專利名稱：一種能夠無光照異養(yǎng)生長小球藻的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種能夠無光照異養(yǎng)生長的小球藻-USTB01(Chlorella-USTB01)(cgmcc No1448，保藏日期2005年8月25日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)及培養(yǎng)方法。采用無光照異養(yǎng)批量或發(fā)酵培養(yǎng)，在3～6天時間內(nèi)可以培養(yǎng)出藻細胞干重濃度達到20～50g/L的小球藻培養(yǎng)物。收獲小球藻細胞并加工處理后，可以作為一種人類健康食品。
背景技術(shù)：
小球藻屬有大約10種小球藻，都富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素和小球藻因子等多種重要生命活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值和提高免疫力的功能，已被列為二十一世紀人類的健康食品。隨著人們生活水平的日益提高，對小球藻的需求會越來越大。
一般認為小球藻屬于低等植物，主要吸收無機碳通過光合作用合成有機物。但采用光照自養(yǎng)培養(yǎng)方法，當(dāng)藻細胞濃度增加到一定數(shù)量后，必然阻擋光線進人培養(yǎng)物內(nèi)，使培養(yǎng)出的藻細胞濃度很低。但進入二十世紀七十年代以來，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有些小球藻可以在無光照條件下生長于有機物，不僅大幅度提高了小球藻的生長速度，而且獲得了很大的藻生物量，從而引起了單細胞藻類培養(yǎng)的一次重要革命。雖然國外和我國香港學(xué)者在利用異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)葉黃素方面進行了大量的研究，但因為真正能夠異養(yǎng)快速生長的小球藻種類非常稀少，我國大陸目前研究使用的異養(yǎng)小球藻種全部由國外或我國香港引進。因此有必要在大陸依據(jù)我們的實驗條件和研究能力，篩選出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)能夠異養(yǎng)生長的小球藻種并研究確定異養(yǎng)培養(yǎng)超高細胞濃度小球藻的方法。在此研究領(lǐng)域我們經(jīng)過艱苦的努力與探索，終于成功篩選出了一株能夠無光照異養(yǎng)生長并可以培養(yǎng)到很高細胞濃度的小球藻種-USTB01(cgmcc No1448，保藏日期2005年8月25日)，在異養(yǎng)批量和發(fā)酵培養(yǎng)條件下，在120小時內(nèi)可以培養(yǎng)獲得藻細胞干重濃度分別達到了20-35g/L和30-50g/L的水平，具有重要的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。
據(jù)我們研究發(fā)現(xiàn)，此篩選出的小球藻-USTB01既可以采用光照自養(yǎng)培養(yǎng)，也可以采用無光照異養(yǎng)培養(yǎng)。在無光照搖床批量培養(yǎng)時，120小時獲得了藻細胞干重濃度為20-35g/L的藻生物量。在50升發(fā)酵罐流加碳源培養(yǎng)時，120小時培養(yǎng)出了藻細胞干重濃度為30-50g/L的小球藻發(fā)酵液。應(yīng)用我們篩選出的小球藻種-USTB01和培養(yǎng)控制方法，能夠培養(yǎng)出大量的小球藻細胞，經(jīng)過收獲藻細胞、干燥和壓片等工藝，可以生產(chǎn)出人類健康食品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于篩選出能夠異養(yǎng)生長小球藻種，并確定獲得超高細胞濃度小球藻的優(yōu)化培養(yǎng)控制條件，使培養(yǎng)出的藻細胞干重濃度達到了20-50g/L，以解決小球藻很難培養(yǎng)出超高細胞濃度的問題，實現(xiàn)超高細胞濃度小球藻培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明實驗所用藻種為一株我們自己篩選的能夠無光照異養(yǎng)生長的小球藻-USTB01(Chlorella sp)，cgmcc No1448，保藏日期2005年8月25日。
在篩選異養(yǎng)生長小球藻的研究工作中，我們從含有綠藻的天然水體中篩選出了能夠在無光照條件下生長于乙酸鈉或葡萄糖的異養(yǎng)小球藻種-USTB01(Chlorella sp)，cgmccNo1448，保藏日期2005年8月25日。經(jīng)在放大1600倍下的顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)此篩選藻種細胞圓形，具有小球藻特有的杯狀色素體，細胞直徑在3-10微米范圍。具體工藝為1、小球藻篩選和培養(yǎng)用培養(yǎng)基其組成如下(1000ml去離子水中)葡萄糖10.0～80g，尿素1.0～5.0g，MgSO47H2O 0.5～2.0g，KH2PO40.1～1.0g，K2HPO42.0～10.0g，NaCl 0.1～5.0g，CaCl210.0～50.0mg，F(xiàn)eSO41.0～10.0mg，ZnCl21.0～10.0mg，MnCl24H2O 1.0～10.0mg，CuCl20.1～1.0mg。此配制的培養(yǎng)基初始pH為7.0～8.0。將配制好的液體培養(yǎng)基放入三角瓶，將瓶口用脫脂棉封閉后在高溫(120～130℃)高壓(0.10～0.18MPa)下滅菌10～30分鐘，然后在潔凈工作臺內(nèi)紫外線照射滅菌10～30分鐘后使用。
