專利名稱：用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片及其檢測方法和檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片及其檢測方法和檢測用試劑盒，尤其是涉及一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片及其檢測方法和檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是導(dǎo)致發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家各年齡組人群高發(fā)病率、高死亡率的主要致病菌，除引起肺炎、支氣管炎等呼吸道系統(tǒng)疾病外，還可導(dǎo)致中耳炎、副鼻竇炎、腦膜炎、菌血癥等多種疾病，對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在美國每年由肺炎鏈球菌引起的肺炎約有50萬人，中耳炎約6萬人，菌血癥約5萬人，腦膜炎約0.5～0.6萬人。在我國肺炎也是常見病之一，每年有250萬人患肺炎球菌性肺炎并造成其中12.5萬人死亡(以50歲以上中老年人和1歲以下嬰兒為主)。嬰幼兒化膿性中耳炎患者中1/3為肺炎球菌感染，復(fù)發(fā)率高達(dá)40％。據(jù)估計(jì)，全球因肺炎鏈球菌感染的死亡人數(shù)可能與結(jié)核相仿，每年約300～500萬人(Tomasz A.1997.“Antibiotic resistance in StreptococcusPneumoniae.”Clin Infect Dis.24(Suppl)S85.)。而WHO統(tǒng)計(jì)的全球每年因肺炎鏈球菌感染死亡的5歲以下兒童和成人均逾10萬人(CDC.[J].MMWR，1997，46；1-24)，因此研究肺炎鏈球菌對于人類的健康具有很重要的意義。
血清分型是一種經(jīng)典和常用的流行病學(xué)調(diào)查手段，對于臨床研究及疫苗研制具有重要意義。研究表明，肺炎鏈球菌的主要致病物質(zhì)為莢膜和溶血素。有莢膜是其毒力的必需條件，毒力的大小與莢膜中聚集的多糖的結(jié)構(gòu)和含量有關(guān)，莢膜多糖有型特異性，是分型的基礎(chǔ)，根據(jù)莢膜多糖的型特異性分成90個(gè)血清型(Garcia，E.D.2000.“Current trends in capsularpolysaccharide biosynthesis of Streptococcus pneumoniae.”Res.Microbiol.151429-435.)。但不是每一個(gè)型都能同樣地侵襲人體，其中的23個(gè)血清型可引起85％以上的侵襲性感染，這23型分別是1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F(Robbins JB，Austrian R，Lee CJ，et al.1983.Considerations forformulating the second-generation Pneumococcal capsular polysaccharidevaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups.J Infect Dis.1481136-1159.)(以下將該23種血清型肺炎鏈球菌簡稱為23型肺炎鏈球菌)。引起疾病的肺炎球菌型別常因地區(qū)、年代和人群的不同而不同。肺炎球菌3型在丹麥和瑞典是常見的血清型，英國1型較多，法國多見1型和19型，美國以8型最多，而14歲以下人群以14型最多，在南非以45型和46型為主，巴西以14、6B、23、5、19F、6A、1和4型常見。我國調(diào)查結(jié)果顯示致病型肺炎球菌以5型最多，其次為6、1、19、23、14、2及3型。一般來說，肺炎鏈球菌疫苗中所含莢膜多糖的型別應(yīng)占本地血清型的80％以上才能對本地人群起到有效的保護(hù)。而這23個(gè)血清型對美國、法國和中國常見血清型的覆蓋率均在85％以上，所以可視為全球普遍運(yùn)用的組分，因此研究這23型常見肺炎鏈球菌對開展大規(guī)模的血清型調(diào)查及對進(jìn)一步研究肺炎鏈球菌感染和其耐藥性，研制優(yōu)勢菌型疫苗進(jìn)行預(yù)防等方面均具重要價(jià)值。
傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌分型方法主要有兩大類，一類是自上世紀(jì)30年代以來一直被用于細(xì)菌分型和鑒定的血清學(xué)免疫反應(yīng)，多采用“莢膜腫脹”試驗(yàn)進(jìn)行分型，但由于所需抗血清種類一般不全，數(shù)量不足，且大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難，所以檢測試劑盒相當(dāng)昂貴，國內(nèi)不易購得，也正因此目前我國開展的部分肺炎鏈球菌流行病學(xué)調(diào)查多為國際間的合作(如1981～1985年，在衛(wèi)生部領(lǐng)導(dǎo)下，由中國藥品生物制品檢定所丁紹卿負(fù)責(zé)組織了全國18個(gè)省、市29個(gè)單位的協(xié)作組，參加了WHO的對“引起嚴(yán)重感染的肺炎球菌莢膜型的監(jiān)測”的國際協(xié)作項(xiàng)目)。此外這種傳統(tǒng)方法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性也差，所以現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。分子生物學(xué)方法主要包括PCR方法和近幾年發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)。PCR方法是比較成熟的方法，快速、簡單、敏感，但存在自動(dòng)化程度低、一次檢測信息量有限、難以實(shí)現(xiàn)高通量篩檢、對未知來源或新出現(xiàn)的菌株鑒定難度大、在結(jié)果的判定上也不容易進(jìn)行質(zhì)量控制等不足。而發(fā)展中的基因芯片技術(shù)正可以彌補(bǔ)這些不足。
1997年7月，Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人發(fā)明的第6,228,575號(hào)美國專利公開了以生物芯片技術(shù)對微生物進(jìn)行定種和表型分析的方法。從二十世紀(jì)九十年代開始，基因芯片技術(shù)作為一種全新的核酸分析檢測技術(shù)建立了起來，并隨著人類基因組計(jì)劃的開展而逐步發(fā)展。該技術(shù)綜合運(yùn)用了分子生物學(xué)、集成電路制造、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、共聚焦激光掃描、熒光標(biāo)記等技術(shù)，使檢測過程具有敏感性高、特異性強(qiáng)、大規(guī)模集成化、自動(dòng)化、操作簡便快捷、效率高等特點(diǎn)，在基因表達(dá)相關(guān)研究和生物制藥研究等方面得到普遍應(yīng)用。因此，如果將基因芯片技術(shù)用于細(xì)菌血清型鑒定，不僅可以大大簡化檢測手段，提高檢測速度，而且具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高通量、可重復(fù)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
