專利名稱：使用木糖利用基因表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)l—氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過戊糖發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，更具體地涉及使用木糖利用基因表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌，以阿拉伯糖和/或木糖與葡萄糖一起的混合物作為碳源進(jìn)行發(fā)酵從而生產(chǎn)L氨基酸的方法。在商業(yè)上生產(chǎn)L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和L-色氨酸時(shí)，可以使用廉價(jià)的碳源，其包括來自纖維素生物質(zhì)(cellulosic biomass)的半纖維素片段的己糖和戊糖混合物。
背景技術(shù)：
一般的，L-氨基酸利用不同微生物菌株通過發(fā)酵方法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。該方法中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常包括充足量的各種碳源和氮源。
常規(guī)地，各種碳水化合物如己糖、戊糖、丙糖；各種有機(jī)酸和醇被用作碳源。己糖包括葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、半乳糖等等。戊糖包括阿拉伯糖、木糖、核糖等等。然而，上述碳水化合物以及其它現(xiàn)在用于工業(yè)的常規(guī)碳源，如糖漿、谷物、糖蔗、淀粉、其水解產(chǎn)物等均相當(dāng)昂貴。因此，需要找出更加廉價(jià)的替代碳源用于L-氨基酸的生產(chǎn)。
纖維素生物質(zhì)是一種合適的用于L-氨基酸生產(chǎn)的原料，因?yàn)槠湟子诘玫讲⑶冶忍妓衔?、谷物、糖蔗或其它碳源便宜。在纖維素生物質(zhì)中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的常規(guī)量為約40-60％的纖維素、20-40％的半纖維素、10-25％的木質(zhì)素和10％的其它成分。纖維素成分由己糖，通常是葡萄糖的聚合物組成。半纖維素成分主要由戊糖，包括木糖和阿拉伯糖組成。各種纖維素生物質(zhì)原料的組成如表1所示(http//www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html)。
表1

有關(guān)超過150種生物質(zhì)(biomass)樣品成分更加詳細(xì)的信息匯總于“生物質(zhì)原材料的組成與性質(zhì)數(shù)據(jù)庫”(http//www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi)中。
近來希望開發(fā)一種能夠有效的將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵原材料，通常為碳水化合物的混合物的工業(yè)方法。因此，近期希望增加利用可再生的能量來源如纖維素和半纖維素生產(chǎn)有用的化合物(AristidouA.，Pentila.M.，Curr.Opin，Biotech nol，2000，Apr.，11:2，187-198)。然而，絕大部分已發(fā)表的文章和專利，或?qū)＠暾?qǐng)，記載的是借助生物催化劑(細(xì)菌和酵母)利用纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇，其被期望成為有效的代用燃料。該方法包括使用不同的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)改良菌株(Deanda K.等，Appl.Environ.Microbiol.，1996 Dec.，62:12，4465-70；Mohagheghi A.等，Appl.Biochem.Biotechnol.，2002，98-100:885-98；Lawford H.G.，RousseauJD.，Appl.Biochem.Biotechnol，2002，98-100:429-48；PCT申請(qǐng)WO95/28476，WO98/50524)、大腸桿菌(Escherichia coli)改良菌株(Dien B.S.等，Appl.Biochem.Biotechnol，2000，84-86:181-96；Nichols N.N.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001 Jul，56:1-2，120-5；美國專利5,000,000)進(jìn)行纖維素生物質(zhì)的發(fā)酵。利用熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)對(duì)來自半纖維素糖的木糖進(jìn)行發(fā)酵可生產(chǎn)木糖醇(Walthers T.等，Appl.Biochem.Biotechnol.，2001，91-93:423-35)。使用重組的大腸桿菌(Escherichia coli)菌株對(duì)阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和其組合物進(jìn)行發(fā)酵可生產(chǎn)1，2-丙二醇(美國專利6,303,352)。還有報(bào)導(dǎo)通過使用大腸桿菌菌株對(duì)葡萄糖/木糖/阿拉伯糖混合物進(jìn)行發(fā)酵可獲得3-脫氫莽草酸。與單獨(dú)采用木糖或葡萄糖作為碳源相比，當(dāng)使用葡萄糖/木糖/阿拉伯糖混合物作為碳源時(shí)所獲得的3-脫氫莽草酸的濃度和產(chǎn)量最高(KaiLi and J.W.Frost，Biotechnol.Prog.，1999，15，876-883)。
有報(bào)導(dǎo)稱大腸桿菌可以利用戊糖如L-阿拉伯糖和D-木糖(Escherichiacoli and Salmonella，Second Edition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASMPress，Washingong D.C.，1996)。L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞是通過兩種誘導(dǎo)型系統(tǒng)(1)araE基因編碼的低親合力通透酶(Km約0.1mM)，和(2)araFG操縱子編碼的高親合力(Km為1到3μM)系統(tǒng)。araF基因編碼具有趨化受體功能的周圍胞質(zhì)結(jié)合蛋白(306個(gè)氨基酸)，araG基因座編碼內(nèi)膜蛋白。糖的代謝是通過araBAD操縱子編碼的-組酶異構(gòu)酶(araA基因編碼)，其可逆的將醛醣轉(zhuǎn)化為L-核酮糖；激酶(araB基因編碼)，其將酮糖磷酸化為L-核酮糖5-磷酸鹽；和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(araD基因編碼)，其催化D-木糖-5-磷酸鹽的形成(Escherichia coli and Salmonella，SecondEdition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1996)。
大部分大腸桿菌菌株可在D-木糖中生長，但K-12菌株需要變異后才可在該化合物中生長。該戊糖的利用是通過誘導(dǎo)型且分解代謝物抑制的途徑，其中包括利用兩種誘導(dǎo)型通透酶(對(duì)D-核糖或D-阿拉伯糖無活性)轉(zhuǎn)運(yùn)通過胞質(zhì)膜，異構(gòu)化為D-木酮糖，以及ATP依賴型磷酸化戊酮糖產(chǎn)生D-木酮糖5-磷酸鹽。高親合力(Km為0.3到3μM)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)依賴于周圍胞質(zhì)結(jié)合蛋白(37,000Da)并且可能由高能化合物驅(qū)動(dòng)。低親合力(Km約170μM)系統(tǒng)由質(zhì)子間原動(dòng)力激活。該D-木糖-質(zhì)子-同向轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由xylE基因編碼。對(duì)應(yīng)于D-木糖利用的主要基因群為xylAB(RT)。xylA基因編碼異構(gòu)酶(54,000Da)，xylB基因編碼激酶(52,000Da)。操縱子包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其中一個(gè)插入到xylB開放讀碼框上游。由于低親合力通透酶對(duì)應(yīng)于不連接的xylE，xylT基因座，也稱為xylF(xylFGHR)，可能編碼高親合力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)并且因此含有至少兩個(gè)基因(一個(gè)編碼周圍胞質(zhì)蛋白，一個(gè)編碼完整的膜蛋白)(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor inChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1996)。該xylFGHR基因編碼木糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中xylF基因編碼推定的木糖結(jié)合蛋白，xylG基因編碼推定的ATP結(jié)合蛋白，xylH基因編碼推定的膜成分，xylR基因編碼木糖轉(zhuǎn)錄激活蛋白。
導(dǎo)入上述編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，加上轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的E.coli基因，可使微生物，如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，將阿拉伯糖和木糖代謝為乙醇(WO/9528476，WO98/50524)。相反，編碼乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDH)的發(fā)酵單胞菌基因也可用于大腸桿菌菌株的乙醇生產(chǎn)(Dien B.S.等，Appl.Biochem.Biotechnol，2000，84-86:181-96；美國專利5,000,000)。
本發(fā)明的作者以前公開了一種通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-氨基酸，如L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸的方法(Russian patent application 2003105269)。
然而，至今沒有關(guān)于木糖利用基因，如xylABFGHR基因座的基因表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌，或使用這些基因從己糖和戊糖混合物中生產(chǎn)L-氨基酸的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，提供木糖利用基因表達(dá)增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)菌，并且提供使用該細(xì)菌從已糖，如葡萄糖，和戊糖，如木糖或阿拉伯糖的混合物中生產(chǎn)L-氨基酸的方法。從纖維素生物質(zhì)中獲得的發(fā)酵原材料可用作培養(yǎng)基的碳源。該目的的實(shí)現(xiàn)是基于發(fā)現(xiàn)克隆到低拷貝載體上的xylABFGHR基因座可增強(qiáng)L-氨基酸，例如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和L-色氨酸的產(chǎn)量。所使用的微生物能夠在發(fā)酵原材料中生長并且有效生產(chǎn)L-氨基酸。該用作碳源的發(fā)酵原材料由木糖和阿拉伯糖以及葡萄糖組成。L-氨基酸生產(chǎn)菌株的示例為大腸桿菌菌株。由此完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的細(xì)菌，其具有活性增強(qiáng)的任意木糖利用酶。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中該細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中所述木糖利用酶活性通過增加xylABFGHR基因座的表達(dá)量而增強(qiáng)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中所述木糖利用酶活性通過增加xylABFGHR基因座的拷貝數(shù)或修飾基因的表達(dá)調(diào)控序列以增強(qiáng)基因的表達(dá)而提高。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中拷貝數(shù)通過用含有xylABFGHR基因座的低拷貝載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌而增加。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述細(xì)菌，其中xylABFGHR基因座源自屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其包括在含有葡萄糖和戊糖混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌，以及從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中戊糖是阿拉伯糖和木糖。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中糖的混合物是從纖維素生物質(zhì)中獲得的糖的原材料混合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-組氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中所述細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-組氨酸生物合成相關(guān)基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中所述細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-蘇氨酸生物合成相關(guān)基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-賴氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中所述細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-賴氨酸生物合成相關(guān)基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-谷氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中所述細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-谷氨酸生物合成相關(guān)基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-色氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述方法，其中所述細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-色氨酸生物合成相關(guān)基因。
