專利名稱：一種高產(chǎn)桿狀病毒的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲(chóng)細(xì)胞系，尤其是一種來(lái)源于昆蟲(chóng)脂肪體組織，并且對(duì)桿狀病毒高敏感的細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及該細(xì)胞系的建立方法，以及該細(xì)胞系在桿狀病毒規(guī)模化生長(zhǎng)上的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，在1965年第一株昆蟲(chóng)細(xì)胞系成功建立后至今，近40年的時(shí)間內(nèi)，已經(jīng)建立的昆蟲(chóng)細(xì)胞系超過(guò)500種。它們分別來(lái)源于鱗翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多種昆蟲(chóng)，其中大部分來(lái)源于鱗翅目和雙翅目昆蟲(chóng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞系作為研究材料，一直是生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等科學(xué)研究的重要工具，而且昆蟲(chóng)細(xì)胞作為桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的重要組成部分，表達(dá)了大量的具有重大經(jīng)濟(jì)意義或科學(xué)意義的外源蛋白質(zhì)；同時(shí)作為生物反應(yīng)器，擴(kuò)增昆蟲(chóng)桿狀病毒用作生物殺蟲(chóng)劑，特別是擴(kuò)增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲(chóng)劑，昆蟲(chóng)細(xì)胞也發(fā)揮了重要的作用。
大量的來(lái)源于鱗翅目昆蟲(chóng)商品化的細(xì)胞系已得到人們廣泛的應(yīng)用，比如，來(lái)源于草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，來(lái)源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名為High Five)等，已經(jīng)成功的應(yīng)用于表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白。
鱗翅目的細(xì)胞系來(lái)源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細(xì)胞、脂肪體等。然而，值得一提的是，由于昆蟲(chóng)細(xì)胞不完全的去分化，有的已經(jīng)建立的昆蟲(chóng)細(xì)胞系仍然保持一定原始組織和器官的特征。來(lái)源于不同種類昆蟲(chóng)的細(xì)胞系或來(lái)源于同一種昆蟲(chóng)不同組織部位的細(xì)胞系擴(kuò)增病毒或重組蛋白的表達(dá)能力各有不同。因此建立和篩選新的、更多的桿狀病毒敏感細(xì)胞系(株)是一項(xiàng)非常有必要而且有理論和實(shí)踐意義的工作。
到目前為止，來(lái)自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的細(xì)胞系共有4株。Gelernter和Federici(Gelernter，W.D.and B.A.Federici J.Invertebr.Pathol.1986，48199～207)從剪碎的甜菜夜蛾初孵幼蟲(chóng)組織中，建立了甜菜夜蛾第一個(gè)細(xì)胞系UCR-SE-1。經(jīng)克隆形成法，他們又從UCR-SE-1細(xì)胞系中分離了SE-UCR-1A細(xì)胞系。在SE-UCR-1A細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，Mccarthy和Mckedy(Mccarthy W J，Mckedy D.Dev.Biol.，1990，26(8)824～828)篩選獲得一個(gè)缺失了核苷激酶的細(xì)胞系。Hara等(Hara，K.，K.Tsuda，M.Funakoshi and T.Kawarabata In Vitro Cell. Dev.Biol.1993，29A(12)904～907)也從甜菜夜蛾初孵幼蟲(chóng)組織中建立了第二株細(xì)胞系Se3FH。Se3FH對(duì)SeNPV敏感，生長(zhǎng)速度比UCR-SE-1快。經(jīng)克隆分離的Se301細(xì)胞系100％能被SeNPV感染，生長(zhǎng)速度比Se3FH快，產(chǎn)生的空斑比Se3FH大。第三株Le-H-HNU7細(xì)胞系是通過(guò)甜菜夜蛾血細(xì)胞建立的，該細(xì)胞系對(duì)斜紋夜蛾核多角體病毒敏感。第四株SeHe920-1a細(xì)胞系也是來(lái)源于甜菜夜蛾血細(xì)胞，接入微孢子蟲(chóng)(Vairimorpha sp.)的孢子后，比其它來(lái)源于鱗翅目昆蟲(chóng)非血細(xì)胞的細(xì)胞系具有更高的感染細(xì)胞能力。其12個(gè)克隆株SeHe920Y1至SeHe920Y12中SeHe920Y7感染微孢子蟲(chóng)的能力最強(qiáng)。
盡管前述文獻(xiàn)已有甜菜夜蛾細(xì)胞系的有關(guān)報(bào)道，然而到目前為止，還沒(méi)有來(lái)源于甜菜夜蛾脂肪體的細(xì)胞系。昆蟲(chóng)的脂肪體同哺乳動(dòng)物的肝臟具有相似的功能，是重要的生理代謝組織，也是是桿狀病毒主要的侵染、復(fù)制部位之一。更多種類的昆蟲(chóng)細(xì)胞系仍存在很大的需求，建立新的來(lái)源于昆蟲(chóng)脂肪體的細(xì)胞系，構(gòu)建更加高效的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是十分有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的甜菜夜蛾脂肪體組織來(lái)源的并具有高度病毒敏感性的細(xì)胞系，該細(xì)胞系名稱為Spex II，已于2005年7月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1411。
本發(fā)明的另一目的在于提供該細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供該細(xì)胞系在桿狀病毒的大規(guī)模生產(chǎn)及使用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白上的用途。