如前所述，肺炎球菌根據(jù)莢膜多糖的型特異性分成90個(gè)血清型，K-抗原是革蘭氏陽性細(xì)菌莢膜多糖中的特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。K-抗原具有高度多樣性，肺炎球菌有90種不同的K-抗原，K-抗原的變化可能是肺炎球菌的起源和維持其多樣性的主要原因(Henrichsen，J.1999.Typing of Streptococcus pneumoniaepast，present，and future.Am.J.Med.10750S-54S.)。研究表明編碼負(fù)責(zé)K-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體DNA上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇，稱為K-抗原基因簇(Jiang，S.M.，L.Wang，and P.R.Reeves.2001.Molecular characterizationof Streptococcus pneumoniae type 4，6B，8，and 18C capsular polysaccharidegene clusters.Infect.Immun.691244-1255.)，K-抗原基因簇中都含有寡糖單位處理酶基因，其中包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx)和聚合酶基因(wzy)，它們編碼的酶將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。因寡糖單位處理酶有特異的供體、受體和連接鍵，因此編碼該寡糖單位處理酶的基因序列間的相似性很低。用Clustalx軟件比對GenBank公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)的wzy序列，證實(shí)此23型的wzy基因(3型為CapA基因，因?yàn)?型沒有wzy基因，而CapA基因?qū)ζ涫翘禺惖?Arrecubieta et al.，1996))之間的確具有很強(qiáng)的特異性，但有11個(gè)血清型與非常見致病型的肺炎鏈球菌血清型有較高的同源性，序列上區(qū)分不開，此11型如下6A與6B，7A與7F，9L與9N，9A與9V，10A與10B、10C、10F，11A與11D、11F，12A與12B、12F、44、46，15B與15C，18A與18B、18C、18F，22A與22F，33A與33F、37。但并不影響此23型的血清型檢測，此23型間的寡糖單位處理酶基因是對K-抗原較特異的基因，這啟示我們選擇其作為常見肺炎鏈球菌分型鑒定的特異基因與先進(jìn)的生物芯片技術(shù)相結(jié)合，研究一種快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測肺炎球菌并將其分型的產(chǎn)品和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一種目的是提供一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)肺炎鏈球菌分型檢測技術(shù)存在的不足。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述基因芯片來快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測肺炎鏈球菌血清型的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用上述基因芯片和檢測方法來檢測肺炎鏈球菌血清型的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案本發(fā)明提出一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，該寡聚核苷酸探針包括從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段和從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段。
其中，上述肺炎鏈球菌不同血清型例如包括1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段例如分別具有如SEQ ID NO2-NO86所示的堿基序列。從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段例如具有如SEQ ID NO1所示的堿基序列。
本發(fā)明還提出一種檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，包括以下步驟(1)根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA和肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；(2)按常規(guī)方法制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟(1)中的引物對待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化靶序列；(3)標(biāo)記步驟(2)中得到的靶序列；(4)將標(biāo)記后的靶序列與本發(fā)明提出的上述基因芯片雜交；(5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號(hào)并分析鑒定雜交結(jié)果。
其中，上述步驟(1)中根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA設(shè)計(jì)的上游引物序列例如為5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列為5’-CCGTCAATTCATTTAAGTTT-3’、5’-CGTCAATTCATTTGAGTTT-3’、5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’。根據(jù)肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)的引物例如分別具有如SEQ ID NO87-NO129所示的堿基序列。
上述步驟(5)中例如使用判讀軟件Bactarray Analyzer按下列步驟分析鑒定雜交結(jié)果(1)雜交信號(hào)的有效性驗(yàn)證對上述基因芯片上每條特異探針的多個(gè)重復(fù)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行置信度檢驗(yàn)，剔除異常的信號(hào)強(qiáng)度，取正常的信號(hào)強(qiáng)度的平均值作為每條特異探針的信號(hào)強(qiáng)度；(2)歸一化使用上述基因芯片上全部特異探針的總信號(hào)強(qiáng)度值作為歸一化標(biāo)準(zhǔn)，然后用每個(gè)探針點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度除以該歸一化標(biāo)準(zhǔn)，將每個(gè)探針點(diǎn)的絕對信號(hào)強(qiáng)度變?yōu)橄鄬π盘?hào)強(qiáng)度，從而使不同時(shí)間、不同條件下進(jìn)行的試驗(yàn)具有可比性；