該生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-組氨酸。而且，該生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-蘇氨酸。而且，該生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-賴氨酸。而且，該生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-谷氨酸。而且，該生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括通過發(fā)酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產(chǎn)L-色氨酸。用作發(fā)酵原材料的上述葡萄糖和戊糖混合物可以從未充分利用的植物生物質(zhì)資源，如纖維素生物質(zhì)，優(yōu)選纖維素的水解產(chǎn)物中獲得。
附圖簡述

圖1顯示大腸桿菌菌株MG1655的染色體上xylABFGHR基因座的結(jié)構(gòu)。圖中箭頭指示PCR引物的位置。
優(yōu)選實(shí)施方案的說明本發(fā)明中，“L-氨基酸生產(chǎn)菌”表示一種細(xì)菌，其在本發(fā)明所述細(xì)菌培養(yǎng)于培養(yǎng)基中時(shí)，能夠引起培養(yǎng)基中L-氨基酸的累積。通過繁育可以賦予或增強(qiáng)L-氨基酸的生產(chǎn)能力。在此術(shù)語“L-氨基酸生產(chǎn)菌”也表示與野生型或親代菌株相比能夠產(chǎn)生并且在培養(yǎng)基中累積更多L-氨基酸的細(xì)菌，優(yōu)選表示該微生物能夠產(chǎn)生并且在培養(yǎng)基中累積不少于0.5g/L，更優(yōu)選不少于1.0g/L的目的L-氨基酸。“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽、L-氨基乙酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。
腸桿菌科(enterobacteriaceae)家族包括屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐氏桿菌屬(Erwinia)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、Photorhabdus、普魯維登斯桿菌(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、志賀菌屬(Shigella)、摩根菌屬(Morganella)、耶爾森菌屬(Yersinia)等屬的細(xì)菌。具體地，可以使用根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中的分類法(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)分類于腸桿菌科中的細(xì)菌。優(yōu)選埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌。
術(shù)語“埃希氏菌屬細(xì)菌”表示該細(xì)菌根據(jù)微生物技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知的分類法分類于埃希氏菌屬。用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌的例子包括，但不限于大腸桿菌(E.coli)。
能夠用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌未作特別限制，但是例如，Neidhardt，F(xiàn).C.等所記述的細(xì)菌(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor inChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1208，表1)包含于本發(fā)明中。術(shù)語“泛菌屬細(xì)菌”表示該細(xì)菌根據(jù)微生物技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知的分類法分類于泛菌屬。根據(jù)對(duì)16S rRNA等的核苷酸序列分析，一些成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的種現(xiàn)在重新分類到成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis、Pantoea Stewartii等中。
術(shù)語“木糖利用酶增強(qiáng)的活性”表示每個(gè)細(xì)胞中酶的活性高于未修飾的菌株，如野生型菌株。例子包括其中每個(gè)細(xì)胞中酶分子數(shù)量增加和每個(gè)酶分子的特異性活性增加等等。基因編碼蛋白數(shù)量的測(cè)量可以采用已知方法，包括SDS-PAGE后進(jìn)行免疫印跡分析(Western blotting analysis)等。此外，用作對(duì)照的野生型菌株包括，例如大腸桿菌K-12。作為增強(qiáng)木糖利用酶細(xì)胞內(nèi)活性的結(jié)果，可以觀察到L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸在培養(yǎng)基中累積。
“木糖利用酶”包括木糖轉(zhuǎn)運(yùn)、木糖異構(gòu)和木糖磷酸化的酶以及調(diào)控蛋白。該酶包括木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和木糖轉(zhuǎn)錄激活蛋白。木糖異構(gòu)酶催化D-木糖到D-木酮糖的異構(gòu)反應(yīng)。木酮糖激酶催化D-木酮糖使用ATP生成D-木酮糖-5-磷酸鹽和ADP的磷酸化反應(yīng)。木糖利用酶，如木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶活性的存在分別取決于相應(yīng)木糖異構(gòu)酶陰性或木酮糖激酶陰性大腸桿菌突變體的互補(bǔ)作用。
術(shù)語“埃希氏菌屬細(xì)菌”表示該細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知的分類法分類于埃希氏菌屬。用于本發(fā)明的埃希氏菌屬微生物的一個(gè)實(shí)例是大腸桿菌(E.coli)。
術(shù)語“增加基因表達(dá)量”表示基因的表達(dá)量高于未修飾的菌株，如野生型菌株。這種修飾的例子包括增加每個(gè)細(xì)胞中表達(dá)基因的數(shù)量，增加基因的表達(dá)水平等。表達(dá)基因拷貝數(shù)的定量可以通過，例如限制性酶切染色體DNA后用基于基因序列的探針進(jìn)行DNA印跡分析(Sourthn blotting)，熒光原位雜交(FISH)等進(jìn)行測(cè)量?；虮磉_(dá)水平可以采用多種不同方法，包括RNA印跡分析(Northern blotting)，定量RT-PCT等測(cè)定。此外，可用作對(duì)照的野生型菌株包括，例如大腸桿菌K-12。作為增強(qiáng)木糖利用酶細(xì)胞內(nèi)活性的結(jié)果，可以觀察到L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸在含有戊糖，如木糖的培養(yǎng)基中累積。
細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)木糖利用酶活性的增強(qiáng)能夠通過增加所述酶編碼基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。木糖利用有關(guān)的基因包括任何得自腸桿菌科家族細(xì)菌的基因，以及得自其它細(xì)菌如嗜熱桿菌(thermophilic Bacillus sp)的基因(Biochem，Mol.Bio.Int.，1996，39(5)，1049-1062)。優(yōu)選得自埃希氏菌屬細(xì)菌的基因。
大腸桿菌木糖異構(gòu)酶(EC編號(hào)5.3.1.5)的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylA(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3727072到3728394，gi16131436)。木酮糖激酶(EC編號(hào)2.7.1.17)的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylB(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3725546到3727000，gi16131435)。木糖結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylF(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3728760到3729752，gi16131437)。推定的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylG(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3729830到3731371，gi16131438)。ABC類木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶組分的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylH(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3731349到3732530，gi16131439)。xyl操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的編碼基因是已知的并且標(biāo)明為xylR(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3732608到3733786，gi16131440)。因此，上述基因可以通過使用基于基因核苷酸序列的引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng)；參考White，T.J.等.，TrendsGenet.，5,185(1989))而獲得。
其它微生物的木糖利用酶編碼基因可以類似的獲得。
編碼下述蛋白(A)或(B)的DNA是大腸桿菌xylA基因的范例(A)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白；或(B)具有在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列，且具有木糖異構(gòu)酶活性的蛋白。
編碼下述蛋白(C)或(D)的DNA是大腸桿菌xylB基因的范例(C)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白；或(D)具有在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列，且具有木酮糖激酶活性的蛋白。
編碼下述蛋白(E)或(F)的DNA是大腸桿菌xylF基因的范例
(E)具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的蛋白；或(F)具有在SEQ ID NO6所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列的蛋白，其具有當(dāng)L-氨基酸生產(chǎn)菌中蛋白量與xylAB和xylGHR基因編碼的蛋白量增加時(shí)，增加培養(yǎng)基中L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(G)或(H)的DNA是大腸桿菌xylG基因的范例(G)具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的蛋白；或(H)具有在SEQ ID NO8所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列的蛋白，其具有當(dāng)L-氨基酸生產(chǎn)菌中蛋白量與xylAB和xylFHR基因編碼的蛋白量增加時(shí)，增加培養(yǎng)基中L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(I)或(J)的DNA是大腸桿菌xylH基因的范例(I)具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白；或(J)具有在SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列的蛋白，其具有當(dāng)L-氨基酸生產(chǎn)菌中蛋白量與xylAB和xylFGR基因編碼的蛋白量增加時(shí)，增加培養(yǎng)基中L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(K)或(L)的DNA是大腸桿菌xylR基因的范例；(K)具有SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白；或(L)具有在SEQ ID NO12所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸后所得的氨基酸序列的蛋白，其具有在當(dāng)L-氨基酸生產(chǎn)菌中蛋白量與xylAB和xylFGH基因編碼的蛋白量增加時(shí)，增加培養(yǎng)基中L-氨基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼木糖異構(gòu)酶的DNA包括編碼在蛋白(A)中一個(gè)或多個(gè)位置缺失、替換、插入或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，但不失去蛋白活性的蛋白的DNA。雖然“幾個(gè)”氨基酸差異的數(shù)量依賴于在蛋白三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和類型，對(duì)于蛋白(A)其可以為2到50，優(yōu)選2到20，更優(yōu)選2到10。這是因?yàn)橐恍┌被嵯嗷ラg具有高同源性這些氨基酸的取代不會(huì)對(duì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)和活性造成大的影響。因此，蛋白(B)相對(duì)于木糖異構(gòu)酶的整個(gè)氨基酸序列具有不少于30到50％，優(yōu)選50到70％，更優(yōu)選70-90％，還更優(yōu)選超過90％和最優(yōu)選超過95％同源性，并且具有木糖異構(gòu)酶活性。同樣的方法和同源性判斷可以應(yīng)用于其它蛋白(C)、(E)、(G)、(I)和(K)。