本發(fā)明利用甜菜夜蛾幼蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，采用一種能夠快速建立昆蟲(chóng)細(xì)胞系的方法，建成了一株對(duì)甜菜夜蛾核型多角體病毒高敏感的甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞系，命名為Spex II。保藏號(hào)為CGMCC No.1411。
本發(fā)明建立該細(xì)胞系的具體方法如下(1)將甜菜夜蛾末齡幼蟲(chóng)浸沒(méi)在乙醇溶液中10-20分鐘，進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌蒸餾水清洗昆蟲(chóng)，再吸干蟲(chóng)體表面；(2)解剖昆蟲(chóng)，取出完整甜菜夜蛾脂肪體組織；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織2-3次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗，清洗后把該組織放入含有1mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤(rùn)洗過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27℃無(wú)光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；(4)加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒(méi)在該培養(yǎng)液中，在與步驟(3)同樣條件下培養(yǎng)；(5)每7-10天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴(kuò)展并開(kāi)始增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；(6)把含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞，連同全部的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液，兩個(gè)培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞開(kāi)始傳代，細(xì)胞系建立成功；整個(gè)過(guò)程都是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明方法所使用細(xì)胞培養(yǎng)液的說(shuō)明本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是常規(guī)采用的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH在6.0-6.8之間。昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液可以是各種商品化的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液，如TNM-FH，Grace’s，Sf900，TC-100，IPL-41，Ex-Cell 400等等。
通常，細(xì)胞培養(yǎng)液中青霉素含量為100U/mL；鏈霉素含量為優(yōu)選100U/mL；動(dòng)物血清含量為細(xì)胞培養(yǎng)液的10％(體積比)。
本發(fā)明中兩株甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞系的生物學(xué)特征觀察和測(cè)定1.經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，該細(xì)胞系大部分懸浮于培養(yǎng)液中，也有部分貼壁細(xì)胞。細(xì)胞的形狀有3種類型大部分細(xì)胞圓形、少部分梭形，較少似巨噬細(xì)胞形(圖1)。
2.按照McIntosh and Ignoffo，1989(McIntosh，A.H.and C.M.IgnoffoJ.Invertebr. Pathol.1989，5497～102)的方法，測(cè)定第10代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和群體倍增時(shí)間。以3×105細(xì)胞/mL的濃度接種到T-12.5cm2培養(yǎng)瓶中，27℃培養(yǎng)，每24h測(cè)定細(xì)胞濃度，繪制生長(zhǎng)曲線，并按公式T＝tlg2/[lg(N/N0)]計(jì)算，第10代的細(xì)胞群體倍增時(shí)間為108.8小時(shí)。
其中T＝在對(duì)數(shù)期平均增長(zhǎng)一倍所需的時(shí)間t＝接種到測(cè)定細(xì)胞數(shù)的時(shí)間N0＝接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)N＝時(shí)刻t所測(cè)定的細(xì)胞總數(shù)3.按照Takahashi et al.(Takahashi，Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop.Growth and Differ.2211-19)的方法，測(cè)定了第7代細(xì)胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色體數(shù)目n＝31(Hara，Tsuda，F(xiàn)unakoshi andKawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993，29A(12)904～907)，而Spex II的染色體數(shù)目在116-131之間，因此，新建立的細(xì)胞系Spex II由4倍體細(xì)胞組成(圖2)。
4.使用DAF-PCR的方法(McIntosh，Grasela and Matteri(1996)，InsectMol.Biol.5187～195)鑒定了細(xì)胞系Spex II確是來(lái)源于甜菜夜蛾，而非其它細(xì)胞系的污染(圖3)。由Spex II提取的DNA與甜菜夜蛾幼蟲(chóng)DNA擴(kuò)增后主要的帶型相同，而與對(duì)照來(lái)源于果蠅的SL2細(xì)胞帶型明顯不同。
5.Spex II對(duì)甜菜夜蛾核型多角體病毒敏感，可以觀察到典型的細(xì)胞病理特征，即細(xì)胞核增大，內(nèi)含大量的多角體顆粒(圖4)。并且至少可以連續(xù)傳代3代。使用細(xì)胞系生產(chǎn)的病毒多角體進(jìn)行生物測(cè)定，得到LC50＝6.01×105PIB/mL，類似于用蟲(chóng)體生產(chǎn)的病毒多角體測(cè)定的結(jié)果。
6.使用傳統(tǒng)細(xì)胞凍存的方法對(duì)一定代次的部分細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，保存細(xì)胞的種資，并成功復(fù)蘇。