(3)對每條特異探針打分針對每條特異探針給出一個(gè)分值，代表待測的DNA片段序列和該特異探針序列的相似程度；(4)應(yīng)用模式對待測樣品中可能含有的血清型進(jìn)行打分這里的“模式”指的是待測樣品與其相關(guān)的特異探針之間的對應(yīng)關(guān)系的模式文件，該文件按照擴(kuò)展標(biāo)記語言1.0標(biāo)準(zhǔn)編寫，不同類型的芯片有各自不同的模式。模式文件中保存了該類型芯片的基本信息以及該芯片所能檢測的所有血清型與其相關(guān)特異探針之間的對應(yīng)關(guān)系。在對待測樣品中可能含有的血清型進(jìn)行打分時(shí)，軟件程序會(huì)統(tǒng)計(jì)該血清型對應(yīng)的所有相關(guān)探針的分值，而該血清型的分值為所有相關(guān)探針分值的加權(quán)平均值。
(5)判斷樣品中可能含有的血清型經(jīng)過上述步驟的處理，軟件程序給樣品中所有可能的肺炎鏈球菌血清型均給出一個(gè)分值，分值最高的即為最有可能存在的血清型，分值低于閾值的血清型不可能存在。
本發(fā)明還提出一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的試劑盒，包括基因芯片，其包含固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針包括從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段和從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段；PCR擴(kuò)增引物，根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA和肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)。
此外，該試劑盒還包括雜交盒、雜交液和分析鑒定結(jié)果用的判讀軟件Bactarray Analyzer。
由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明首次將基因芯片技術(shù)引入肺炎鏈球菌分型檢測領(lǐng)域，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的全新的肺炎鏈球菌血清型的基因芯片及其檢測方法，利用本發(fā)明的基因芯片可以達(dá)到檢測常見致病型肺炎鏈球菌血清型的目的，由于操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)，無論對于實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)血清型鑒定還是對于臨床流行病學(xué)研究和診斷都具有重要意義。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，并配合說明書附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為本發(fā)明基因芯片的一個(gè)實(shí)施例的外形示意圖。
圖2為本發(fā)明基因芯片的一個(gè)實(shí)施例上單一點(diǎn)陣探針排布規(guī)律示意圖。
圖3A為利用本發(fā)明基因芯片的一個(gè)實(shí)施例檢測樣品為肺炎鏈球菌5型時(shí)的雜交結(jié)果。
圖3B為利用本發(fā)明基因芯片的一個(gè)實(shí)施例檢測樣品為肺炎鏈球菌7A或7F型時(shí)的雜交結(jié)果。
圖3C為利用本發(fā)明基因芯片的一個(gè)實(shí)施例檢測樣品為肺炎鏈球菌19F型時(shí)的雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說明本發(fā)明的用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片及其檢測方法，特舉以下較佳實(shí)施例進(jìn)行說明，該實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一探針的設(shè)計(jì)和制備1.序列獲得用Artemis軟件整理從Sanger Institute和GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的肺炎鏈球菌16s rDNA序列和不同血清型的wzy(3型為Cap3A)序列。
2.探針設(shè)計(jì)將上述序列導(dǎo)入OligoArray2.0軟件中，參數(shù)設(shè)定如下-n 20；-130；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。運(yùn)行程序在線設(shè)計(jì)探針。
3.探針篩選從輸出結(jié)果中選擇長度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探針，并通過下述實(shí)施例四提供的方法利用雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的探針。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選擇了260條長度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探針，并通過517次雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到如表1所示的探針。其中，編號(hào)為NO.1的探針序列(SEQ ID NO1)選自肺炎鏈球菌的16s rDNA，作為陽性對照用來檢測肺炎鏈球菌種，編號(hào)為NO.2的探針作為熒光探針，編號(hào)為NO.3的探針為多聚T片段，用作陰性對照，編號(hào)NO.4-NO.92(不包括NO.12-NO.15)的85條探針序列(SEQ ID NO2-NO86)選自常見致病型的肺炎鏈球菌血清型(1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型)的K-抗原基因簇上的wzy基因，編號(hào)NO.12-NO.15的4條探針序列選自肺炎鏈球菌血清型3的Cap3A基因。
表1本發(fā)明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測出的血清型





4.探針合成將表1中的探針序列的5’端延長10個(gè)T(表1所示的熒光探針序列中已包含了延長的10個(gè)T)并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。
實(shí)施例二引物的設(shè)計(jì)和制備1.序列獲得用Artemis軟件整理從Sanger Institute和GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的肺炎鏈球菌16s rDNA序列和肺炎鏈球菌不同血清型的wzy(3型為Cap3A)序列。
2.設(shè)計(jì)引物將上述序列導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0軟件中，相應(yīng)參數(shù)設(shè)定如下Search ForPCR Primers，Search typesBoth.SearchRangesSense Primer 1 to 672，Anti-sense Primer 1 to 672，PCR ProductSize100bp to 1000bp.Primer Length20bp±2bp.Search ModeAutomatic.
