專利名稱：一類能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)人肝細(xì)胞生長因子的重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中裸DNA基因治療范疇，是構(gòu)建含有人HGF cDNA以及少量人HGF內(nèi)含子的重組質(zhì)粒，使人HGF在真核細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。
二.
背景技術(shù)：
動(dòng)脈閉塞癥是一類嚴(yán)重威脅人類健康的血管疾病，主要包括下肢動(dòng)脈閉塞癥和冠狀動(dòng)脈閉塞癥，其臨床上的共同特點(diǎn)是都有動(dòng)脈供血不足的癥狀，具有疼痛難忍，病程長，治療難度大等特點(diǎn)，并嚴(yán)重影響患者的生活與工作。目前尚無較好的藥物治療方法，主要是借助外科手術(shù)治療，但經(jīng)過外科手術(shù)治療后的病人，并發(fā)癥多，預(yù)后差，最終可能發(fā)展為截肢或全身衰竭。因此，人們迫切需要研究治療動(dòng)脈閉塞癥的新方法及新藥物。
近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得基因治療在許多領(lǐng)域的應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)，使用基因治療來醫(yī)治缺血性疾病已逐步從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。通過合適的載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移促血管生長的基因促進(jìn)血管生成，可以在缺血局部開成側(cè)枝循環(huán)，建立“分子搭橋”機(jī)制，增加血供量，從而達(dá)到治療目的。
目前已知的能調(diào)節(jié)血管再生的因子有，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子與肝細(xì)胞生長因子(HGF)。肝細(xì)胞生長因子由間質(zhì)細(xì)胞合成分泌，最初認(rèn)為它的靶細(xì)胞為肝細(xì)胞，能刺激肝細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，近年來已發(fā)現(xiàn)它也具有很強(qiáng)的促進(jìn)新血管生成作用，作用比VEGF和成纖維細(xì)胞生長因子還強(qiáng)。
現(xiàn)已在臨床上試驗(yàn)用于治療血管閉塞癥的基因藥物有VEGF與HGF，使用的載體主要有腺病毒載體(AV)、腺相關(guān)病毒載體(AAV)和重組質(zhì)粒載體，在這三種載體中，AV與AAV使用較多，主要是由于它們的病毒特性，使得轉(zhuǎn)染率很高，易于攜帶基因進(jìn)入人體細(xì)胞，然而正是由于它們的病毒特性，使得基因治療的安全性成為倍受關(guān)注的問題。與AV與AAV相比，重組質(zhì)粒由于其無生命形式，除非進(jìn)入細(xì)胞，否則很快消失，使得基因治療的安全性大大提高，但是重組質(zhì)粒載體也有一個(gè)很大的缺點(diǎn)，就是在沒有外力的作用下，它進(jìn)入細(xì)胞的幾率很低，使得在臨床上要大量的給藥或者是用基因槍注射，才能起到治療效果。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過將人HGF的部分基因組內(nèi)含子序列引進(jìn)大量提高重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后的目的蛋白表達(dá)量，從而克服重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率低、導(dǎo)致治療效果差這一技術(shù)問題。
Nakamura等利用Northern Blot證實(shí)HGF mRNA的大小為6kb，并在1989年克隆出大鼠和人的HGF cDNA，人的HGF核苷酸序列中由一個(gè)2184核苷酸長的開放閱讀框架和3580核苷酸長的3個(gè)富含A-U序列的非編碼區(qū)組成。HGF的α和β亞基編碼在同一mRNA中，728個(gè)氨基酸的多肽由人的cDNA編碼，從甲硫氨酸開始的前31個(gè)氨基酸殘基是疏水的，這是一種典型的信號(hào)序列，β亞基的N端直接連在α亞基的C端，蛋白水解位點(diǎn)在α、β亞基之間的Arg-Val(第495和496殘基)。因此，成熟的HGF二聚體是經(jīng)蛋白酶從一個(gè)含728個(gè)氨基酸的原前體蛋白(Pre-Pro-Precursor)切割而來，α、β亞基分別有643個(gè)和234個(gè)氨基酸。