為計(jì)算蛋白或DNA的同源性水平，可以使用幾種計(jì)算方法，如BLAST搜索、FASTA搜索和ClustalW。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是程序blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx所使用的啟發(fā)式搜索算法；這些程序采用Karlin、Samuel和Stephen F.Altschul的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法衡量其搜索結(jié)果的顯著性(“Methodsfor assessing the statistical significance of molecular sequence features by usinggeneral scoring schemes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，872264-68；“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，905873-7)。FASTA搜索方法由W.R.Pearson描述(“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA”，Methods in Enzymology，1990 18363-98)。ClustalW方法由ThompsonJ.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述(“CLUSTAL Wimproving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight martrix choice”Nucleic Acids Res.1994，224673-4680)。
對(duì)(A)中定義的蛋白的變化，例如上述那些，通常是可以保持蛋白活性的保守變化。替換變化包括變化中其氨基酸序列內(nèi)至少一個(gè)殘基被移除并且由不同的殘基插入到它的位置?？梢蕴鎿Q上述蛋白中原始氨基酸，并且被認(rèn)為是保守替換的氨基酸例子包括Ala替換為ser或thr；arg替換為gln、his或lys；asn替換為glu、gln、lys、his、asp；asp替換為asn、glu或gln；cys替換為ser或ala；gln替換為asn、glu、lys、his、asp或arg；glu替換為ash、gln、lys或asp；gly替換為pro；his替換為asn、lys、gln、arg、tyr；ile替換為leu、met、val、phe；leu替換為ile、met、val、phe；lys替換為ash、glu、gln、his、arg；met替換為ile、leu、val、phe；phe替換為trp、tyr、met、ile或leu；ser替換為thr、ala；thr替換為ser或ala；trp替換為phe、tyr；tyr替換為his、phe或trp；以及val替換為met、ile、leu。
獲得與(A)中定義的蛋白基本上相同的蛋白的編碼DNA可以采用，例如，通過點(diǎn)突變對(duì)編碼(A)中定義的蛋白的核苷酸序列進(jìn)行修飾，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、替換、插入或增加。該修飾的DNA可以通過使用產(chǎn)生突變的試劑或條件處理的常規(guī)方法獲得。該處理包括用羥胺處理本發(fā)明中蛋白編碼DNA，或者用UV輻射或試劑，如N-甲基-N’-氮-N-亞硝基胍或亞硝酸處理含有DNA的細(xì)菌。
編碼木糖異構(gòu)酶的DNA包括由于天然的多樣性所導(dǎo)致的在埃希氏菌屬細(xì)菌不同菌株中發(fā)現(xiàn)的變異體。通過分離在嚴(yán)格條件下與xylA基因或該基因一部分雜交，且編碼具有木糖異構(gòu)酶活性蛋白的DNA可獲得編碼該變異體的DNA。在此術(shù)語“嚴(yán)格條件”包括條件，在該條件下可形成所謂特異性雜交，同時(shí)不形成非特異性雜交。例如，嚴(yán)格條件包括條件，在該條件下，具有高同源性的DNA，例如相互間同源性不少于70％，優(yōu)選不少于80％，更優(yōu)選不少于90％，最優(yōu)選不少于95％的DNA發(fā)生雜交?；蛘?，作為嚴(yán)格條件例子的條件包括Southern雜交洗脫的常規(guī)條件，例如60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS。洗脫過程的持續(xù)時(shí)間取決于用于印跡的膜的類型以及制造商推薦的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間。例如，在嚴(yán)格條件下HybondTMN+尼龍膜(Amersham)的推薦洗脫持續(xù)時(shí)間為15分鐘。優(yōu)選地，洗脫可以進(jìn)行2到3次。核苷酸序列SEQ ID NO1的部分序列也可用作變異體編碼DNA的探針并且與xylA基因雜交。該探針可以通過PCR制備，其中以根據(jù)SEQ ID NO1核苷酸序列生產(chǎn)的寡核苷酸作為引物，以含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA片段為模板。當(dāng)以長度約為300bp的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的洗脫條件可以為，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS。
獲得編碼與其它木糖利用酶基本上相同蛋白的DNA可以采用類似于上述獲得木糖異構(gòu)酶的方法。
用編碼蛋白的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌表示通過，例如常規(guī)方法將DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞中以增加編碼本發(fā)明所述蛋白的基因的表達(dá)并且增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞中蛋白的活性。
本發(fā)明細(xì)菌還包括一種細(xì)菌，該菌中本發(fā)明蛋白的活性通過用編碼(A)或(B)、(C)或(D)、(E)或(F)、(G)或(H)、(I)或(J)、(K)或(L)中定義的蛋白的DNA轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌，或通過改變細(xì)菌染色體中所述DNA的表達(dá)調(diào)控序列而得到增強(qiáng)。
增強(qiáng)基因表達(dá)的方法包括增加基因拷貝數(shù)。將基因?qū)肽軌蛟诎ＯＪ暇鷮偌?xì)菌中發(fā)揮功能的載體可增加基因的拷貝數(shù)。為該目的，優(yōu)選使用多拷貝載體。優(yōu)選地，使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子為pSC101、pMW118、pMW119等。術(shù)語“低拷貝載體”用于表示在每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)最多為5個(gè)的載體。轉(zhuǎn)化的方法包括任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的的方法。例如，用氯化鈣處理受體細(xì)胞以增加細(xì)胞對(duì)DNA的滲透性方法被報(bào)導(dǎo)可用于大腸桿菌K-12中(Mandel，M.And Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))并且可在此使用。
通過，例如，同源重組、Mu整合等方法將基因的多重拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體中也可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。例如，一輪Mu整合可以將最多3個(gè)拷貝的基因?qū)爰?xì)菌染色體中。
另一方面，將控制本發(fā)明DNA的天然啟動(dòng)子更換為更有效的啟動(dòng)子也可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。啟動(dòng)子的強(qiáng)度用RNA合成起始作用的頻率衡量。Deuschle，U.，Kammerer，W.，Gentz，R.，Bujard，H描述了測(cè)量啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法和有效啟動(dòng)子的例子(Promoters in Escherichia colia hierarchy of in vivo strengthindicates alternate structures.EMBO J.1986，5，2987-2994)。例如，PR啟動(dòng)子是公知的有效的組成型啟動(dòng)子。其它公知的強(qiáng)啟動(dòng)子是λ噬菌體的PL啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子等。
通過將更有效的Shine-Dalgarno序列(SD序列)導(dǎo)入本發(fā)明的DNA以替代天然SD序列可以實(shí)現(xiàn)翻譯的增強(qiáng)。SD序列是mRNA起始密碼子的上游區(qū)域，其與核糖體的16S RNA相互作用(Shine J.and DalgamoL.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，4，1342-6)。
采用更有效的啟動(dòng)子可以與增加基因拷貝數(shù)的方法結(jié)合使用。
或者，通過，例如，向啟動(dòng)子中導(dǎo)入突變可以增強(qiáng)啟動(dòng)子，從而提高位于啟動(dòng)子下游的基因的表達(dá)水平。此外，已知替換位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子間的幾個(gè)氨基酸，尤其是，起始密碼子上游緊鄰的序列極大地影響mRNA的可譯性。例如，發(fā)現(xiàn)20倍范圍的表達(dá)水平依賴于起始密碼子前面三個(gè)核苷酸的性質(zhì)(Gold等.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。
制備染色體DNA、雜交、PCR、制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA，轉(zhuǎn)化、選擇寡核苷酸作為引物等的方法可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法。這些方法記載于Sambrook，J.，and Russell D.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Third Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等。
通過將前述DNA導(dǎo)入本身具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的細(xì)菌可獲得本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘撸ㄟ^將生產(chǎn)L-氨基酸的能力給予已經(jīng)含有該DNA的細(xì)菌可獲得本發(fā)明的細(xì)菌。
埃希氏菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)菌的例子如下所述。
L-組氨酸生產(chǎn)菌埃希氏菌屬的具有L-組氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌的例子包括埃希氏菌屬的L-組氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli菌株24(VKPM B-5945，RU2003677)；E.coli菌株80(VKPM B-7270，RU2119536)；Ecoli菌株NRRL B-12116-B12121(US4388405)；E.coli菌株H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(US6344347)；E.coli菌株H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087)；E.coli菌株AI80/pFM201(US6258554)等。
優(yōu)選地，本發(fā)明細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以增強(qiáng)L-組氨酸生產(chǎn)菌中組氨酸操縱子基因的表達(dá)，其優(yōu)選包括編碼ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的hisG基因，使對(duì)L-組氨酸的反饋抑制靈敏度降低(俄羅斯專利2003677和2119536)。
L-蘇氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-蘇氨酸生產(chǎn)茵的親代菌株的例子包括，但是不限于，埃希氏菌屬的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli菌株TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國專利5,175,107，美國專利5,705,371)，E.coli菌株NRRL-21593(美國專利5,939,307)，E.coli菌株FERM BP-3756(美國專利5,474,918)，E.coli菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520(美國專利5,376,538)，E.coli菌株MG442(Gusyatiner等，Genetika(in Russian)，14，947-956(1978))，E.coli菌株VL643和VL2055(EP 1148811A)等。