3.引物選擇從輸出結(jié)果中選取Tm值50℃±5℃、長度20bp±2bp、HairpinNONE、DimerNONE、False PrimingNONE、Cross DimerNONE且包含探針序列在內(nèi)的引物。個(gè)別探針手動(dòng)調(diào)節(jié)，引物適當(dāng)加長或縮短幾個(gè)堿基，使其包含探針、符合Tm值50℃±5℃及其它參數(shù)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選取了既包含探針又適合Multiplex PCR的用于擴(kuò)增23型肺炎鏈球菌血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型)DNA的引物98條，為適應(yīng)Multiplex PCR，經(jīng)生物信息學(xué)初篩并通過大量Multiplex PCR實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出如表2所示的適用引物。
表2用于肺炎鏈球菌待測樣品DNA的PCR擴(kuò)增的引物序列



3.引物合成將表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奧科)合成，備用。
實(shí)施例三基因芯片制備——芯片點(diǎn)樣1.溶解探針將實(shí)施例一中合成的探針分別溶解于50％二甲基亞砜(DMSO)溶液中，使探針的終濃度達(dá)到1μg/μl。
2.加板將溶解好的探針加入384孔板的相應(yīng)位置，每孔10μl。
3.點(diǎn)樣將如圖1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(長×寬×高)的潔凈的醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)放到芯片點(diǎn)樣儀(Spotarray 72)的載物臺(tái)上，使用SpotArray的控制軟件(Tele chem smp3 stealty pin)，運(yùn)行程序，按圖2所示的排布方式點(diǎn)在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，構(gòu)成中低密度DNA微矩陣，玻片上的四個(gè)點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)陣列排布規(guī)律相同。
4.干燥將點(diǎn)好的芯片室溫下過夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小時(shí)。
5.交聯(lián)用交聯(lián)儀(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交聯(lián)2次。將交聯(lián)好的芯片放回潔凈芯片盒中，備用。
由圖2可見，每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)為16(行)×14(列)個(gè)探針點(diǎn)。分散排布的灰色框示意的位置為檢測肺炎鏈球菌的探針，灰色網(wǎng)格框示意的位置為熒光探針，黑色框示意的位置為負(fù)對照探針，其它為各型特異探針(見相應(yīng)的探針編號(hào))。
實(shí)施例四利用基因芯片快速檢測肺炎鏈球菌血清型1.提取基因組將分離到的待測肺炎鏈球菌單菌落用血平板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，按照常規(guī)提取普通革蘭氏陽性菌基因組的方法提取肺炎鏈球菌培養(yǎng)物的基因組DNA。
2.擴(kuò)增靶序列各取上述提取到的100ng/μl基因組DNA 0.5μl加入Multiplex PCR反應(yīng)混合液1、2中，PCR反應(yīng)混合液1、2配方如下表3、4所示。(注以下表3-表6中的PCR buffer、MgCl2、dNTP Mixture，Taq酶均購自Sangon公司)表3Multiplex PCR反應(yīng)混合液1配方

注表中P-3至P-24以及P-1和P-2為表2中所列的引物。
表4Multiplex PCR反應(yīng)混合液2配方

注表中P-25至P-47以及P-1和P-2為表2中所列的引物。
將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94℃5min94℃30sec50℃30sec72℃1min回到第二步，共35個(gè)循環(huán)72℃5min4℃20min3.純化將上述獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用純化柱(MILIPORE公司)純化，具體步驟如下(1)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至純化柱中，加水補(bǔ)足至400μl。
(2)25℃、6000rpm離心15min，丟棄收集管。
(3)將純化柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管中，加入25μl的超純水(Milli_Q)，37℃放置5min。
(4)將純化柱倒置放在1.5ml的離心管上，6000rpm離心2min，收集產(chǎn)物。
4.標(biāo)記樣品取20μl純化產(chǎn)物，分別加入相應(yīng)的標(biāo)記混合液1、2中，標(biāo)記反應(yīng)混合液1、2配方如下表5、6所示。
表5標(biāo)記混合液1配方

注表中P-25至P-47以及P-1和P-2為表2中所列的引物。
表6標(biāo)記混合液2配方

注表中P-25至P-47以及P-1和P-2為表2中所列的引物。
將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94℃5min94℃30sec50℃30sec72℃1min回到第二步，共35個(gè)循環(huán)72℃5min4℃20min5.烘干將標(biāo)記產(chǎn)物置65℃烘箱烘干。
6.雜交向雜交盒(博奧公司)內(nèi)預(yù)加入50μl ddH2O以保持濕度。11μl雜交液(配方如下所示)回溶烘干產(chǎn)物并加在實(shí)施例三中制備的肺炎球菌血清型檢測基因芯片的探針陣列區(qū)域，蓋上定制的蓋片(博奧公司)(注意蓋片和載玻片之間不能有氣泡)，蓋緊雜交盒，40℃水浴鍋中雜交16h。
7.洗滌雜交到時(shí)，取出雜交盒，去除蓋片，將基因芯片依次在洗液A中洗滌3min，洗液B中洗滌3min，洗液C中洗滌90sec，空氣中風(fēng)干。
雜交液配方10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)；6×SSPE洗液A1×SSC(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)；0.1％SDS洗液B0.05×SSC洗液C95％乙醇8.掃描用GenePix personal 4100A生物芯片掃描儀(AXONinstrument)掃描，所用參數(shù)如下軟件及版本GenePix Pro 6.0official name575DF35PMT Gain650掃描分辨率10μm
掃描結(jié)果存為JPG、TIF、GPR格式用本發(fā)明的基因芯片分別檢測樣品為肺炎鏈球菌5型(此型在我國為最常見致病型)、7A型或7F型、19F型(此型在我國、法國及巴西均為常見致病型)時(shí)的雜交掃描結(jié)果分別如圖3A、3B和3C所示。
9.分析判讀對于探針點(diǎn)較少的基因芯片，檢測結(jié)果可由肉眼判斷。然而，對于探針點(diǎn)較多的芯片使用肉眼判斷既不客觀也不現(xiàn)實(shí)。因此，為了客觀、準(zhǔn)確的對檢測芯片的結(jié)果進(jìn)行分析，本發(fā)明開發(fā)了一個(gè)計(jì)算機(jī)判讀程序——BactarrayAnalyzer。
BactarrayAnalyzer基于Microsoft.NET Framwork開發(fā)，是一個(gè)界面友好、易于使用的程序。用戶只需將芯片掃描儀掃描并套圈得到的熒光數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入分析程序，進(jìn)行簡單設(shè)定后點(diǎn)擊處理即可獲得分析結(jié)果。下面對該軟件的處理過程詳述如下在芯片雜交完畢之后，熒光標(biāo)記的目標(biāo)DNA片段已被固定在芯片的特異探針上。使用芯片掃描儀可以看到探針的熒光圖像，熒光的強(qiáng)弱代表著該點(diǎn)雜交情況的優(yōu)劣，也就是目標(biāo)DNA序列片段和該點(diǎn)特異探針DNA序列的相似性。在經(jīng)過套圈分析之后，每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值被讀取并存儲(chǔ)為本程序可處理的熒光強(qiáng)度文件。(不同型號(hào)的掃描儀命名規(guī)則不同，genpix掃描儀存儲(chǔ)為.GPR文件，博奧掃描儀存儲(chǔ)為.LSR文件)本軟件的處理均針對熒光強(qiáng)度文件。
運(yùn)行本發(fā)明的BactarrayAnalyzer軟件，將需要分析的上述熒光強(qiáng)度文件添加到該軟件的指定項(xiàng)目文件夾中，確認(rèn)該項(xiàng)目文件夾中的各項(xiàng)目信息無誤之后點(diǎn)擊“處理”按鈕，程序會(huì)自動(dòng)處理該項(xiàng)目中的所有文件，并生成報(bào)告。最后，在該軟件的“處理記錄”頁面記錄著處理每個(gè)文件的過程中所出現(xiàn)的問題，在“處理結(jié)果”頁面以摘要形式記錄著所有文件的處理結(jié)果，在“檢測報(bào)告”頁面可以瀏覽項(xiàng)目的所有檢測報(bào)告，使用“打印”按鈕即可將最終的分析鑒定結(jié)果打印出來。
