專利名稱：卡拉膠四、六糖的酶解制備和檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種卡拉膠四、六糖的制備和檢測方法。
背景技術：
國外專利和文獻中可見到利用κ-卡拉膠酶制備卡拉膠低聚糖的研究，但并未對卡拉膠四、六糖的酶解制備和檢測方法進行描述。國內沒有酶解制備卡拉膠低聚糖的報告和相關專利的提出。已報道的方法以酸解法為主，所制備的卡拉膠低聚糖產物組成復雜，難以高效、穩(wěn)定地生產卡拉膠四、六糖。
日本專利JP2000116376報道了一種可用于新卡拉膠低聚糖和海藻細胞原生質體制備的卡拉膠酶，但并未對酶解產物的具體組成和結構進行描述。
日本專利JP2001501478對一種ι-卡拉膠酶及其編碼基因進行了報道，但并未對酶解產物的具體組成和結構進行描述。
韓國專利KR2001018800報道了一種制備卡拉膠寡糖的方法，該方法采用的是有機酸法。
中國專利申請?zhí)?2135275.5報道了一種卡拉膠低聚糖的制備方法，該方法采用的是稀硫酸或稀鹽酸降解的方法，產物組成復雜。
中國專利申請?zhí)?1107953.3報道了一種κ-卡拉膠寡糖的制造方法，該方法采用的是酸水解，將κ-卡拉膠用硫酸水溶液配成溶膠，并在水浴中加熱進行反應。
中國專利申請?zhí)?3138968.6報道了一種κ-卡拉膠寡糖單體的制備方法，該方法將κ-卡拉膠用酸降解，用Superdex 30柱進行分離，獲得聚合度為7～25的奇數(shù)κ-卡拉膠寡糖。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種卡拉膠四、六糖的酶解制備方法，以及對產物組成的檢測方法。該制備方法同已有報道方法相比，制備過程簡單、產物組成簡單、得率高、產品質量穩(wěn)定，可用于卡拉膠四、六糖的規(guī)?；a。制備的卡拉膠四、六糖產品可用于構效關系研究，為低聚糖藥物和保健食品的研制開發(fā)提供高品質的候選化合物。
卡拉膠四、六糖的酶解制備和檢測方法，包括使κ-卡拉膠溶于NaCl溶液中，加入卡拉膠酶進行反應，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質，濃縮后乙醇分級，冷凍干燥后獲得卡拉膠四、六糖片段，采用基體輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對產物的組成和分子量進行檢測。
本發(fā)明的制備方法對環(huán)境設備要求不高，簡單易行，成本低廉，適于推廣。
具體實施方法取2gκ-卡拉膠溶于100ml 0.3％NaCl溶液中，加入5單位的κ-卡拉膠酶粉，1個酶活力單位定義為在32℃條件下，每min產生1μmol還原糖(以半乳糖計)所需要的酶量。于32℃150r/min振蕩反應18小時，用沸水浴加熱使酶失活，冷卻后加入2倍體積的乙醇，3000r/min離心分離7min以去除雜質，上清液于60℃旋轉蒸發(fā)進行濃縮至20ml，然后加入3倍體積的乙醇使低聚糖得到沉淀，離心收集沉淀物，經(jīng)脫鹽、凍干后得到降解產物，以2，5-二羥基苯甲酸(DHB)為基體，與降解產物混合后，采用基體輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行分析，產物為卡拉膠四、六糖。
本實施例所述的反應溫度為30～35℃，所述的酶解反應時間為18～24小時。


采用基體輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)確定降解產物的組成和分子量范圍，附圖表明卡拉膠酶解產物為組成簡單的卡拉膠四、六糖。
峰組成I帶有1個硫酸基團的卡拉膠四糖，分子量為732；峰組成II帶有2個硫酸基團的卡拉膠四糖，分子量為834；峰組成III帶有2個硫酸基團的卡拉膠六糖，分子量為1140；峰組成IV帶有3個硫酸基團的卡拉膠六糖，分子量為1242。
權利要求
1.一種卡拉膠四、六糖的酶解制備方法，包括將κ-卡拉膠在控制反應溫度和反應時間的條件下進行降解，再通過乙醇分級法將降解產物進行分級，其特征是所述的降解是用κ-卡拉膠酶降解，所制備的降解產物為卡拉膠四、六糖。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征是所述的反應溫度為30～35℃，所述的反應時間為18～24小時，所述的乙醇用量為2～3倍。
3.一種卡拉膠四、六糖的檢測方法，采用基體輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對產物的組成和分子量進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種卡拉膠四、六糖的制備和檢測方法。本發(fā)明的目的是提供一種卡拉膠四、六糖的酶解制備方法，以及對產物組成的檢測方法。該制備方法同已有報道方法相比，制備過程簡單、產物組成簡單、得率高、產品質量穩(wěn)定，可用于卡拉膠四、六糖的規(guī)?；a。制備的卡拉膠四、六糖產品可用于構效關系研究，為低聚糖藥物和保健食品的研制開發(fā)提供高品質的候選化合物?？ɡz四、六糖的酶解制備和檢測方法，包括使κ—卡拉膠溶于NaCl溶液中，加入卡拉膠酶進行反應，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質，濃縮后乙醇分級，冷凍干燥后獲得卡拉膠四、六糖片段，采用基體輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI－TOF－MS)對產物的組成和分子量進行檢測。本發(fā)明的制備方法對環(huán)境設備要求不高，簡單易行，成本低廉，適于推廣。
文檔編號C12P19/00GK1880467SQ20051007931
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月17日 優(yōu)先權日2005年6月17日
發(fā)明者牟海津, 江曉路, 劉志鴻 申請人:中國海洋大學