菌株TDH-6缺少thrC基因，以及蔗糖同化能力，并且ilvA基因具有滲漏突變。該菌株在rhtA基因也存在變異，其導(dǎo)致對(duì)高濃度蘇氨酸或高絲氨酸具有抗性。菌株B-3996含有質(zhì)粒pVIC40，其是通過將含有變異的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到RSF1010衍生載體中而獲得。變異的thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其基本對(duì)蘇氨酸的反饋抑制不敏感。菌株B-3996于1987年11月19日保藏在全聯(lián)盟抗菌素類科學(xué)中心(Nagatinskaya Street 3-A，117105Moscow，Russian Federation)，編號(hào)為RIA1867。該菌株還于1987年4月7日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)(Dorozhny proezd.l，Moscow117545，Russian Federation)，編號(hào)為B-3996，分類命名為Escherichia coli Tur 6\p VIC40。
優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌進(jìn)一步修飾以增強(qiáng)下述一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)-變異的thrA基因，其編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I；-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；-rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白；-asd基因，其編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；以及-aspC基因，其編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經(jīng)公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號(hào)337到2799，gi49175990)。該thrA基因位于E.coli K-12染色體上thrL和thrB基因之間。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號(hào)2801到3733，gi49175990)。該thrB基因位于Ecoli K-12染色體上thrA和thrC.基因之間。編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thtC基因已經(jīng)公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號(hào)3734到5020，gi49175990)。該thrB基因位于E.coli K-12染色體上thrB基因和yaaX開放讀碼框之間。所有這三種基因共同作用成為一個(gè)獨(dú)立的蘇氨酸操縱子。
編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的變異的thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作為一個(gè)操縱子從公知質(zhì)粒pVIC40中獲得，該質(zhì)粒存在于大腸桿菌蘇氨酸生產(chǎn)菌株VKPM B-3996中。質(zhì)粒pVIC40詳細(xì)記載于美國專利5,705,371中。
rhtA基因位于大腸桿菌染色體上18min靠近glnHPQ操縱子，其編碼谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組分，該rhtA基因與ORF1(ybiF基因，GenBank accession numberAAA218541的序列中編號(hào)764到1651，gi440181)一致，位于pexB與ompX基因之間。表達(dá)ORF1編碼蛋白的單元表示為rhtA(rht高絲氨酸和蘇氨酸抗性)基因。而且，有發(fā)現(xiàn)表明rhtA23基因的變異相對(duì)ATG起始密碼子為位置-1上的A換G的替換(ABSTRACTS of 17thInternational Congress of Biochemistryand Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the AmericanSociety for Biochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstruct No.457，EP1013765A)。
大腸桿菌的asd基因已經(jīng)公開(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)3572511到3571408，gi16131307)，并且能夠通過使用根據(jù)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng)；參考White，TJ.等，TrendsGenet.，5，185(1989))而獲得。其它微生物的asd基因可以用類似的方法獲得。
此外，大腸桿菌的aspC基因已經(jīng)公開(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號(hào)983742到984932，gi16128895)，并且能夠通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因可以用類似的方法獲得。
L-索賴氨酸生產(chǎn)菌埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的例子包括具有L-賴氨酸類似物抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制埃希氏菌屬細(xì)菌的生長，但是當(dāng)L-賴氨酸存在于培養(yǎng)基中時(shí)，這種抑制被完全或部分脫敏。L-賴氨酸類似物的例子包括，但不限于，溶菌素、賴氨酸氧肟酸鹽、S-(2-氨基乙醇)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基賴氨酸、a-氯己內(nèi)酰胺等。對(duì)賴氨酸類似物具有抗性的突變體可以通過對(duì)埃希氏菌屬細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的人工誘變處理而獲得。具體的可用于生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株的例子包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；見U.S.Patent 4,346,170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制被脫敏。
菌株WC196可以用作大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌。該菌株的育種是賦予衍生自大腸桿菌K-12的菌株W3110AEC抗性。獲得的菌株命名為大腸桿菌AJ13069菌株，并且于1994年12月6日保藏于生物科學(xué)和人類技術(shù)國家研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(現(xiàn)在的高級(jí)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)國家研究所，國際專利保藏單位，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號(hào)為FERM P-14690。而后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1995年9月29日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-5252(美國專利5,827,698)。
L-谷氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli菌株VL334thrC+(EP 1172433)。E.coli菌株VL334(VKPM B-1641)為thrC和ilvA基因發(fā)生突變的L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(美國專利4,278,765)。thrC基因的野生型等位基因通過常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移，該方法應(yīng)用生長于野生型E.coli菌株K12(VKPM B-7)的細(xì)胞中的噬菌體P1進(jìn)行接種。結(jié)果，獲得L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。該菌株能夠生產(chǎn)L-谷氨酸。
衍生本發(fā)明的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a+酮戊二酸鹽脫氫酶活性的突變體。缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性的埃希氏菌屬細(xì)菌以及獲得它們的方法記載于美國專利5,378,616和5,573,945。特別地，這些菌株包括下述E.coli W3110sucA∷KmrE.coli AJ12624(FERM BP-3853)E.coli AJ12628(FERM BP-3854)E.coli AJ12949(FERM BP-4881)通過破壞E.coli W3110的a-酮戊二酸鹽脫氫酶基因(以下表示為“sucA基因”)獲得E.coli W3110sucA∷Kmr。該菌株完全缺失a-酮戊二酸鹽脫氫酶。
其他L-谷氨酸生產(chǎn)菌的例子，包括缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性的泛菌屬突變菌株，其獲得方法如上所述。該菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美國專利6,331,419)。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日保藏于生物科學(xué)和人類技術(shù)國家研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(現(xiàn)在的高級(jí)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)國家研究所，國際專利保藏單位，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號(hào)為FERM P-16645。而后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1999年1月11日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-6615。由于aKGDH-E1亞單位基因(sucA)被破壞，Pantoea ananatis AJ13356缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性。當(dāng)上述菌株被分離和保藏為成團(tuán)腸桿菌AJ13356時(shí)，其被鑒定為成團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)。然而，現(xiàn)在其根據(jù)16S rRNA等的核苷酸測(cè)序結(jié)果重新分類到Pantoea ananatis。雖然AJ13356在前述保藏單位中保藏為成團(tuán)腸桿菌，本說明書中，它們記載為Pantoea ananatis。
L-色氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-色氨酸生產(chǎn)菌，如缺乏trpS突變基因編碼的色氨酸-tRNA合酶的Ecoli JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美國專利5,756,345)；具有serA等位基因不受絲氨酸反饋抑制的E.coli SV164(pGH5)(美國專利6,180,373)；缺乏色氨酸酶的E.coli AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美國專利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸鹽生產(chǎn)能力增強(qiáng)的E.coli AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美國專利6,319,696)等。
過去鑒定出yddG基因編碼膜蛋白，其不參與任何L-氨基酸的生物合成途徑。此外，已知當(dāng)yddG基因的野生型等位基因在微生物內(nèi)的多拷貝載體中擴(kuò)增時(shí)，其使得微生物具有對(duì)L-苯丙氨酸和幾種氨基酸類似物的抗性。此外，當(dāng)額外的拷貝被導(dǎo)入相應(yīng)生產(chǎn)菌株的細(xì)胞時(shí)，yddG基因可以增加L-苯丙氨酸或L-色氨酸的產(chǎn)量(WO03044192)。因此優(yōu)選進(jìn)一步修飾L-色氨酸生產(chǎn)菌從而增強(qiáng)yddG開放讀碼框的表達(dá)。
L-精氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-精氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，L-精氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli菌株237(VKPM B-7925)(美國專利申請(qǐng)US2002058315)和其含有突變的N-乙?；劝彼岷厦傅难苌?俄羅斯專利申請(qǐng)No.2001112869)、E.coli菌株382(VKPM B-7926)(歐洲專利申請(qǐng)EP1170358)、導(dǎo)入編碼N-乙酰基谷氨酸合酶的argA基因的精氨酸生產(chǎn)菌株(JP 57-5693A)等。
L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli AJ12739(tyrA∷Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)；含有pheA34基因的Ecoli HW1089(ATCC 55371)(U.S.Patent5,354,672)；Ecoli MWEC101-b(KR8903681)；E.coli NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(U.S.Patent 4,407,952)。此外，作為親代菌株，可以使用E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)以及命名為AJ12604(FERM BP-3579)的E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](EP 488424 B1)。此外，可以使用yedA基因或yddG基因編碼蛋白活性增強(qiáng)的埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌(美國專利申請(qǐng)2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。