2、異養(yǎng)小球藻種的篩選在液體培養(yǎng)基中加入1.0～2.0％(重量/體積)的瓊脂，經(jīng)過高溫(120～130℃)高壓(0.10～0.18MPa)溶解后倒入到培養(yǎng)皿中冷卻，可以制備出小球藻的對應(yīng)固體培養(yǎng)基平板。取采自于天然水體含有綠藻的水樣，經(jīng)離心機離心后倒去上清液，用滅菌后的液體培養(yǎng)基振蕩懸浮保留在離心管底部的藻細胞，然后再經(jīng)過離心后倒去上清液。重復(fù)3～5次清洗離心藻細胞后，用液體培養(yǎng)基將沉于離心管底部的藻細胞懸浮，吸取藻細胞懸浮液加入到培養(yǎng)皿上的固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻后放在溫度20～35℃無光照條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5～10天后，可以在固體培養(yǎng)基表面觀察到長出的綠色單克隆藻菌落，用接種針調(diào)取單克隆藻菌落重新接種于液體培養(yǎng)基中，再次進行涂平板篩選綠色藻單克隆菌落。采用這種方法，經(jīng)多次重復(fù)后，我們終于篩選出了一株能夠異養(yǎng)生長的小球藻種-USTB01，其液體培養(yǎng)物綠色。經(jīng)在放大1600倍下的顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)此篩選藻種細胞圓形，具有小球藻特有的杯狀色素體，細胞直徑在3-10微米。
3、小球藻的無光照異養(yǎng)批量培養(yǎng)在潔凈工作臺內(nèi)，接種小球藻培養(yǎng)物于裝在三角瓶內(nèi)已滅菌的液體培養(yǎng)基中后進行無光照異養(yǎng)批量培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件是振蕩轉(zhuǎn)速100～300轉(zhuǎn)/分，溫度20-35℃；連續(xù)培養(yǎng)3～6天獲得較高的藻生物量，藻細胞干重濃度達到20-35g/L。
4、小球藻的無光照異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中，經(jīng)120～130℃的高溫滅菌并冷卻后，接種小球藻培養(yǎng)物后進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)條件是攪拌轉(zhuǎn)速200～800轉(zhuǎn)/分，通空氣供給氧氣，通過全自動流加NaOH或HCl溶液，使pH控制在6.0～9.0之間，溫度通過恒溫循環(huán)水保持在20～35℃；培養(yǎng)1天以后，每天通過蠕動泵流加滅菌后的葡萄糖溶液，培養(yǎng)3～6天獲得小球藻細胞干重濃度達到30～50g/L的小球藻培養(yǎng)物。經(jīng)進一步采用大型發(fā)酵罐培養(yǎng)后，可以進行異養(yǎng)小球藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
5、小球藻人類健康食品的生產(chǎn)采用無光照異養(yǎng)批量或發(fā)酵培養(yǎng)小球藻的方式，可以獲得大量的小球藻細胞。通過離心收獲藻細胞、干燥藻細胞和小球藻干粉壓片等工藝，可以生產(chǎn)出作為人類健康食品的小球藻片。
本發(fā)明采用異養(yǎng)無光照批量培養(yǎng)條件，120小時可以使藻細胞干重濃度達到31.2g/L(圖1)，遠遠高于國外引進藻種批量培養(yǎng)獲得小球藻細胞干重濃度為10g/L左右的水平。采用50升發(fā)酵罐通過流加葡萄糖進行異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)，在120小時可以培養(yǎng)獲得藻細胞干重濃度達到41.2g/L的小球藻發(fā)酵液(圖1)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用異養(yǎng)批量或發(fā)酵培養(yǎng)篩選的小球藻-USTB01，可以在120小時使培養(yǎng)出的藻細胞干重濃度達到20-50g/L，整個培養(yǎng)過程完全在人為可控制的溫度和無菌條件下進行，解決了采用池塘培養(yǎng)小球藻細胞濃度低、容易受雜菌污染和受天氣變化影響大的缺點。將培養(yǎng)出的小球藻細胞經(jīng)過收獲、干燥和壓片后，可以作為人類健康食品或醫(yī)藥品進行應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明采用無光照異養(yǎng)批量和發(fā)酵培養(yǎng)下，小球藻-USTB01的生長動力學(xué)過程。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間小時，縱坐標(biāo)為小球藻培養(yǎng)物中的藻細胞干重濃度g/L。
