專利名稱：殺滅和抑制組織培養(yǎng)中“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于特殊培養(yǎng)基的制備，具體涉及的技術(shù)為清除和抑制組織培養(yǎng)中“黑膠蟲”污染的培養(yǎng)基制備和使用方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自20世紀(jì)初創(chuàng)立發(fā)展至今，已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等各個(gè)領(lǐng)域，成為重要的生物研究工具。因此，一項(xiàng)與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的成功研究除了要有良好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)方法，關(guān)鍵因素之一是避免污染。
“黑膠蟲”是近十幾年才發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞污染物，“黑膠蟲”的分類目前尚無鑒定確認(rèn)。
“黑膠蟲”可寄生于動(dòng)物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細(xì)胞傳代而傳代。“黑膠蟲”與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，開始時(shí)對(duì)細(xì)胞并沒有什么影響，但當(dāng)黑膠蟲的數(shù)量多到一定程度的時(shí)候，細(xì)胞生長(zhǎng)就會(huì)受到影響直至死亡，嚴(yán)重影響了科研活動(dòng)的開展和進(jìn)行。所以“黑膠蟲”的污染常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)并使實(shí)驗(yàn)中斷，尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡?！昂谀z蟲”的污染具有以下特點(diǎn)1.黑膠蟲在高倍鏡下呈現(xiàn)明顯的自主運(yùn)動(dòng)，有叢集性。在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態(tài)，一種較大，運(yùn)動(dòng)較慢，泛紅光；另一種較小，紅中帶綠，運(yùn)動(dòng)較快。
2.可以通過0.22μm濾膜，常規(guī)換液或添加常用的抗菌素對(duì)其無效。
3.與其他生物體的污染相比，它不使培養(yǎng)液渾濁，也不改變其pH值。
4.能夠還原四唑鹽(MTT)形成藍(lán)色結(jié)晶物，說明它具有線粒體。目前比較公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為“黑膠蟲”是一種微生物，增殖緩慢但對(duì)細(xì)胞有損害，數(shù)量達(dá)到一定程度可引起細(xì)胞死亡，其來源可能是細(xì)胞本身的污染或從動(dòng)物取材時(shí)污染造成的。該污染在全世界細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室中普遍存在，解決該問題是一個(gè)世界性難題。
本發(fā)明所制備的特殊培養(yǎng)基，對(duì)“黑膠蟲”具有很好的殺滅和抑制作用。通過使用此種特殊培養(yǎng)基2-3次，“黑膠蟲”的污染可以得到有效的控制和預(yù)防。本發(fā)明為防止污染和搶救有價(jià)值的細(xì)胞提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段，是節(jié)約人力物力、減少不必要的經(jīng)費(fèi)支出和保證科研工作的順利進(jìn)行的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過細(xì)胞生長(zhǎng)所必要的營養(yǎng)物質(zhì)和微生物生長(zhǎng)抑制劑的結(jié)合使用，清除和控制細(xì)胞中“黑膠蟲”的污染，以保障各項(xiàng)研究工作的順利進(jìn)行。
本發(fā)明通過如下步驟實(shí)現(xiàn)1.將通用組織培養(yǎng)基加入去離子水中，磁力攪拌直至完全溶解。
2.向上述溶液中加入如下物質(zhì)(1)腐胺(2)轉(zhuǎn)鐵蛋白(3)谷胱甘肽(4)胸腺嘧啶(5)脲嘧啶(6)慶大霉素(7)四環(huán)素(8)羅氏芬(9)阿米卡星(10)兩性霉素B(11)制霉菌素(12)脫氧膽酸鈉(13)新生牛血清(14)碳酸氫鈉3.0.22μm過濾除菌、分裝。
4.去掉被污染細(xì)胞的培養(yǎng)上清，加入步驟3所得的特殊培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)。
5.如步驟4，間隔反復(fù)使用特殊培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式
1.取通用組織培養(yǎng)基1包(1L/包)，加入到900ml去離子水中，磁力攪拌使之完全溶解。
2.加入腐胺，使其終濃度為5-36μg/ml。
3.加入轉(zhuǎn)鐵蛋白，使其終濃度為1-40μg/ml。
4.加入谷胱甘肽，使其終濃度為10-50mg/L。
5.加入胸腺嘧啶，使其終濃度為2-8.3mg/L。
6.加入脲嘧啶，使其終濃度為1-2.5mg/L。
7.加入慶大霉素，使其終濃度為20-300μg/ml。
8.加入四環(huán)素，使其終濃度為5-200μg/ml。
9.加入羅氏芬，使其終濃度為10-500μg/ml。
10.加入阿米卡星，使其終濃度為5-150μg/ml。