L-半胱氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌，如用不同的編碼反饋抗性絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶的cysE等位基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的E.coli菌株JM15(美國專利6,218,168，俄羅斯專利申請(qǐng)2003121601)；過表達(dá)編碼細(xì)胞毒性分泌蛋白的基因的E.coli菌株W3110(美國專利5,972,663)；具有較低半胱氨酸去硫化酶活性的E.coli菌株(JP 11-155571A)；增強(qiáng)cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白活性的E.coli菌株W3110(WO0127307A1)等。
L-亮氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-亮氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-亮氨酸生產(chǎn)菌，如對(duì)亮氨酸類似物具有抗性的E.coli菌株，所述類似物包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-azaleucine、5，5，5-三氟亮氨酸(JP 62-34397B和JP 08-70879A)；利用WO96/06926所述基因工程方法獲得的Ecoli菌株；E.coli菌株H-9068(JP 08-70879A)等。
通過增強(qiáng)一個(gè)或多個(gè)涉及L-亮氨酸生物合成的基因的表達(dá)可以改善本發(fā)明的細(xì)菌。例子包括leuABCD操縱子的基因，優(yōu)選為突變的leuA基因，其編碼不被L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(美國專利6,403,342)。此外，通過增強(qiáng)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)將L-氨基酸分泌出細(xì)菌細(xì)胞的蛋白的編碼基因可以改善本發(fā)明的細(xì)菌。該基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(俄羅斯專利申請(qǐng)2001117632)。
L-脯氨酸生產(chǎn)菌衍生本發(fā)明的L-脯氨酸生產(chǎn)菌的親代菌株的例子包括，但不限于，埃希氏菌屬的L-脯氨酸生產(chǎn)菌，如E.coli菌株702ilvA(VKPM B-8012)，其缺少ilvA基因，并且能夠生產(chǎn)L-脯氨酸(EP 1172433)。通過增強(qiáng)一個(gè)或多個(gè)涉及L-脯氨酸生物合成的基因的表達(dá)可以改善本發(fā)明的細(xì)菌。L-脯氨酸生產(chǎn)菌中該基因的例子包括proB基因，其編碼對(duì)L-脯氨酸反饋抑制不敏感的谷氨酸激酶(DE專利3127361)。此外，通過增強(qiáng)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)將L-氨基酸分泌出細(xì)菌細(xì)胞的蛋白的編碼基因可以改善本發(fā)明的細(xì)菌。該基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。
具有生產(chǎn)L-脯氨酸活性的埃希氏菌屬細(xì)菌的例子包括下述E.coli菌株NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB專利2075056)、VKPM B-8012(俄羅斯專利申請(qǐng)2000124295)、記載于DE專利3127361中的質(zhì)粒突變體、Bloom F.R.等描述的質(zhì)粒突變體(The 15thMiami winter symposium，1983，p.34)等。
上述L-氨基酸生產(chǎn)菌株可以進(jìn)一步采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)戊糖同化率或增強(qiáng)L-氨基酸生物合成能力。
通過擴(kuò)增戊糖同化基因，對(duì)應(yīng)阿拉伯糖的araFG和araBAD基因，或者通過葡萄糖同化系統(tǒng)(PTS和非PTS)的突變，如ptsG的突變(Nichols N.N.等Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，Jul.561-2，120-5)可以進(jìn)一步增加戊糖利用率。
本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)L-氨基酸生產(chǎn)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-組氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的L-組氨酸生產(chǎn)菌，使L-組氨酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-組氨酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，使L-蘇氨酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的L-賴氨酸生產(chǎn)菌，使L-賴氨酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，使L-谷氨酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的L-色氨酸生產(chǎn)菌，使L-色氨酸在培養(yǎng)基中累積，以及從培養(yǎng)基中收集L-色氨酸的步驟，其中培養(yǎng)基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。
戊糖，如木糖和阿拉伯糖，與己糖，如葡萄糖的混合物可以從未充分利用的生物質(zhì)資源中獲得。通過蒸汽和/或濃縮的酸解、弱酸解、酶水解，如使用纖維素酶或堿處理，從植物生物質(zhì)中釋放葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其它碳水化合物。當(dāng)?shù)孜锸抢w維素材料時(shí)，纖維素可同時(shí)或分別水解為糖并且也發(fā)酵為L-氨基酸。由于半纖維素比纖維素更容易水解為糖，優(yōu)選預(yù)水解纖維素材料，分離戊糖而后利用蒸汽、酸、堿、纖維素酶或其結(jié)合的處理方法水解纖維素以形成葡萄糖。
本研究使用不同比率的葡萄糖/木糖/阿拉伯糖組成的混合物，以模擬可能從植物水解物中獲得的葡萄糖和戊糖原材料混合物的組成(參見實(shí)施例部分)。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中L-氨基酸的培養(yǎng)、收集和純化等采用的方法類似于常規(guī)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白的方法。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和礦物，以及如果需要，含有合適量的微生物生長所需的營養(yǎng)物。
碳源可包括多種可被L-氨基酸生產(chǎn)菌用作碳源的碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖和其它戊糖和己糖。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其它碳水化合物可以是從纖維素生物質(zhì)中獲得的糖的原材料混合物的一部分。
本發(fā)明中適合發(fā)酵的戊糖包括，但不限于木糖和阿拉伯糖。
用作氮源，可以使用多種銨鹽如氨水和硫酸銨、其它含氮組合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解產(chǎn)物和同化的發(fā)酵微生物。礦物，可以使用一磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、氯化鈣等。需要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入額外的營養(yǎng)物。例如，如果微生物的生長需要脯氨酸(脯氨酸缺陷型)，在培養(yǎng)時(shí)可以向培養(yǎng)基中加入足量的脯氨酸。
優(yōu)選地，培養(yǎng)在有氧的條件下進(jìn)行例如搖瓶培養(yǎng)，和通風(fēng)條件下攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20到40℃，優(yōu)選30到38℃。培養(yǎng)基的pH值通常在5到9之間，優(yōu)選在6.5到7.2之間。培養(yǎng)基的pH值可以用氨水、碳酸鈣、多種酸、多種堿和緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。通常，培養(yǎng)1到5天可以在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生目的L-氨基酸的累積。
培養(yǎng)后，通過離心或膜過濾從液體培養(yǎng)基中除去固體物質(zhì)如細(xì)胞，而后采用離子交換、濃縮和結(jié)晶方法收集和純化目的L-氨基酸。
實(shí)施例本發(fā)明將通過關(guān)于下面的非限制性實(shí)例進(jìn)行更確切的解釋。
實(shí)施例1.從E.coli菌株MG1655的染色體克隆xvlABFGHR基因座根據(jù)E.coli菌株MG1655的基因組分析，基因xylABFGHR可以被克隆為全部556個(gè)HindIII染色體片段中的一個(gè)獨(dú)立的HindIII片段(13.1kb)(圖1)。為此目的，用載體pUC19建立了基因文庫，含有該尺寸插入物的該載體能夠在E.coli中存活。
為建立這樣的文庫，MG1655的染色體DNA用HindIII限制性酶切消化并且pUC19載體用XbaI限制性酶切消化。菌株MG1655(ATCC47076，ATCC700926)可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，VA.，20110-2209，U.S.A)得到。
為了防止自連，兩DNA產(chǎn)物的粘性末端隨后均被Klenow片段補(bǔ)齊(兩堿基填補(bǔ))。在連接步驟之后，得到重組的pUC19質(zhì)粒庫。庫的大小大于200000克隆?；驇焓褂门c質(zhì)粒序列互補(bǔ)的引物和與克隆染色體片段互補(bǔ)的引物通過PCR進(jìn)行分析。在PCR產(chǎn)物中沒有發(fā)現(xiàn)具有適當(dāng)分子量的DNA片段，其說明建立的庫中遺漏與xylABFGHR操縱子相應(yīng)的片段。這個(gè)結(jié)果可能是由于malS基因、yiaA以及yiaB ORFs(未知其功能)的負(fù)面影響，其也存在于HindIII目的片段中。另外一個(gè)負(fù)面選擇可能的原因是Xyl-基因座太大。為了克服這個(gè)問題，基于修飾的pUC19質(zhì)粒建立了新的基因庫。主要的方法是克隆Xyl-基因座作為不含有相鄰的malS基因和yiaA和yiaB ORFs的一組片段。
為此目的，通過插入合成的含有MluI限制位點(diǎn)的DNA片段來修飾質(zhì)粒pUC19的多接頭。用修飾的pUC19克隆載體建立兩個(gè)基因庫。第-個(gè)庫的建立是通過用HindIII和MluI限制性酶消化菌株MG1655的染色體DNA和修飾的pUC19而后連接。庫的容量4,000余個(gè)克隆?；驇煊门c質(zhì)粒序列互補(bǔ)的引物和與xyl基因座的xylABFG片段互補(bǔ)的引物1(SEQ ID NO13)和2(SEQID NO14)進(jìn)行PCR分析。在PCR產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有合適分子量的預(yù)期DNA片段。接下來的步驟是用目的片段飽和基因庫。在這之后，從源基因庫中得到的DNA用內(nèi)切核酸酶消化，在其目的片段中不存在限制性位點(diǎn)。有Eco1471、KpnI、MlsI、Bst1107I。在富集后的庫中的目的質(zhì)粒的頻率為1/800克隆。富集后的庫如上文所述通過PCR分析。在五個(gè)連續(xù)的庫細(xì)胞群的富集后，僅發(fā)現(xiàn)了10個(gè)含有xylABFG基因的克隆。所得到的含有基因xylABFG的HindIII-MluIDNA片段的質(zhì)粒命名為pUC19/xylA-G。隨后含有yiaA和yiaB ORFs的HindIII-Mph1103I片段從質(zhì)粒pUC19/xylA-G中除去；通過Klenow片段補(bǔ)齊粘性末端并且通過連接反應(yīng)插入含有EcoRI限制位點(diǎn)的合成接頭。這樣，獲得了質(zhì)粒pUC19/xylA-G-2。然后，所得的pUC19/xylA-G-2質(zhì)粒用EheI限制性酶切斷；通過Klenow片段補(bǔ)齊粘性末端并且通過連接反應(yīng)插入含有HindIII限制位點(diǎn)的合成接頭。這樣獲得了pUC19/xylA-G-3。HindIII限制性位點(diǎn)插入余下的含有xylHR基因的DNA片段，得到完整的xyl基因座。
第二個(gè)庫的建立是通過用PstI和MluI限制性酶消化菌株MG1655的染色體DNA和修飾的pUC19而后連接。庫的容量6,000余個(gè)克隆。基因庫用與質(zhì)粒序列互補(bǔ)的引物和與染色體片段克隆互補(bǔ)的引物3(SEQ ID NO15)和4(SEQ ID NO16)進(jìn)行PCR分析。在PCR產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有合適分子量的預(yù)期DNA片段。接下來的步驟為通過PCR分析對(duì)已知大小的基因庫在細(xì)胞群上的連續(xù)細(xì)分。在庫的七個(gè)連續(xù)細(xì)分之后含有基因xylHR的細(xì)胞群包含僅十個(gè)克隆。在這個(gè)群中，通過限制性分析發(fā)現(xiàn)了目的DNA片段。所得到的含有xylHR基因的HindIII-MluI DNA片段的質(zhì)粒被命名為pUC19/xylHR。隨后，從質(zhì)粒pUC19/xylHR中得到的HindIII-MluI DNA片段連接到之前已經(jīng)通過HindIII和MluI限制性酶處理過的pUC19/xylA-G-3質(zhì)粒上。最后，獲得菌株MG1655完整的xyl基因座。得到的含有完整xylABFGHR基因座的多拷貝質(zhì)粒命名為pUC19/xylA-R。