HGF與纖溶酶原有38％的同源性，HGF的α鏈有4個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)，與纖溶酶原A鏈的5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)相似，每個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)由兩個(gè)外顯子編碼，并且外顯子一內(nèi)含子的排列也與纖溶酶原相似，這說明HGF基因和纖溶酶原基因可能由同一原祖基因復(fù)制的。另一方面，HGF的β鏈與各種絲氨酸蛋白酶和纖溶酶原的β鏈同源，但在絲氨酸水解酶活化位點(diǎn)的Ser和His在HGF的β鏈中被Glu和Tyr替換，所以HGF不顯示水解活性。最近，Seki等克隆并分析了人HGF基因，人HGF基因長大約70kb，含有18個(gè)外顯子，分別被17個(gè)內(nèi)含子隔開；第一個(gè)外顯子編碼5′端非翻譯區(qū)和信號(hào)肽，接下去的10個(gè)外顯子編碼具有4個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)的α鏈，每個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)由兩個(gè)被稱為Kringle內(nèi)含蛋白的外顯子編碼，α、β鏈之間的水解位點(diǎn)由第12個(gè)外顯子編碼，剩下6個(gè)外顯子編碼β鏈；最后第18個(gè)外顯子編碼β鏈C末端和一個(gè)3′端非編碼區(qū)。根據(jù)S1核酸酶圖譜和引物擴(kuò)增分析判斷，人HGF基因的主要轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始密碼上游76bp處，按新的基因定位法，確定了人HGF基因位于染色體7q 21.1上。
在常用的以HGF作為治療基因的基因藥物中，無論是使用AV、AAV或者重組質(zhì)粒，人們總是使用HGF的cDNA，沒有人使用基因組的DNA序列(包括內(nèi)含子序列)。這主要是因?yàn)榛蚪M序列太大，沒辦法構(gòu)建到載體上，且使得藥物更加不易轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。然而，眾所周知，真核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白表達(dá)一般是從基因組序列轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯而來。我們用重組載體把目的基因送入細(xì)胞后，要利用真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生目的蛋白，那么，該蛋白在基因組序列中的內(nèi)含子序列肯定有一部分在表達(dá)過程中起到重要作用?；谏鲜龅挠^點(diǎn)，我們?cè)诖罅康暮Y選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HGF基因組基因中的外顯子4、5間，8、9間和15、16間的部分內(nèi)含子序列對(duì)重組質(zhì)粒的表達(dá)起著很重要的作用。于是，我們用基因工程方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGK0、pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6(如圖1)，并將它們做了體外表達(dá)量比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)含子的質(zhì)粒pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6比只含有HGF cDNA的pGK0質(zhì)粒表達(dá)量高60-100倍，在體外試驗(yàn)中，pGK1、pGK2、pGK3局部注射兔后肢缺血模型中表現(xiàn)出很好的療效，遠(yuǎn)高于pGK0。
四.


圖1為pGKn的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，標(biāo)明了該重組質(zhì)粒的完整結(jié)構(gòu)。包括HGF表達(dá)啟動(dòng)序列CMV，HGF表達(dá)基因序列HGF0～6，BGH polyA表達(dá)終止序列，重組質(zhì)粒復(fù)制序列ori，重組質(zhì)粒篩選標(biāo)記序列kan R。
圖2用于構(gòu)建pGK0～6的HGF基因序列示意圖分別標(biāo)明內(nèi)含子插入的位置。
圖3瓊脂糖電泳表明pGK1重組質(zhì)粒的純化前后。
圖4pGK0～6分別注射到小鼠肌肉后，用Elisa KIT檢測(cè)到的HGF蛋白表達(dá)量的比較立柱圖，用于說明不同序列的HGF基因在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。
圖5pGK0、pGK1、pGK2、pGK3注射到兔后肢缺血模型后，新生血管數(shù)的比較。
五.