圖1為Spex II的培養(yǎng)形態(tài)；圖2為Spex II的核型；圖3為DAF-PCR鑒定Spex II的DNA指紋擴(kuò)增圖譜，同于甜菜夜蛾S.exigua的DNA指紋擴(kuò)增圖譜，而不同于果蠅的細(xì)胞系SL2的圖譜；圖4為Spex II感染甜菜夜蛾核型多角體病毒后獲得大量的病毒多角體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.甜菜夜蛾幼蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞系的建立取末齡的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)浸沒(méi)在70％的乙醇溶液中10分鐘，進(jìn)行表面消毒。解剖該昆蟲(chóng)取出脂肪體組織，操作時(shí)盡量保持其完整。用生理鹽水清洗該組織2-3次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液(以TNM-FH為主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗1-2次，放入使用1mL培養(yǎng)液潤(rùn)洗過(guò)的25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入攝氏27℃無(wú)光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入3mL上述細(xì)胞培養(yǎng)液，放入同樣條件下培養(yǎng)。注意該方法成功建立細(xì)胞系的關(guān)鍵是要使組織塊緊貼在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，勿使組織塊懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中。以后每7-10天左右吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量的新培養(yǎng)液。在此操作第7-10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個(gè)的細(xì)胞，并逐漸向外圍擴(kuò)展。第28天后見(jiàn)到細(xì)胞不斷增殖并充滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，把含有新增殖出的細(xì)胞，連同全部的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入2mL新的細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞系建立初步成功。在細(xì)胞開(kāi)始傳代的第7天后開(kāi)始第二次分瓶傳代，以后傳代時(shí)間逐漸縮短，傳到第8代時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始穩(wěn)定，最終該細(xì)胞系被命名為Spex II。Spex II于2005年7月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1411。
實(shí)施例2.Spex II的生物學(xué)特性觀察和測(cè)定(1)形態(tài)特征經(jīng)顯微鏡觀察，該細(xì)胞系通常懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞的形狀有3種類型圓形、梭形和似巨噬細(xì)胞形(圖1)。Spex II中圓形細(xì)胞占85.7％，平均直徑14.7μm；梭形細(xì)胞占12.7％，長(zhǎng)約16.0-41.9μm(平均25.3μm)，寬約8.4-16.0μm(平均11.2μm)；約1.6％的細(xì)胞為似巨噬細(xì)胞，直徑范圍在18.2-31.4μm之間。
(2)細(xì)胞的生長(zhǎng)27℃下，2個(gè)細(xì)胞系第10代在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的鏈霉素的TNM-FH培養(yǎng)液中，群體倍增時(shí)間分別為108.8hr和156.8hr。細(xì)胞最高密度約可達(dá)1.3×106個(gè)細(xì)胞/mL。
(3)核型分析Spex II第10代細(xì)胞是4倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目范圍116-131(2n＝62)，見(jiàn)圖2。
(4)DAF-PCR鑒定細(xì)胞系Spex II確是來(lái)源于甜菜夜蛾，而非其它細(xì)胞系的污染(圖3)。由Spex II提取的DNA與甜菜夜蛾幼蟲(chóng)DNA擴(kuò)增后主要的帶型相同，而與對(duì)照來(lái)源于果蠅的SL2(Schneider′s Drosophila Line 2，ATCC保藏號(hào)CRL-1963)細(xì)胞的帶型明顯不同。
(5)凍存和復(fù)蘇使用傳統(tǒng)細(xì)胞凍存的方法對(duì)一定代次的部分細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，保存細(xì)胞的種資，并可以成功復(fù)蘇。
實(shí)施例3.病毒敏感性和產(chǎn)量的測(cè)定Spex II對(duì)甜菜夜蛾核型多角體病毒敏感將SeNPV出芽型病毒粒子BV以0.001幼蟲(chóng)當(dāng)量/毫升的濃度接種Spex II，培養(yǎng)10天后，收獲細(xì)胞及病毒多角體，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)病毒多角體數(shù)目，結(jié)果Spex II擴(kuò)增SeNPV可達(dá)到每毫升培養(yǎng)液生產(chǎn)1.8×108PIB的產(chǎn)量。同時(shí)可以觀察到典型的細(xì)胞病理特征，即細(xì)胞核增大，內(nèi)含大量的多角體顆粒(圖4)。并且至少可以連續(xù)傳代3代。