實(shí)施例五對基因芯片進(jìn)行特異性鑒定和靈敏度檢測對實(shí)施例三中制備的肺炎鏈球菌血清型檢測基因芯片的特異性進(jìn)行鑒定如下用不同肺炎鏈球菌血清型以及其他細(xì)菌來鑒定實(shí)施例三中制備的肺炎鏈球菌血清型檢測基因芯片的特異性。在該特異性鑒定試驗(yàn)中，使用了常見致病的上述23型菌株135株，與該23型分不開的20個(gè)血清型的肺炎鏈球菌菌株44株，其余47型中11個(gè)型的11株菌株，和13種臨床采樣時(shí)可能混有的菌(唾液鏈球菌、卡他莫拉氏菌、表皮葡萄球菌、微黃奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、銅綠甲單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、嗜麥芽假單胞菌、粘質(zhì)沙雷、變形桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、白色念珠菌)，利用本發(fā)明的基因芯片和上述檢測方法進(jìn)行雜交檢測，均顯示了正確的雜交結(jié)果，符合率達(dá)到100％，這說明本發(fā)明的基因芯片具有良好的特異性。
對實(shí)施例三中制備的肺炎鏈球菌血清型檢測基因芯片的靈敏度進(jìn)行檢測如下該基因芯片的檢測靈敏度經(jīng)過144次雜交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，50ng的微量基因組DNA就可保證上述23型常見肺炎鏈球菌具有穩(wěn)定、良好的雜交結(jié)果，這說明本發(fā)明的基因芯片具有很高的檢測靈敏度。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其較佳實(shí)施例的描述，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可以做出各種可能的等同改變或替換，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
序列表SEQUENCE LISTING<110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片及其檢測方法和檢測用試劑盒<130>5P99001-CN<160>129<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae<400>1gctaggtgtt agaccctttc cggggttta29<210>2<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>2ttgtatcagc tagtcgtaat ttacagattc tgatat36<210>3<211>36
<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>3tatacgggat gctgatatat ctgtatatga taccta36<210>4<211>31<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>4atatggtttt actcttgtgg gagagggata t 31<210>5<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>5attacataat atgggcaatt atttcgaagg tcg 33<210>6<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>6gtcaacgtat tggaactctt agaaattggg aaaat 35
<210>7<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>7ttccttattg atactggggt tattggctta tttat 35<210>8<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>8tatactacag ctgattcaac agtgacaagt ttcc 34<210>9<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>9actataaagg ctattattgg gtcaggattt gg32<210>10<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4<400>10tacctaattt tgataatgat cctaacagga agtcgt36
<210>11<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4<400>11gaatatggga tgacatttct acgcactatc cta 33<210>12<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4<400>12cgttggtttt agtatacaca caatctttag gga 33<210>13<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4<400>13aatgatccta acaggaagtc gtaaaatcca gg32<210>14<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>14ttattctcaa cttgtctcta tataatcgca agtg 34
<210>15<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>15tttgctaaag aaatttcagg acatgaatta acag 34<210>16<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>16gttttctcaa ttatggttat atagtaggga ctgct 35<210>17<211>31<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>17tgaatatcga ccatctagtc tgactttgga c 31<210>18<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>18tttatttgtt atagatccga tacgacgtaa caa 33
<210>19<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>19atgagatgct tgcaaaatta ggatttgaca ata 33<210>20<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>20tctttctttt aaaatttgta ttagggcgct cc32<210>21<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>21attttatcag ttacatcact cgttatatgg gaggttc 37<210>22<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F<400>22ttatttggct attcaacagg aaactattca actagt36
<210>23<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F<400>23ggtcggttaa gttcaattgt tcaaataatc tcaact36<210>24<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F<400>24taatatctat cacttgcata gtggtggtcg 30<210>25<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F<400>25acgtagctgc tttgtcagag ttaaagatta 30<210>26<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8<400>26ttgttgaaaa tcttgaactt agatggatag gata 34
<210>27<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8<400>27tttgattcgt tttattcctt cttgatgagt aatg 34<210>28<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8<400>28gggtcaatat gttgataaag aaattgtttg ggatc 35<210>29<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8<400>29acgcagacta gaacagctct actagtatct atagta36<210>30<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N<400>30cgactttatt tgctttgctt tctactttag ttaagc36