然后從pUC19/xylA-R質(zhì)粒中得到的HindIII-EcoRI DNA片段重新克隆至已用HindIII和EcoRI限制性酶消化的低拷貝載體pMW119mod，得到含有完整的xylABFGHR基因座的低拷貝質(zhì)粒pMW119mod-xylA-R。低拷貝載體pMW119mod從可商購的pMW119載體中通過除去PvuII-PvuII片段獲得。該片段含有多克隆位點(diǎn)并且為lacZ基因的主要部位。LacZ基因含有l(wèi)acI抑制物的位點(diǎn)，其后為含有EcoRI和HindIII位點(diǎn)的合成接頭的插入，其對(duì)于從pUC19/xylA-R質(zhì)粒中xylABFGHR基因座的插入是必須的。
實(shí)施例2使用L-組氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸L-組氨酸生產(chǎn)E.coli菌株80是用于葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸的菌株。E.coli菌株80(VKPM B-7270)在俄羅斯專利RU2119536中詳細(xì)描述并且已經(jīng)于1999年10月15日在Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(Russia，113545 Moscow，1stDorozhny proezd，1)以序號(hào)VRPMB-7270保藏。隨后，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2004年1月12日轉(zhuǎn)為國際保藏。通過常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株80，獲得菌株80/pMW119mod-xylA-R。
為獲得種子培養(yǎng)物，菌株80和80/pMW119mod-xylA-R均在含有2ml的含1g/l的鏈霉素的L-肉湯的40ml試管(18mm)中，27℃于旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上生長6個(gè)小時(shí)。對(duì)菌株80/pMW119mod-xylA-R，加入100mg/l的氨芐西林。隨后，將2ml(5％)的種子物質(zhì)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。在含有2ml發(fā)酵培養(yǎng)基的40ml試管中在27℃于旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上生長65個(gè)小時(shí)。
培養(yǎng)之后，累積在培養(yǎng)基中的L-組氨酸的量通過紙色譜法測(cè)定。流動(dòng)相的組成如下丁醇∶醋酸酯∶水＝4∶1∶1(v/v)。用茚三酮的丙酮溶液(0.5％)作為顯示劑。結(jié)果顯示在表2中。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)糖類(總量)100.0MamenoTN(全部氮)的0.2(大豆水解產(chǎn)物)L-脯氨酸 0.8(NH4)2SO425.0K2HPO42.0MgSO4·7H2O1.0FeSO4·7H2O0.01MnSO4·5H2O0.01鹽酸硫胺 0.001甜菜堿2.0CaCO36.0鏈霉素1.0碳水化合物(葡萄糖、阿拉伯糖、木糖)、L-脯氨酸、甜菜堿和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3干熱在110℃滅菌30分鐘。滅菌前pH通過KOH調(diào)節(jié)至6.0。
從表2中可見，xylABFGHR基因座的增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)了在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的L-組氨酸生產(chǎn)E.coli菌株80的產(chǎn)率。
表2

實(shí)施例3.使用L-蘇氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸L-蘇氨酸生產(chǎn)E.coli菌株B-3996用于評(píng)價(jià)葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-組氨酸。分別通過使用CaCl2的常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒和載體pMW119轉(zhuǎn)化菌株B-3996，獲得菌株3996/pMW119mod-xylA-R和3996/pMW119。
Ecoli菌株B-3996和B-3996/pMW119mod-xylA-R均在含有鏈霉素(50mg/l)和氨芐西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個(gè)小時(shí)。隨后，在含有木糖(4％)作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種一環(huán)菌株。在20×20mm試管中在2ml的含有鏈霉素(50mg/l)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。細(xì)胞在32℃在250rpm的振蕩下生長65個(gè)小時(shí)。
培養(yǎng)之后，累積在培養(yǎng)基中的L-蘇氨酸的量通過紙色譜法測(cè)定，其應(yīng)用如下流動(dòng)相∶丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-蘇氨酸的點(diǎn)，L-蘇氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-蘇氨酸的量用分光光度法在540nm測(cè)定。結(jié)果在表3中顯示。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下糖類(總量) 40.0(NH4)2SO424.0NaCl0.8KH2PO42.0
MgSO4·7H2O 0.8FeSO4·7H2O 0.02MnSO4·5H2O 0.02鹽酸硫胺 0.0002酵母提取物 1.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3干熱在180℃滅菌2小時(shí)。pH調(diào)節(jié)至7.0。滅菌后抗菌素被引入至培養(yǎng)基。
表3

如在表3中所示，xylABFGHR基因座的增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)了培養(yǎng)于含有木糖的培養(yǎng)基中的L-蘇氨酸生產(chǎn)E.coli菌株B-3996/pMW119的產(chǎn)率。
實(shí)施例4.使用L-賴氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸L-賴氨酸生成E.coli菌株WC196ΔcadAΔldc用于評(píng)價(jià)葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。菌株WC196ΔcadAΔldc從通過如美國專利5,827,698中描述的滅活通過ldcC基因和cadA基因編碼的賴氨酸脫羧酶的菌株WC196中獲得。分別通過使用CaCl2的常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒和載體pMW119轉(zhuǎn)化菌株WC196ΔcadAΔldc，獲得菌株WC196ΔcadAΔldc/pMW119mod-xylA-R和WC196ΔcadAΔldc/pMW119。
E.coli菌株WC196ΔcadAΔldc/pMW119和WC196ΔcadAΔldc/pMW119mod-xylA-R均在含有氨芐西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個(gè)小時(shí)。隨后，在含有木糖(4％)或木糖(2％)/葡萄糖(2％)混合物作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種一環(huán)菌株。在20×20mm試管中在2ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。細(xì)胞在32℃在250rpm的振蕩下生長25個(gè)小時(shí)。
培養(yǎng)之后，累積在培養(yǎng)基中的L-賴氨酸的量通過紙色譜法測(cè)定，其應(yīng)用如下流動(dòng)相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-賴氨酸的點(diǎn)，L-賴氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-賴氨酸的量用分光光度法在540nm測(cè)定。結(jié)果在表4中顯示。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下糖類(總量) 40.0(NH4)2SO424.0KH2PO41.0MgSO4·7H2O 1.0FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·5H2O 0.01酵母提取物 2.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3干熱在180℃滅菌2小時(shí)。pH用KOH調(diào)節(jié)至7.0。滅菌后抗菌素被引入至培養(yǎng)基。

如在表4中所示，xylABFGHR基因座的增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)了培養(yǎng)于含有木糖的培養(yǎng)基中L-賴氨酸生成E.coli菌株WC196ΔcadA Δldc/pMW119的產(chǎn)率。
實(shí)施例5.使用L-谷氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸。
L-谷氨酸生成E.coli菌株AJ12624用于評(píng)價(jià)葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸產(chǎn)物。分別通過使用CaCl2的常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒和載體pMW119轉(zhuǎn)化菌株AJ12624，獲得菌株AJ12624/pMW119mod-xylA-R和AJ12624/pMW119。
E.coli菌株AJ12624/pMW119和AJ12624/pMW119mod-xylA-R均在含有氨芐西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個(gè)小時(shí)。隨后，向含有木糖(4％)作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基接種一環(huán)菌株。在20×20mm試管中在2ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。細(xì)胞在32℃在250rpm的振蕩下生長48個(gè)小時(shí)。
培養(yǎng)之后，累積在培養(yǎng)基中的L-谷氨酸的量通過紙色譜法測(cè)定，其應(yīng)用如下流動(dòng)相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-谷氨酸的點(diǎn)，L-谷氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-谷氨酸的量用分光光度法在540nm測(cè)定。結(jié)果在表5中顯示。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)糖類 40.0(NH4)2SO425.0KH2PO42.0MgSO4·7H2O 1.0鹽酸硫胺 0.0001L-異亮氨酸 0.07CaCO325.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3干熱在180℃滅菌2小時(shí)。pH調(diào)節(jié)至7.2。
表5

如在表5中所示，xylABFGHR基因座的增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)了在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的L-谷氨酸生產(chǎn)E.coli菌株AJ12624/pMW119的產(chǎn)率。
實(shí)施例6.使用L-色氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。
L-色氨酸生成E.coli菌株SV164/pGH5用于評(píng)價(jià)葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。分別通過使用CaCl2的常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒和載體pMW119轉(zhuǎn)化菌株SV164/pGH5，獲得菌株SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R和SV164/pGH5/pMW119。
E.coli菌株SV164/pGH5/pMW119和SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R均在含有四環(huán)素(30mg/l)和氨芐西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個(gè)小時(shí)。隨后，向含有木糖(4％)或木糖(2％)/葡萄糖(2％)混合物作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基接種一環(huán)菌株。在20×20mm試管中在2ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。細(xì)胞在30℃在250rpm的振蕩下生長48個(gè)小時(shí)。
培養(yǎng)之后，累積在培養(yǎng)基中的L-色氨酸的量通過TLC測(cè)定。采用10×15cm的TLC平皿用不含熒光指示劑的0.11mm的Sorbfil硅膠(Stock CompanySorbpolymer Krasnodar，Russia)包被。Sorbfil平皿可以應(yīng)用如下流動(dòng)相顯像丙二醇∶乙烯醋酸酯∶25％液態(tài)氨∶水＝40∶40∶7∶16(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。結(jié)果在表7中顯示。發(fā)酵培養(yǎng)基組合物列在表5中，但是應(yīng)該組A、B、C、D、E、F和H之間分別滅活，如所顯示的，為了避免在滅活過程中相互之間的副作用。
表6.


