(zhèn)孔化營村、昌平南郝莊蘋園及中國農業(yè)大學昌平實驗站、房山豆店村、海淀區(qū)西北旺村及河北巒平、內蒙等地區(qū)未施用過氟嗎啉及同類藥劑烯酰嗎啉的黃瓜栽培地采集黃瓜霜霉病菌樣本，共分離得到77株敏感菌株，同時從北京郊區(qū)分離得到6株對甲霜靈具有不同抗性水平的抗藥性菌株；從進行過2年腈嘧菌酯田間藥效試驗的大棚分離得到6株腈嘧菌酯抗藥性菌株。具體方法為將從田間發(fā)病植株采集的葉背面有明顯褐色霉層的病葉(圖1)用蒸餾水將葉片上殘留的雜質和老熟的孢子囊洗凈，然后置于19℃的條件下黑暗培養(yǎng)24h，誘導產生新的孢子囊(圖2)。用4℃無菌水將新產生的孢子囊洗脫，配成每毫升含有1×104個孢子囊的懸浮液，用液滴法接種到用無菌水沖洗后的健康離體的黃瓜植株的葉片背面，每滴10μL，再將其置于用吸水紙保濕的Φ150mm培養(yǎng)皿中于19℃黑暗條件下培養(yǎng)24h(圖3)，以確保病原菌的侵入，然后于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替的條件下培養(yǎng)(圖4)，葉片接菌3d后可以觀察到不規(guī)則的水浸狀病斑，5d后葉片背面產生黑色霉層。在解剖鏡下挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，并將挑取的單孢囊梗及其著生的孢子囊轉移到健康的離體黃瓜葉片背面進行保濕培養(yǎng)，病原菌在黃瓜離體葉片上能保存10-15d。可繼續(xù)用4℃無菌水洗脫病斑上的孢子囊，轉接到新鮮的健康黃瓜離體葉片上繼代培養(yǎng)。
2、黃瓜霜霉病菌的低溫冷藏保存選擇黃瓜植株第4葉位的健康離體葉片，進行表面消毒處理后，用打孔器制取Φ1.5cm的黃瓜葉碟，每個葉碟背面滴加用上述方法分離獲得的黃瓜霜霉病菌的孢子囊配制的濃度為1×104個孢子囊/mL的孢子囊懸浮液10μL，然后按照步驟1所述的方法培養(yǎng)，待葉碟背面產生黑色霉層后，將其小心裝入10mL具塞離心管中，分別置于4℃，-20℃，-30℃，-70℃和-80℃下保存，每個溫度重復放置10管，每隔10d取1管放入冰盒中緩慢升溫，以免孢子囊驟熱而開裂。然后洗脫孢子囊，制成濃度為1×104個孢子囊/mL的孢子囊懸浮液，將其接種在黃瓜葉盤上，保濕培養(yǎng)，發(fā)病后測量病斑面積，比較各保存溫度下不同保存時間病菌致病力的變化，黃瓜霜霉病菌在4℃下保存時間小于10d，-20℃下可保存20d，-30℃下至少可保存40d，-70℃和-80℃下可保存至少60d以上。但在-20℃和-30℃條件下保存，隨著時間增長，菌種致病力減弱；而在-70℃和-80℃條件下，60d內菌種致病力與空白對照一致，沒有顯著性差異。當保存時間大于30d時，-80℃條件下菌種的致病力強于其它條件處理的菌種。
表1 黃瓜霜霉病菌在低溫條件下冷藏不同時間后其致病力的變化

注a＝0.05；-未做接種實驗
權利要求
1.一種黃瓜霜霉病菌菌株的保存方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-6葉位上的健康離體葉片制成的葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液，然后將其在17-20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20-28h，再于17-20℃、濕度RH＞80％、光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，待葉碟背面產生黑色霉層后，置于-30℃至-80℃下密閉保存。
2.根據權利要求1所述的保存方法，其特征在于所述健康離體葉片為黃瓜植株第4葉位上的葉片。
3.根據權利要求1所述的保存方法，其特征在于所述葉碟的尺寸為φ1.2-2.0cm；黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1×104-1×105個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL。
4.根據權利要求3所述的保存方法，其特征在于所述葉碟的尺寸為φ1.5cm；黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1.0×104個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述背面滴加有黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養(yǎng)條件為先在19℃的黑暗條件下保濕培養(yǎng)24h，再于19℃、濕度RH大于80％、光暗交替條件下保濕培養(yǎng)。
6.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述保存溫度為-80℃。
7.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述孢子囊懸浮液的獲得方法為將病葉上的雜質和老熟的孢子囊洗凈后，在19℃下暗培養(yǎng)誘導產生新的孢子囊，再將新生孢子囊接種到無菌的健康離體黃瓜葉片背面，置于17-20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20-28h，再于17-20℃、濕度RH＞80％、光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，待葉片背面產生黑色霉層后，挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，并將單孢囊梗及其著生的孢子囊轉接到健康黃瓜第3-6葉位上的離體葉片背面在17-20℃下保濕培養(yǎng)，發(fā)病后洗脫病斑上的孢子囊配成孢子囊懸浮液。
8.根據權利要求7所述的保存方法，其特征在于所述新生孢子囊的接種方法為液滴法，接種時所用的新生孢子囊懸浮液的濃度為1.0×104個孢子囊/mL，接種體積為10μL。
9.根據權利要求7所述的保存方法，其特征在于所述背面接種有黃瓜霜霉病菌孢子囊的黃瓜葉片的培養(yǎng)條件為先在19℃的黑暗條件下保濕培養(yǎng)24h，再于19℃、RH＞80％、光暗交替條件下保濕培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃瓜霜霉病菌菌株的保存方法。該保存方法為在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3－6葉位上的健康離體葉片制成直徑為1.2－2.0cm的葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液，然后將其在17－20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20－28h，再于17－20℃、濕度RH大于80％、光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，待葉碟背面產生黑色霉層后，置于－30℃至－80℃下密閉保存。本發(fā)明根據黃瓜霜霉病菌在低溫下能存活的特點，提供了一種低溫冷藏條件下保存黃瓜霜霉病菌菌株的簡便、長久的方法，為黃瓜霜霉病的防治提供了極大方便，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N1/14GK1693447SQ200510070978
公開日2005年11月9日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權日2005年5月19日
發(fā)明者劉西莉, 朱書生, 李健強, 顧寶根, 袁善奎, 姜輝, 范潔茹 申請人:中國農業(yè)大學