<210>31<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N<400>31agcataaagt aacactgatt gatattctag ttgttc36<210>32<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N<400>32aaacgttgta ccttaactat gttggaggtc 30<210>33<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N<400>33ttcccaaagt tcttttacag cataaagtaa cactg 35<210>34<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V<400>34gtcagacagt gaatcttaac tatattggag gaca 34
<210>35<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V<400>35gttaactccg cacacaatac cttactagat ata 33<210>36<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V<400>36tgcgtatgtt aggtttaaag gaaaatatag gaaaacc 37<210>37<211>38<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Type 9V<400>37cgggtatttt atttgtagtg gttcttctaa gtctattt 38<210>38<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A<400>38ttattggttt aaggttctta tttccattaa tcaaga36
<210>39<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A<400>39ttggcgtttt agttttgtta caatgactta ttatgt36<210>40<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A<400>40accatatggt atttgttgcc tgtaggtatc 30<210>41<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A<400>41ttaagaaaac tattctggaa aagaggaagg aagata36<210>42<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A<400>42ggtttgtttg gctttcaatt taaacttccg 30
<210>43<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A<400>43tgttgtaact tttattgcat ctgttgtgat gttag 35<210>44<211>40<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>44aataagaact gctatgaaat ttaagttcct tttctcattt40<210>45<211>40<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>45tctttatctt attatgccat gacagcttat atgattaatg40<210>46<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>46gacgtatttc agattctcag cgtggaattt tatt 34
<210>47<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>47agttcctttt ctcatttatt ggaggcctgt 30<210>48<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14<400>48tagcatttgc agtagtcaat gagattaatt caaac 35<210>49<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14<400>49ttcttctaga ggttttggta ctaagcaaat ctag 34<210>50<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14<400>50cggtttattc tatatacaaa gaggctccaa tgta 34
<210>51<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>51atgattgtag cgttttatcc aactatacct cttata36<210>52<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>52atctcttaaa gctattaatg ggctgggaat 30<210>53<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>53tcaagaacag gtagtaatgt gacacgtttt atag 34<210>54<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>54gtagtattgt ttggaagaag cttattaggt tgg 33
<210>55<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>55tagtacctct tgtcaaatac atacttaccc ct32<210>56<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>56acccatgctc ataataactt tcttcaagtt tt32<210>57<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>57ccatatatta gggaattttc ctggttggat ttg 33<210>58<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>58tctacgttga gttttctaat tgtagttact ggt 33
<210>59<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>59tcgttctttt gagtgtatta attatcatac cagta 35<210>60<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>60taatattaat tcgatggcta gaacagattt atgg 34<210>61<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>61tttgaagtac tacattgaga taggatttgt aggat 35<210>62<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>62tgaatatcaa tggtcttaca gggacaatgg 30
<210>63<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>63ctacctttta ctattcttta ttcttatctg gacgt 35<210>64<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>64ggttcgattc agcattttaa tcagtatatt caaaa 35<210>65<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>65ttgtagctat tatgaatatt ttgggtaatc ttggct36<210>66<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>66gctctaaaga tttactgctc ttagttccat tctt 34
<210>67<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F<400>67aattcattta gaatttcgga cactaggagt tactg 35<210>68<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F<400>68attggtgcct atattaaata tattagggga aatgggc 37<210>69<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F<400>69tttcggacac taggagttac tgtaggaaat gtttata 37<210>70<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F<400>70tatctaggag gctcaattca gcattttaat cagtat36
<210>71<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>71cgttattata caggagcata tgataaacaa caccaa36<210>72<211>34<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>72acttcctact ccatcaagaa ctatttatat gttt 34<210>73<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>73actattcaca atcgttatgt gtttatcggt atttct36<210>74<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>74ctgggtctga atttgtatct cgaataatac tacatt36