溶液A通過NH4OH調(diào)節(jié)PH至7.1。
表7

如在表7中所示，xylABFGHR基因座的增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)了在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的L-色氨酸生產(chǎn)E.coli菌株SV164/pGH5/pMW119的產(chǎn)率。
雖然本發(fā)明用其優(yōu)選的實(shí)施方式詳細(xì)描述，顯然對(duì)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言可以進(jìn)行各種變換，以及在不背離本發(fā)明的范圍下的等同物的替換。每一個(gè)前述文件在此均全文引用作為參考。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.
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<221>CDS<222>(1)..(1323)<400>1atg caa gcc tat ttt gac cag ctc gat cgc gtt cgt tat gaa ggc tca48Met Gln Ala Tyr Phe Asp Gln Leu Asp Arg Val Arg Tyr Glu Gly Ser1 5 10 15aaa tcc tca aac ccg tta gca ttc cgt cac tac aat cec gac gaa ctg96Lys Ser Ser Asn Pro Leu Ala Phe Arg His Tyr Asn Pro Asp Glu Leu20 25 30gtg ttg ggt aag cgt atg gaa gag cac ttg cgt ttt gcc gcc tgc tac144Val Leu Gly Lys Arg Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ala Ala Cys Tyr35 40 45
tgg cac acc ttc tgc tgg aac ggg gcg gat atg ttt ggt gtg ggg gcg192Trp His Thr Phe Cys Trp Asn Gly Ala Asp Met Phe Gly Val Gly Ala50 55 60ttt aat cgt ccg tgg cag cag cct ggt gag gca ctg gcg ttg gcg aag240Phe Asn Arg Pro Trp Gln Gln Pro Gly Glu Ala Leu Ala Leu Ala Lys65 70 75 80cgt aaa gca gat gtc gca ttt gag ttt ttc cac aag tta cat gtg cca288Arg Lys Ala Asp Val Ala Phe Glu Phe Phe His Lys Leu His Val Pro85 90 95ttt tat tgc ttc cac gat gtg gat gtt tcc cct gag ggc gcg tcg tta336Phe Tyr Cys Phe His Asp Val Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala Ser Leu100 105 110aaa gag tac atc aat aat ttt gcg caa atg gtt gat gtc ctg gca ggc384Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Phe Ala Gln Met Val Asp Val Leu Ala Gly115 120 125aag caa gaa gag agc ggc gtg aag ctg ctg tgg gga acg gcc aac tgc432Lys Gln Glu Glu Ser Gly Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Cys130 135 140ttt aca aac cct cgc tac ggc gcg ggt gcg gcg acg aac cca gat cct480Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Asn Pro Asp Pro145 150 155 160gaa gtc ttc agc tgg gcg gca acg caa gtt gtt aca gcg atg gaa gca528GluVal Phe Ser Trp Ala Ala Thr Gln Val Val Thr Ala Met Glu Ala165 170 175acc cat aaa ttg ggc ggt gaa aac tat gtc ctg tgg ggc ggt cgt gaa576Thr His Lys Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Val Leu Trp Gly Gly Arg Glu180 185 190ggt tac gaa acg ctg tta aat acc gac ttg cgt cag gag cgt gaa caa624Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Leu Arg Gln Glu Arg Glu Gln195 200 205ctg ggc cgc ttt atg cag atg gtg gtt gag cat aaa cat aaa atc ggt672Leu Gly Arg Phe Met Gln Met Val Val Glu His Lys His Lys Ile Gly210 215 220
ttc cag ggc acg ttg ctt atc gaa ccg aaa ccg caa gaa ccg acc aaa720Phe Gln Gly Thr Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Gln Glu Pro Thr Lys225 230 235 240cat caa tat gat tac gat gcc gcg acg gtc tat ggc ttc ctg aaa cag768His Gln Tyr Asp Tyr Asp Ala Ala Thr Val Tyr Gly Phe Leu Lys Gln245 250 255ttt ggt ctg gaa aaa gag att aaa ctg aac att gaa gct aac cac gcg816Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ile Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala260 265 270acg ctg gca ggt cac tct ttc cat cat gaa ata gcc acc gcc att gcg864Thr Leu Ala Gly His Ser Phe His His Glu Ile Ala Thr Ala Ile Ala275 280 285ctt ggc ctg ttc ggt tct gtc gac gcc aac cgt ggc gat gcg caa ctg912Leu Gly Leu Phe Gly Ser Val Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala Gln Leu290 295 300ggc tgg gac acc gac cag ttc ccg aac agt gtg gaa gag aat gcg ctg960Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Asn Ser Val Glu Glu Asn Ala Leu305 310 315 320gtg atg tat gaa att ctc aaa gca ggc ggt ttc acc acc ggt ggt ctg1008Val Met Tyr Glu Ile Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Thr Gly Gly Leu325 330 335aac ttc gat gcc aaa gta cgt cgt caa agt act gat aaa tat gat ctg1056Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Gln Ser Thr Asp Lys Tyr Asp Leu340 345 350ttt tac ggt cat atc ggc gcg atg gat acg atg gca ctg gcg ctg aaa1104Phe Tyr Gly His Ile Gly Ala Met Asp Thr Met Ala Leu Ala Leu Lys355 360 365att gca gcg cgc atg att gaa gat ggc gag ctg gat aaa cgc atc gcg1152Ile Ala Ala Arg Met Ile Glu Asp Gly Glu Leu Asp Lys Arg Ile Ala370 375 380cag cgt tat tcc ggc tgg aat agc gaa ttg ggc cag caa atc ctg aaa1200Gln Arg Tyr Ser Gly Trp Asn Ser Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Lys385 390 395 400
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195 200 205Leu Gly Arg Phe Met Gln Met Val Val Glu His Lys His Lys Ile Gly210 215 220Phe Gln Gly Thr Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Gln Glu Pro Thr Lys225 230 235 240His Gln Tyr Asp Tyr Asp Ala Ala Thr Val Tyr Gly Phe Leu LysGln245 250 255Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ile Lys Leu Ash Ile Glu Ala Ash His Ala260 265 270Thr Leu Ala Gly His Ser Phe His His Glu Ile Ala Thr Ala lle Ala275 280 285Leu Gly Leu Phe Gly Ser Val Asp Ala AshArg Gly Asp Ala Gln Leu290 295 300Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ash Ser Val Glu Glu Ash Ala Leu305 310 315 320Val Met Tyr Glu Ile Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Thr GlyGly Leu325 330 335Ash Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Gln Ser Thr Asp Lys Tyr Asp Leu340 345 350Phe Tyr Gly His Ile Gly Ala Met Asp Thr MetAla Leu Ala Leu Lys355 360 365Ile Ala Ala Arg Met Ile Glu Asp Gly Glu Leu Asp Lys Arg Ile Ala370 375 380Gln Arg Tyr Ser Gly Trp Ash Ser Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Lys385 390 395 400Gly Gln Met Ser Leu Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ala Gln Glu His His405 410 415Leu Ser Pro Val His GlnSer Gly Arg Gln Glu Gln Leu Glu Asn Leu420 425 430Val Asn His Tyr Leu Phe Asp Lys435 440<210>3<211>1455<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1455)<400>3
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370 375 380atg gac tcc gca acc aaa cgc cgt tct tga1182Met Asp Ser Ala Thr Lys Arg Arg Ser385 390<210>10<211>393<212>PRT<213>大腸桿菌<400>10Met Ser Lys Ser Asn Pro Ser Glu Val Lys Leu Ala Val Pro Thr Ser1 5 10 15Gly Gly Phe Ser Gly Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Val Phe Val Met20 25 30lle Ala Ala Ile Ile Ala Ile Met Leu Phe Phe Thr Trp Thr Thr Asp35 40 45Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Arg Asn Val Ser Asn Leu Leu Arg Gln Thr50 55 60Ala Ile Thr Gly Ile Leu Ala Val Gly Met Val Phe Val Ile Ile Ser65 70 75 80Ala Glu Ile Asp Leu Ser Val Gly Ser Met Met Gly Leu Leu Gly Gly85 90 95Val Ala Ala Ile Cys Asp Val Trp Leu Gly Trp Pro Leu Pro Leu Thr100 105 110Ile lle Val Thr Leu Val Leu Gly Leu Leu Leu Gly Ala Trp Asn Gly115 120 125Trp Trp Val Ala Tyr Arg Lys Val Pro Ser Phe Ile Val Thr Leu Ala130 135 140Gly Met Leu Ala Phe Arg Gly Ile Leu Ile Gly Ile Thr Asn Gly Thr145 150 155 160Thr Val Ser Pro Thr Ser Ala Ala Met Ser Gln Ile Gly Gln Ser Tyr165 170 175Leu Pro Ala Ser Thr Gly Phe Ile Ile Gly Ala Leu Gly Leu Met Ala180 185 190Phe Val Gly Trp Gln Trp Arg Gly Arg Met Arg Arg Gln Ala Leu Gly195 200 205Leu Gln Ser Pro Ala Ser Thr Ala Val Val Gly Arg Gln Ala Leu Thr210 215 220Ala Ile Ile Val Leu Gly Ala Ile Trp Leu Leu Asn Asp Tyr Arg Gly225 230 235 240Val Pro Thr Pro Val Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Gly Gly Met