11.加入兩性霉素使其終濃度為1-25μg/ml。
12.加入制霉菌素使其終濃度為2-50μg/ml。
13.加入脫氧膽酸鈉使其終濃度為2-50μg/ml。
14.新生牛血清使其終濃度為12％。
15.碳酸氫鈉使其終濃度為3g/L。
16.磁力攪拌使各物質(zhì)完全溶解，調(diào)節(jié)PH到7.0-7.1，定容到1000ml。
17.0.22μm過濾除菌、分裝，100ml/瓶，2-8℃冷藏。
18.去掉被污染細(xì)胞上清，加入如上所得的特殊培養(yǎng)基，每只25cm2培養(yǎng)瓶加入5-8ml特殊培養(yǎng)基。37℃、5％CO2培養(yǎng)后去掉上清，加入常規(guī)培養(yǎng)基。
19.間隔反復(fù)重復(fù)步驟18。
測(cè)定結(jié)果 上述所得的特殊培養(yǎng)基，經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明，對(duì)細(xì)胞的營養(yǎng)支持與普通培養(yǎng)基相同，完全滿足細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的需要；“黑膠蟲”污染的細(xì)胞，經(jīng)過特殊培養(yǎng)基的處理，“黑膠蟲”被殺滅和抑制，在培養(yǎng)上清中消失，細(xì)胞可以繼續(xù)培養(yǎng)，用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究工作；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該產(chǎn)品2-8℃冷藏保存時(shí)間為6個(gè)月。
權(quán)利要求
1.殺滅和抑制組織培養(yǎng)中“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備和使用方法，其特征是1.1通用組織培養(yǎng)基中加入“黑膠蟲”殺滅藥物(1)腐胺 (2)轉(zhuǎn)鐵蛋白 (3)谷胱甘肽 (4)胸腺嘧啶 (5)脲嘧啶 (6)慶大霉素(7)四環(huán)素 (8)羅氏芬 (9)阿米卡星 (10)兩性霉素B (11)制霉菌素 (12)脫氧膽酸鈉 (13)新生牛血清 (14)碳酸氫鈉1.2 0.22μm過濾除菌，分裝2-8℃保存。1.3去掉被污染細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入步驟2所得特殊培養(yǎng)基，37℃、5％ CO2培養(yǎng)。1.4不能完全殺滅可重復(fù)步驟1.3。
2.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(5)加入的物質(zhì)為脲嘧啶，終濃度為2.5mg/L。
3.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(6)加入的物質(zhì)為慶大霉素，終濃度為20-300μg/ml。
4.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(7)加入的物質(zhì)為四環(huán)素，終濃度為5-200μg/ml。
5.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(8)加入的物質(zhì)為羅氏芬，終濃度為10-500μg/ml。
6.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(9)加入的物質(zhì)為阿米卡星，終濃度為5-150μg/ml。
7.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(10)加入的物質(zhì)為兩性霉素B，終濃度為1-25μg/ml。
8.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(11)加入的物質(zhì)為制霉菌素，終濃度為2-50μg/ml。
9.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.1中(12)加入的物質(zhì)為脫氧膽酸鈉，終濃度為2-50μg/ml。
10.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.3中37℃、5％CO2培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
11.如權(quán)利要求書所述殺滅和抑制“黑膠蟲”的特殊培養(yǎng)基的制備方法，其特征是步驟1.4中使用特殊培養(yǎng)的間隔時(shí)間為24-48小時(shí)，反復(fù)使用的次數(shù)為2-3次。
全文摘要
本發(fā)明首次公開了一種特殊培養(yǎng)基的制備和使用方法。它在通用組織培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胸腺嘧啶、脲嘧啶、慶大霉素、四環(huán)素、羅氏芬、阿米卡星、兩性霉素B、制霉菌素、脫氧膽酸鈉等物質(zhì)，經(jīng)0.22μm過濾除菌制得此特殊培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞污染物“黑膠蟲”具有殺滅和抑制作用。該特殊培養(yǎng)基的使用可以挽救被污染細(xì)胞，使科學(xué)研究得以順利進(jìn)行，節(jié)約大量的人力并降低成本。
文檔編號(hào)C12N1/36GK1900266SQ20051008546
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者田海梅, 張偉 申請(qǐng)人:張偉, 田海梅