具體實施例方式
1、異養(yǎng)小球藻篩選和培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基其組成如下(1000ml去離子水中)葡萄糖10.0g，尿素3.0g，MgSO47H2O 1.0g，KH2PO40.5g，K2HPO44.0g，NaCl 1.0g，CaCl220.0mg，F(xiàn)eSO45.0mg，ZnCl25.0mg，MnCl24H2O 5.0mg，CuCl20.5mg。此配制的培養(yǎng)基初始pH為7.5左右。用500毫升三角瓶加入配制好的液體培養(yǎng)基100毫升，將瓶口用脫脂棉封閉后在高溫(124℃)高壓(0.15MPa)下滅菌10分鐘，然后在潔凈工作臺內(nèi)紫外線照射滅菌20分鐘后使用。
2、異養(yǎng)小球藻種的篩選在液體培養(yǎng)基中加入1.5％(重量/體積)的瓊脂，經(jīng)過高溫高壓溶解后倒入到培養(yǎng)皿中冷卻，可以制備出小球藻的對應(yīng)固體培養(yǎng)基平板。取采自于清河含有綠藻的水樣100ml，經(jīng)離心(5000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)后倒去上清液，用10ml滅菌的液體培養(yǎng)基振蕩懸浮保留在離心管底部的藻細胞，然后再經(jīng)過離心(5000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)后倒去上清液。重復(fù)3次后，用5ml液體培養(yǎng)基將沉于離心管底部的藻細胞懸浮，吸取0.3ml藻細胞懸浮液加入到培養(yǎng)皿上的固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻后放入培養(yǎng)箱中在溫度30℃無光照條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，可以在固體培養(yǎng)基表面觀察到長出的綠色單克隆藻菌落，用接種針調(diào)取單克隆藻菌落后，重新接種于液體培養(yǎng)基中，再次進行涂平板篩選綠色藻單克隆菌落。采用這種方法，我們終于篩選出了一株能夠異養(yǎng)生長的小球藻種-USTB01，經(jīng)在放大1600倍下的顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)此篩選藻種細胞圓形，具有小球藻特有的杯狀色素體，細胞直徑在3～10微米。
3、小球藻的無光照異養(yǎng)批量培養(yǎng)小球藻液體培養(yǎng)基中葡萄糖濃度增加到70g/L，其它化合物組成和用量相同。在潔凈工作臺內(nèi)無菌條件下，接種1ml小球藻液于裝在100ml三角瓶內(nèi)的20ml液體培養(yǎng)基中，在恒溫旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)箱中進行批量培養(yǎng)，條件是轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，溫度30℃。小球藻生長的動力學(xué)過程見圖1，在120小時獲得了31.2g/L的藻細胞干重濃度。
4、小球藻的無光照異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中葡萄糖初始濃度增加到20g/L，其它化合物組成和用量相同。采用50升發(fā)酵罐，首先加入20升液體培養(yǎng)基，經(jīng)124℃20分鐘滅菌并冷卻后，接種1000ml小球藻液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是攪拌轉(zhuǎn)速從開始時的200轉(zhuǎn)/分逐漸增加到800轉(zhuǎn)/分，通空氣量20升/分，通過全自動流加10％NaOH或10％HCl使pH控制在7.5-8.0之間，通過恒溫循環(huán)水保持溫度在30℃。實驗開始24小時后，每24小時通過蠕動泵流加滅菌后90％(重量/體積)葡萄糖溶液450ml。圖1顯示了異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)小球藻生長的動力學(xué)過程，培養(yǎng)120小時可獲得小球藻細胞干重濃度達到41.2g/L的小球藻發(fā)酵液。經(jīng)進一步采用更大型發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)后，可以實現(xiàn)小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