<210>75<211>32<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F<400>75tccccaatac tattagaaaa gtggagtagt at32<210>76<211>30<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F<400>76gaagcataca caatgattgc gaatactgat 30<210>77<211>35<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F<400>77tttatctagg acaacaacct ccgmatag gattc 35<210>78<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F<400>78tgctaggttc aattatctta tggctatcaa ctttat36
<210>79<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F<400>79tttaagaagg atatcatatt acttattgca cagcat36<210>80<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Type 23F<400>80gctaaacatc agattgatag ttttgtatta tggtta36<210>81<211>31<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F<400>81tcagcagaaa atatgacgct aaacatcaaa t 31<210>82<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F<400>82ccaccttacc gataaagcta ataaataatc tcagtg36
<210>83<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F<400>83ggggtttata taataggttt gattttccta tatgttt 37<210>84<211>37<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F<400>84ccattgaaca acatatggat agaactgtta gatataa 37<210>85<211>33<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F<400>85cagaaaagtc ctatttgggg attaggtatt tca 33<210>86<211>36<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Type<400>86caatattatg ggataataaa tctggaactg gttcag36
<210>87<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>87attaagtggg caagtttca 19<210>88<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>88cgttatggac tggctgatg 19<210>89<211>18<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4<400>89cagttagagc ggcgaata18<210>90<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>90attattccag cgactacac 19
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<210>95<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>95ttgtatggct agttcttcta 20<210>96<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F<400>96agcacctatg tggagtttg 19<210>97<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1<400>97caataaccaa tgttcccaat 20<210>98<211>20<212>DNA<213>streptococcus pneumoniae Serotype 2<400>98gataaataag ccaataaccc 20
<210>99<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Type 4<400>99caccaccata gtaaccaaag 20<210>100<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B<400>100actctccatt ctaagcctt 19<210>101<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F<400>101tctgccaaac atctccata 19<210>102<211>22<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8<400>102agactgataa gataagtagc ca 22
<210>103<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N<400>103atcccaatag acgtatgaaa 20<210>104<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V<400>104atgtagcctc catcgtaat 19<210>105<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F<400>105caaatcctaa atatcctcc 19<210>106<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F<400>106gtaatacgaa gccaacatt 19
<210>107<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>107tcctgttggg agtagtgtct 20<210>108<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A<400>108gtgcgactac gacccttat 19<210>109<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A<400>109taagtgggtc aatcggtgtt 20<210>110<211>21<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>110tcctagaaac agcattatta c21
<210>111<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14<400>111tttgtatggt gctatggac 19<210>112<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>112tatgttcaaa gaggcgctaa 20<210>113<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>113ctttaggcag ggaggactt 19<210>114<211>18<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>114cgccagttgt catgtctg18
<210>115<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F<400>115ttcaacgact aggacgctat 20<210>116<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>116tatcaggaat acgccaatc 19<210>117<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Type 22F<400>117agatgctggt agaacgcct 19<210>118<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F<400>118atttctagct tatccacctt 20