245 250 255Phe Met Ala Thr Arg Thr Ala Phe Gly Arg Arg Ile Tyr Ala Ile Gly260 265 270Gly Asn Leu Glu Ala Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asn Val Glu Arg Thr275 280 285Lys Leu Ala Val Phe Ala Ile Asn Gly Leu Met Val Ala Ile Ala Gly290 295 300Leu Ile Leu Ser Ser Arg Leu Gly Ala Gly Ser Pro Ser Ala Gly Asn305 310 315 320Ile Ala Glu Leu Asp Ala Ile Ala Ala Cys Val Ile Gly Gly Thr Ser325 330 335Leu Ala Gly Gly Val Gly Ser Val Ala Gly Ala Val Met Gly Ala Phe340 345 350Ile Met Ala Ser Leu Asp Asn Gly Met Ser Met Met Asp Val Pro Thr355 360 365Phe Trp Gln Tyr Ile Val Lys Gly Ala Ile Leu Leu Leu Ala Val Trp370 375 380Met Asp Ser Ala Thr Lys Arg Arg Ser385 390<210>11<211>1179<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1179)<400>11atg ttt act aaa cgt cac cgc atc aca tta ctg ttc aat gcc sat aaa48Met Phe Thr Lys Arg His Arg Ile Thr Leu Leu Phe Asn Ala Asn Lys1 5 10 15gcc tat gac cgg cag gta gta gaa ggc gta ggg gaa tat tta cag gcg96Ala Tyr Asp Arg Gln Val Val Glu Gly Val Gly Glu Tyr Leu Gln Ala20 25 30tca caa tcg gaa tgg gat att ttc att gaa gaa gat ttc cgc gcc cgc144Ser Gln Ser Glu Trp Asp Ile Phe Ile Glu Glu Asp Phe Arg Ala Arg35 40 45
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cgc tat ctg tcg cgt gtc gcc ctt tct tcg gtc gct cag ggc gcg cgg720Arg Tyr Leu Ser Arg Val Ala Leu Ser Ser Val Ala Gln Gly Ala Arg225 230 235 240caa atg ggc tat cag gcg gca aaa ctg ttg cat cga tta tta gat aaa768Gln Met Gly Tyr Gln Ala Ala Lys Leu Leu His Arg Leu Leu Asp Lys245 250 255gaa gaa atg ccg cta cag cga att ttg gtc cca cca gtt cgc gtc att816Glu Glu Met Pro Leu Gln Arg Ile Leu Val Pro Pro Val Arg Val Ile260 265 270gaa cgg cgc tca aca gat tat cgc tcg ctg acc gat ccc gcc gtt att864Glu Arg Arg Ser Thr Asp Tyr Arg Ser Leu Thr Asp Pro Ala Val Ile275 280 285cag gcc atg cat tac att cgt aat cac gcc tgt aaa ggg att aaa gtg912Gln Ala Met His Tyr Ile Arg Asn His Ala Cys Lys Gly Ile Lys Val290 295 300gat cag gta ctg gat gcg gtc ggg atc tcg cgc tcc aat ctt gag aag960Asp Gln Val Leu Asp Ala Val Gly Ile Ser Arg Ser Asn Leu Glu Lys305 310 315 320cgt ttt aaa gaa gag gtg ggt gaa acc atc cat gcc atg att cat gcc1008Arg Phe Lys Glu Glu Val Gly Glu Thr Ile His Ala Met Ile His Ala325 330 335gag aag ctg gag aaa gcg cgc agt ctg ctg att tca acc acc ttg tcg1056Glu Lys Leu Glu Lys Ala Arg Ser Leu Leu Ile Ser Thr Thr Leu Ser340 345 350atc aat gag ata tcg caa atg tgc ggt tat cca tcg ctg caa tat ttc1104Ile Asn Glu Ile Ser Gln Met Cys Gly Tyr Pro Ser Leu Gln Tyr Phe355 360 365tac tct gtt ttt aaa aaa gca tat gac acg acg cca aaa gag tat cgc1152Tyr Ser Val Phe Lys Lys Ala Tyr Asp Thr Thr Pro Lys Glu Tyr Arg370 375 380gat gta aat agc gag gtc atg ttg tag1179Asp Val Asn Ser Glu Val Met Leu385 390
<210>12<211>392<212>PRT<213>大腸桿菌<400>12Met Phe Thr Lys Arg His Arg Ile Thr Leu Leu Phe Asn Ala Asn Lys1 5 10 15Ala Tyr Asp Arg Gln Val Val Glu Gly Val Gly Glu Tyr Leu Gln Ala20 25 30Ser Gln Ser Glu Trp Asp IIe Phe Ile Glu Glu Asp Phe Arg Ala Arg35 40 45Ile Asp Lys lle Lys Asp Trp Leu Gly Asp Gly Val Ile Ala Asp Phe50 55 60Asp Asp Lys Gln Ile Glu Gln Ala Leu Ala Asp Val Asp Val Pro Ile65 70 75 80Val Gly Val Gly Gly Ser Tyr His Leu Ala Glu Ser Tyr Pro Pro Val85 90 95His Tyr Ile Ala Thr Asp Asn Tyr Ala Leu Val Glu Ser Ala Phe Leu100 105 110His Leu Lys Glu Lys Gly Val Asn Arg Phe Ala Phe Tyr Gly Leu Pro115 120 125Glu Ser Ser Gly Lys Arg Trp Ala Thr Glu Arg Glu Tyr Ala Phe Arg130 135 140Gln Leu Val Ala Glu Glu Lys Tyr Arg Gly Val Val Tyr Gln Gly Leu145 150 155 160Glu Thr Ala Pro Glu Asn Trp Gln His Ala Gln Asn Arg Leu Ala Asp165 170 175Trp Leu Gln Thr Leu Pro Pro Gln Thr Gly Ile Ile Ala Val Thr Asp180 185 190Ala Arg Ala Arg His Ile Leu Gln Val Cys Glu His Leu His Ile Pro195 200 205Val Pro Glu Lys Leu Cys Val Ile Gly Ile Asp Asn Glu Glu Leu Thr210 215 220Arg Tyr Leu Ser Arg Val Ala Leu Ser Ser Val Ala Gln Gly Ala Arg225 230 235 240Gln Met Gly Tyr Gln Ala Ala Lys Leu Leu His Arg Leu Leu Asp Lys245 250 255Glu Glu Met Pro Leu Gln Arg Ile Leu Val Pro Pro Val Arg Val Ile260 265 270Glu Arg Arg Ser Thr Asp Tyr Arg Ser Leu Thr Asp Pro Ala Val Ile275 280 285Gln Ala Met His Tyr Ile Arg Asn His Ala Cys Lys Gly Ile Lys Val
290 295 300Asp Gln Val Leu Asp Ala Val Gly Ile Ser Arg Ser Asn Leu Glu Lys305 310 315 320Arg Phe Lys Glu Glu Val Gly Glu Thr Ile His Ala Met Ile His Ala325 330 335Glu Lya Leu Glu Lys Ala Arg Ser Leu Leu Ile Ser Thr Thr Leu Ser340 345 350Ile Asn Glu Ile Ser Gln Met Cys Gly Tyr Pro Ser Leu Gln Tyr Phe355 360 365Tyr Ser Val Phe Lys Lys Ala Tyr Asp Thr Thr Pro Lys Glu Tyr Arg370 375 380Asp Val Asn Ser Glu Val Met Leu385 390<210>13<211>23<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>人造序列的說明引物<400>13ggcaactatg catatcttcg cgc 23<210>14<211>24<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>人造序列的說明引物<400>14gcgtgaatga attggcttag gtgg 24<210>15<211>21<212>DNA<213>人造序列
<220>
<223>人造序列的說明引物<400>15cagacagcga gcgaggatcg c21<210>16<211>21<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>人造序列的說明引物<400>16tgtgcggtta tccatcgctg c2權(quán)利要求
1.腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的L-氨基酸生產(chǎn)菌，該細(xì)菌具有任意的木糖利用酶的增強(qiáng)的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中該細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中木糖利用酶活性通過增加xyLABFGHR基因座的表達(dá)量而增強(qiáng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌，其中木糖利用酶活性通過增加xyLABFGHR基因座的拷貝數(shù)或修飾表達(dá)調(diào)控序列以增強(qiáng)基因的表達(dá)而增強(qiáng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)菌，其中拷貝數(shù)通過用含有xyLABFGHR基因座的低拷貝載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌而增加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中xyLABFGHR基因座來自埃希氏菌屬細(xì)菌。
8.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括在含有葡萄糖和戊糖混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述細(xì)菌，并且從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中戊糖是阿拉伯糖和木糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中糖的混合物是從纖維素生物質(zhì)中獲得的糖的原材料混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-組氨酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-組氨酸生物合成相關(guān)基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-蘇氨酸生物合成相關(guān)基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-賴氨酸生物合成相關(guān)基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-色氨酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-谷氨酸生物合成相關(guān)基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生產(chǎn)的L-氨基酸是L-色氨酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)L-色氨酸生物合成相關(guān)基因。
全文摘要
公開了一種生產(chǎn)L－氨基酸，如L－組氨酸、L－蘇氨酸、L－賴氨酸、L－谷氨酸和L－色氨酸的方法，其中使用埃希氏菌屬細(xì)菌，該細(xì)菌中編碼木糖利用酶的基因，如xylABFGHR基因座的表達(dá)量增加。該方法包括在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)L－氨基酸生產(chǎn)菌，并且從培養(yǎng)基中收集L－氨基酸。
文檔編號(hào)C12N15/69GK1749390SQ20051007624
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者A·N·馬辰科, S·V·伯內(nèi)沃倫斯基, E·V·克亞奇科, Y·I·科滋洛夫, E·B·沃羅斯洛瓦, M·M·古斯亞蒂納 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社