具體實(shí)施例方式
(一)、重組質(zhì)粒pGK的構(gòu)建首先，利用PCR方法，以pUC19為模板擴(kuò)增出0.7kb的ColE1序列。以Invitragen公司的pcDNA3.1為模板擴(kuò)增出1kb的DNA片段，該片段包含有細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)和牛生長激素終止子；以Navagen公司的pET-9a為模板擴(kuò)增出0.9kb的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(抗卡那霉素)，然后用T4連接酶將三個(gè)片段順序連接形成新的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pK。
然后，以PubMed中報(bào)道的HGF cDNA為模板，擴(kuò)增出HGF蛋白的cDNA全序列。用限制性內(nèi)切酶處理HGF片段與質(zhì)粒pK，再用T4連接酶將HGF片段順式插入到pK質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒pGK0。詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1，再以Genebank中報(bào)道的HGF基因組基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增出外顯子4和5、8和9、15和16之間的內(nèi)含子片段且經(jīng)過加工。
外顯子4和5間的內(nèi)含子片段留下距外顯子4的3’端下游1-300bp，距外顯子5的5’端上游1-1.2kb的兩段片段按原順序組合成內(nèi)含子X1；外顯子8和9間的內(nèi)含子片段留下距外顯子8的3’端下游1-300bp，距外顯子9的5’端上游1-1.2kb的兩段片段按原順序組合成內(nèi)含子X2；外顯子15和16間的內(nèi)含子距外顯子15的3’端下游1-300bp，距外顯子16的5’端上游1-1.2kp的兩段片段按原順序組合成為內(nèi)含子X3，三個(gè)片段長度從1.2kb到1.5kb。
將X1插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子4、5間得到pGK1。
將X2插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子8、9間得到pGK2。
將X3插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子15、16間得到pGK3。
將X1插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子4、5間且將X2插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子8、9間得到pGK4將X1插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子4、5間且將X3插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子15、16間得到pGK5將X2插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子8、9間且將X3插入到pGK0中的HGF cDNA外顯子15、16間得到pGK6。如圖2所示。
二).重組質(zhì)粒的生產(chǎn)與檢定重組質(zhì)粒pGK的生產(chǎn)包括工程菌的構(gòu)建、工程菌的發(fā)酵以及發(fā)酵產(chǎn)物的純化。首先，是將pGKx轉(zhuǎn)化到宿主菌DH5α中，篩選出質(zhì)粒產(chǎn)量最高的作為工程菌保存。將工程菌進(jìn)行發(fā)酵得到的菌液離心后收取菌泥并根據(jù)分子克隆的堿裂解方法來破碎細(xì)菌，然后5000rpm，20min離心后，上清經(jīng)過0.22um的濾膜過濾后，用分子量為30kD的中空纖維膜進(jìn)行超濾濃縮。然后進(jìn)行層析，首先是Sepharose 6Fast Flow凝膠過濾層析，平衡液是100mM Tris-HCl，pH7，10mM EDTA，2M硫酸銨，收集目標(biāo)峰。第二步是Plasmidselect親和層析，平衡液還是100mM Tris-HCl，pH7，10mM EDTA，2M硫酸銨，上一步的得到的樣品直接上樣，平衡后用洗脫液100mM Tris-HCl，pH7，10mM EDTA，2M硫酸銨，1.4M NaCl將目標(biāo)質(zhì)粒洗下。最后用分子量為30kD的中空纖維膜進(jìn)行超濾濃縮并換液為生理鹽水。電泳檢測(cè)得到的HGF質(zhì)粒的純度大于95％，超螺旋的含量大于90％，(如圖3)OD260與OD280的比值大于1.8，殘留的RNA和蛋白都檢測(cè)不到，說明質(zhì)粒的質(zhì)量達(dá)到了要求。
(三).pGK0～6HGF在小鼠體內(nèi)表達(dá)HGF蛋白量的測(cè)定與比較。如圖4。