5、小球藻人類健康食品的生產(chǎn)采用無光照異養(yǎng)批量或發(fā)酵培養(yǎng)小球藻的方式，可以獲得大量的小球藻細胞。通過離心收獲藻細胞、干燥藻細胞和小球藻干粉壓片等工藝，可以生產(chǎn)出作為人類健康食品的小球藻片。
綜上所述，本發(fā)明是在篩選出能夠異養(yǎng)生長小球藻種的基礎(chǔ)上，利用無光照異養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)，可以培養(yǎng)獲得超高細胞濃度的小球藻，在發(fā)展藻類生物技術(shù)和人類健康食品的生產(chǎn)方面都具有非常重要的意義和價值。
權(quán)利要求
1.一種能夠無光照異養(yǎng)生長小球藻種的篩選和無光照異養(yǎng)培養(yǎng)的方法，其特征在于具體工藝為a、小球藻篩選和培養(yǎng)用培養(yǎng)基小球藻培養(yǎng)基(1000ml去離子水中)組成葡萄糖10.0～80g，尿素1.0～5.0g，MgSO47H2O 0.5～2.0g，KH2PO40.1～1.0g，K2HPO42.0～10.0g，NaCl 0.1～5.0g，CaCl210.0～50.0mg，F(xiàn)eSO41.0～10.0mg，ZnCl21.0～10.0mg，MnCl24H2O 1.0～10.0mg，CuCl20.1～1.0mg；此配制的培養(yǎng)基初始pH為7.0～8.0，將配制好的液體培養(yǎng)基放入三角瓶，將瓶口用脫脂棉封閉后在120～130℃高溫、0.10～0.18MPa高壓下進行滅菌10～30分鐘，然后在潔凈工作臺內(nèi)紫外線照射滅菌10～30分鐘，待溫度降低到20～35℃后使用；b、異養(yǎng)小球藻種的篩選在液體培養(yǎng)基中加入1.0～2.0％(重量/體積)的瓊脂，經(jīng)過120～130℃高溫、0.10～0.18MPa高壓下進行滅菌后倒入到培養(yǎng)皿中冷卻，制備出小球藻的對應(yīng)固體培養(yǎng)基平板；取采自于天然水體含有綠藻的水樣，經(jīng)離心機離心后倒去上清液，用滅菌后的液體培養(yǎng)基懸浮沉淀于離心管底部的藻細胞，然后再經(jīng)過離心機離心后倒去上清液；重復(fù)3～5次后，用液體培養(yǎng)基將沉于離心管底部的藻細胞懸浮，吸取藻細胞懸浮液加入到培養(yǎng)皿上的固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻后放在溫度20～35℃無光照條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)5～10天后，在固體培養(yǎng)基表面可以觀察到長出的綠色單克隆藻菌落，用接種針調(diào)取單克隆藻菌落重新接種于液體培養(yǎng)基中，再次進行涂平板篩選綠色藻單克隆菌落；采用這種方法，經(jīng)多次重復(fù)后，篩選出了一株能夠異養(yǎng)生長的小球藻種-USTB01，其液體培養(yǎng)物綠色，細胞直徑在3-10微米；c、小球藻的無光照異養(yǎng)培養(yǎng)在無菌條件下，接種小球藻培養(yǎng)物于裝在三角瓶內(nèi)的滅菌后液體培養(yǎng)基中進行無光照異養(yǎng)批量培養(yǎng)，其條件是振蕩轉(zhuǎn)速100～300轉(zhuǎn)/分，溫度20-35℃；連續(xù)培養(yǎng)3～6天后獲得較高的藻生物量，藻細胞干重濃度達到20-35g/L；d、小球藻的無光照異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中，經(jīng)120～130℃的高溫滅菌并冷卻后，接種藻培養(yǎng)物后進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)條件是攪拌轉(zhuǎn)速200～800轉(zhuǎn)/分，通空氣供給氧氣，通過全自動流加NaOH或HCl溶液，使pH控制在6.0～9.0之間，溫度通過恒溫循環(huán)水保持在20～35℃；實驗開始第1天以后，每天通過蠕動泵流加滅菌后的葡萄糖溶液，培養(yǎng)3～6天獲得小球藻細胞干重濃度達到30～50g/L的小球藻培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠無光照異養(yǎng)生長的小球藻種及培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采用無光照異養(yǎng)批量和發(fā)酵培養(yǎng)方法，可以在3～6天時間內(nèi)培養(yǎng)出小球藻－USTB01 cgmcc No1448，保藏日期2005年8月25日，細胞干重濃度達到20～50g/L的小球藻培養(yǎng)物。本發(fā)明的優(yōu)點在于將培養(yǎng)出的小球藻－USTB01細胞經(jīng)過離心、干燥和壓片后可以作為人類健康食品或醫(yī)藥品。
文檔編號C12N1/12GK1766082SQ200510086288
公開日2006年5月3日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日
發(fā)明者閆海, 王素琴, 張賓, 李迎霞, 呂樂 申請人:北京科技大學(xué)