<210>119<211>18<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5<400>119tgcggaaacg atgagaag18<210>120<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A<400>120ttgaacccat agataacag 19<210>121<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A<400>121atttattcca acttctccc 19<210>122<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F<400>122caaatccaaa ccttttgtaa 20
<210>123<211>21<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14<400>123tagggattcc tcatacactc t21<210>124<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B<400>124tctgattcct gctccaagt 19<210>125<211>22<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C<400>125aatcctacaa atcctatctc aa 22<210>126<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A<400>126gttgtaaacg agtattgctc 20
<210>127<211>19<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20<400>127tgtggtacgg tagtgtttc 19<210>128<211>20<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F<400>128aaaggcacca tatagaaggg 20<210>129<211>18<212>DNA<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F<400>129cccttcgtcg tatttcca18
權(quán)利要求
1.一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，其特征是包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針包括從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段和從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，其特征是上述肺炎鏈球菌不同血清型包括1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，其特征是上述從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段分別具有如SEQ ID NO2-NO86所示的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片，其特征是上述從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段具有如SEQ IDNO1所示的堿基序列。
5.一種檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，其特征是包括以下步驟(1)根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA和肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；(2)按常規(guī)方法制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟(1)中的引物對待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化靶序列；(3)標(biāo)記步驟(2)中得到的靶序列；(4)將標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；(5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號(hào)并分析鑒定雜交結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，其特征是上述步驟(1)中根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA設(shè)計(jì)的上游引物序列為5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列為5’-CCGTCAATTCATTTAAGTTT-3’、5’-CGTCAATTCATTTGAGTTT-3’、5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，其特征是上述步驟(1)中根據(jù)肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)的引物分別具有如SEQ ID NO87-NO129所示的堿基序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，其特征是上述步驟(5)中使用判讀軟件BactarrayAnalyzer分析鑒定雜交結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測肺炎鏈球菌血清型的方法，其特征是使用上述判讀軟件BactarrayAnalyzer按下列步驟分析鑒定雜交結(jié)果(1)雜交信號(hào)的有效性驗(yàn)證對上述基因芯片上每條特異探針的多個(gè)重復(fù)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行置信度檢驗(yàn)，剔除異常的信號(hào)強(qiáng)度，取正常的信號(hào)強(qiáng)度的平均值作為每條特異探針的信號(hào)強(qiáng)度；(2)歸一化使用上述基因芯片上全部特異探針的總信號(hào)強(qiáng)度值作為歸一化標(biāo)準(zhǔn)，然后用每個(gè)探針點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度除以該歸一化標(biāo)準(zhǔn)，將每個(gè)探針點(diǎn)的絕對信號(hào)強(qiáng)度變?yōu)橄鄬π盘?hào)強(qiáng)度；(3)對每條特異探針打分針對每條特異探針給出一個(gè)分值，代表待測的DNA片段序列和該特異探針序列的相似程度；(4)應(yīng)用模式對待測樣品中可能含有的血清型進(jìn)行打分(5)判斷樣品中可能含有的血清型經(jīng)過上述步驟的處理，程序給樣品中所有可能的肺炎鏈球菌血清型均給出一個(gè)分值，分值最高的即為最有可能存在的血清型，分值低于閾值的血清型不可能存在。
10.一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的試劑盒，其特征是包括基因芯片，其包含固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針包括從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段和從肺炎鏈球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段；PCR擴(kuò)增引物，根據(jù)肺炎鏈球菌16s rDNA和肺炎鏈球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列設(shè)計(jì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于肺炎鏈球菌血清型檢測的試劑盒，其特征是還包括雜交盒、雜交液和分析鑒定結(jié)果用的判讀軟件Bactarray Analyzer。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于肺炎鏈球菌血清型檢測的基因芯片及其檢測方法和檢測用試劑盒，其中基因芯片包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，該寡聚核苷酸探針包括從肺炎鏈球菌16s rDNA中選取的DNA片段和從肺炎鏈球菌不同血清型K－抗原基因簇上聚合酶基因中選取的DNA片段。利用設(shè)計(jì)的引物將待檢測樣品基因組DNA擴(kuò)增并標(biāo)記后，用上述基因芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)，可檢測出肺炎鏈球菌的不同血清型。上述基因芯片、引物可以制成用于肺炎鏈球菌血清型檢測的試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片可達(dá)到檢測肺炎鏈球菌血清型的目的，操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)，對于實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)血清型鑒定和臨床流行病學(xué)研究和診斷都具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1710108SQ200510085480
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者王磊, 王荃, 王敏, 馮露 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司