1.動(dòng)物標(biāo)本的制定取4周齡雄性小鼠，飼養(yǎng)一周，淘汰一般狀況不好的小鼠。用乙醚麻醉小鼠，用胰島素注射器分別緩慢肌注pGK(0-6)(5-10/秒)藥物0.1ml(100ug/只)，針頭深度為3-5mm，注射完等5秒鐘再撥針，撥針后壓5秒。根據(jù)試驗(yàn)要求幾天后取肌肉組織(在兩側(cè)肌腱處切斷，取完整的一塊肌肉)和臟器。
2.HGF蛋白量的測(cè)定取肌肉組織和臟器，稱體重，并記下重量，裝在1.5ml試管(conical tube)內(nèi)，-80℃保存(液氮冰凍)。常溫下解凍，裝肌肉的試管內(nèi)放入500μl細(xì)胞緩沖液，用勻漿器制成勻漿(手動(dòng))，4℃放置16小時(shí)，4℃ 5000rpm離心30分鐘，取上清液，測(cè)上清液的總蛋白。按HGF測(cè)定盒說明測(cè)定上清液有HGF蛋白量(ELISA方法)，將測(cè)定出來的HGF蛋白量換算成每100mg肌肉內(nèi)的HGF蛋白量，換算方法如下100mg肌肉的HGF蛋白＝ELISA方法測(cè)得的蛋白量÷(100/肌肉體重mg×總蛋白量)ELISA方法測(cè)得的蛋白單位為pg/ml，應(yīng)換算成ng/ml，1000pg＝1ng
細(xì)胞緩沖液的組成-1M Tris-HCl(pH7.4)1.25ml(final 25mM)-1M NaCl 2.5ml(final 50mM)-Na Deoxycholate 0.25g(final 0.5％)脫氧膽酸鹽鈉-IGEPAL CA-6301ml(final 2％)-10％ SDS 1ml(final 0.2％)in 50ml 3次蒸溜水-100mM PMSF 0.5ml(final 1mM)PMSF是用之前當(dāng)場(chǎng)加入。
總蛋白的測(cè)定DC蛋白測(cè)定方法(Bio-Rad)所需物品分光光度計(jì)(750nm)、與分光光度計(jì)對(duì)應(yīng)的試管、13×100mm試管、試管架、吸管、攪拌器、DC蛋白測(cè)定盒。
HGF蛋白的測(cè)定原理本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人HGF單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的HGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人HGF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測(cè)OD值，HGF濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中HGF濃度。
試劑盒組成1.96孔微孔板一塊，已包被抗人HGF單抗。
2.樣品稀釋液一瓶3.第一抗體工作液一瓶4.酶標(biāo)抗體工作液一瓶5.底物稀釋液二瓶6.終止液一瓶7.洗滌液(20x)一瓶8.標(biāo)準(zhǔn)品(凍干粉，16000PG/ml)二管
9.OPD片三片10.坐標(biāo)紙一張準(zhǔn)備試劑與收集血樣1.洗滌液用重蒸水1∶20稀釋。
2.底物工作液配制使用前將OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液5ML。
3.標(biāo)準(zhǔn)品液配制使用前每管中加入蒸餾水200ul溶解后即可。
檢測(cè)程序1.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100ul，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100ul，混勻后用加樣器吸出100ul，移至第二孔。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100ul棄去，使之體積均為100ul。第八孔為空白對(duì)照。
2.加樣待測(cè)品孔每孔各加入待測(cè)樣品100ul。
3.將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 120分鐘。
4.洗板用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
5.每孔中加入第一抗體工作液50ul。
6.將反應(yīng)板置37℃ 60分鐘。
7.洗板同前。
8.每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。
9.將反應(yīng)板置37℃ 60分鐘。
10.洗板同前。
11.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應(yīng)5-10分鐘。
12.每孔加入1滴終止液混勻。
13.在492nm處測(cè)吸光值。
結(jié)果計(jì)算與判斷1.所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。
2.以標(biāo)準(zhǔn)品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0PG/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HGF含量。結(jié)論注射pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6的動(dòng)物肌肉內(nèi)檢測(cè)到的HGF量遠(yuǎn)大于注射pGK0的動(dòng)物，如圖4。
3.pGK0、pGK1、pGK2、pGK3在兔后肢缺血模型中生血管效果的比較，如圖5、6(1)兔后肢缺血模型的建立第一天用戊巴比妥鈉30mg/kg iv麻醉(或甲苯噻嗪5mg/kg，氯胺酮50mg/kg im)試驗(yàn)用兔，切除左側(cè)股動(dòng)脈(結(jié)扎股動(dòng)脈各分支，切除到腘動(dòng)脈、大隱動(dòng)脈分叉處)，然后肌注慶大霉素3mg/kg/日，3日；嗎啡0.3mg/日，10日。第十天時(shí)，分別注射pGK0、pGK1、pGK2、pGK3，注射點(diǎn)為內(nèi)收肌2點(diǎn)，半膜肌1點(diǎn)，股內(nèi)肌1點(diǎn)。第四十天時(shí)評(píng)價(jià)藥效。
(2)兔下肢缺血模型的治療效果療效觀察方法-1選擇性髂內(nèi)動(dòng)脈造影術(shù)(Pu方法)1.從右側(cè)頸動(dòng)脈插管到左側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈(3F Terumo，Japan)2.注入造影劑5ml，1ml/秒3.照相血管的計(jì)數(shù)取注入造影劑后第4秒照的圖片，在大腿中間劃一條與大腿垂直的線，數(shù)經(jīng)過這條線的所有血管，重復(fù)數(shù)兩次，取平均值。
療效觀察方法-2組織學(xué)圖片檢查取兔子半膜肌、內(nèi)收肌和腓腸肌，用液化淡冰凍，做組織切片，再用H.E.染色后在顯微鏡下觀察，數(shù)1000個(gè)肌細(xì)胞內(nèi)的毛細(xì)血管數(shù)。
總結(jié)注射pGK1、pGK2、pGK3的動(dòng)物在肌肉內(nèi)產(chǎn)生的新血管數(shù)量大于注射pGK0的動(dòng)物，如圖5。
權(quán)利要求
1.一類能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)肝細(xì)胞生長因子的重組質(zhì)粒，其特征為用于構(gòu)建的人HGFcDNA中含有部分人HGF基因組序列中的內(nèi)含子序列。
2.權(quán)利要求1中所述的質(zhì)粒中HGF序列中所含的內(nèi)含子為人HGF基因組序列中外顯子4、5間的部分序列。
3.權(quán)利要求1中所述的質(zhì)粒中人HGF序列中所含的內(nèi)含子為人HGF基因組序列中外顯子8、9間的部分序列。
4.權(quán)利要求1中所述的質(zhì)粒中人HGF序列中所含的內(nèi)含子為人HGF基因組序列中外顯子15、16間的部分序列。
5.權(quán)利要求1中所述的重組質(zhì)粒中，可以同時(shí)保留權(quán)利要求2、3、4中所述的部分內(nèi)含子序列的兩個(gè)。
6.權(quán)利要求2、3、4、5中所述的質(zhì)粒中人HGF序列中所含的內(nèi)含子序列，其長度在300-15000bp間，且其核酸序列能與HGF基因組核酸序列中相應(yīng)的內(nèi)含子序列，在強(qiáng)烈的反應(yīng)條件下能雜交。
7.權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，主要用于臨床上肢體缺血性疾病以及缺血性心臟病。
8.權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，在臨床上使用時(shí)，僅需要裸DNA局部肌肉直接注射就能達(dá)到治療效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的裸DNA基因治療范疇。本發(fā)明在構(gòu)建人肝細(xì)胞生長因子(HGF)重組質(zhì)粒時(shí)，將HGF基因組DNA序列中的部分內(nèi)含子序列引入進(jìn)來。使得該重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)量與只是cDNA序列的重組質(zhì)粒相比，大大提高(約100倍)。從而克服了當(dāng)前裸DNA基因治療轉(zhuǎn)染率低而導(dǎo)致治療效果差的問題。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1876818SQ200510074858
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者許松山, 聶李亞, 馬素永, 文美玉 申請(qǐng)人:北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司