使用細(xì)胞系用上述方法生產(chǎn)的病毒多角體，對(duì)2齡末期的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定。其方法如下Spex II接種SeNPV病毒10天后，收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液，加入十分之一體積的10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，劇烈震蕩，5000g離心5分鐘，沉淀用少量1％SDS懸浮，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)SeNPV多角體的含量。用蒸餾水將獲得的SeNPV懸液配制成1×107PIB/mL、5×106PIB/mL、1×106PIB/mL、5×105PIB/mL、1×105PIB/mL、1×104PIB/mL的六個(gè)濃度的濃度梯度，用蒸餾水作空白對(duì)照。將甜菜夜蛾的飼料分別浸沒(méi)在不同濃度的病毒懸液中1分鐘，取出飼料，用吸水紙吸干飼料表面的液體，放入24格養(yǎng)蟲(chóng)盒中，每格接入1頭2齡末期的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，放入26℃、14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后換入新鮮的不含病毒的飼料繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)72頭甜菜夜蛾。實(shí)驗(yàn)四天后調(diào)查甜菜夜蛾的死亡率，計(jì)算LC50。結(jié)果第四天的LC50為1.99×105PIB/mL(95％CI＝1.68×105PIB/mL至8.65×105PIB/mL)，而用由甜菜夜蛾幼蟲(chóng)擴(kuò)增的多角體進(jìn)行生物測(cè)定，其LC50為4.32×105PIB/mL(95％CI＝3.08×105PIB/mL至6.07×105PIB/mL)。用Spex II細(xì)胞擴(kuò)增的SeNPV同用蟲(chóng)體擴(kuò)增的SeNPV，其LC50在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明用Spex II生產(chǎn)的甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)的毒力沒(méi)有改變，可以用于SeNPV的生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種昆蟲(chóng)細(xì)胞系Spex II，于2005年7月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1411。
2.一種權(quán)利要求1所述昆蟲(chóng)細(xì)胞的構(gòu)建方法，步驟如下(1)將甜菜夜蛾末齡幼蟲(chóng)浸沒(méi)在乙醇溶液中10-20分鐘，進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌蒸餾水清洗昆蟲(chóng)，再吸干蟲(chóng)體表面；(2)解剖昆蟲(chóng)，取出完整甜菜夜蛾脂肪體組織；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織2-3次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗，清洗后把該組織放入含有1mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤(rùn)洗過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27℃無(wú)光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；(4)加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒(méi)在該培養(yǎng)液中，在與步驟(3)同樣條件下培養(yǎng)；(5)每7-10天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴(kuò)展并開(kāi)始增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；(6)把含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞，連同全部的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液，兩個(gè)培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞開(kāi)始傳代，細(xì)胞系建立成功；整個(gè)過(guò)程都是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的；其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液是昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH在6.0-6.8之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞的構(gòu)建方法，其中所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液選自商品化的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液TNM-FH，Grace’s，Sf 900，TC-100，IPL-41，或Ex-Cell 400。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞的構(gòu)建方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)液中的青霉素含量為100U/mL；鏈霉素含量為100U/mL；動(dòng)物血清含量為細(xì)胞培養(yǎng)液的10％(體積比)。
5.一種權(quán)利要求1所述昆蟲(chóng)細(xì)胞系在桿狀病毒的大規(guī)模生產(chǎn)上的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中的桿狀病毒是甜菜夜蛾核型多角體病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于昆蟲(chóng)脂肪體組織，并且對(duì)桿狀病毒高敏感的細(xì)胞系，本發(fā)明還公開(kāi)了該細(xì)胞系的建立方法，以及該細(xì)胞系在桿狀病毒規(guī)?；L(zhǎng)上的用途。該細(xì)胞系可以用來(lái)復(fù)制這類病毒，用于桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的規(guī)?；a(chǎn)，以及構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，表達(dá)具商業(yè)或科學(xué)價(jià)值的蛋白質(zhì)。因而具有極高的商業(yè)和科研價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1940061SQ20051008652
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者張永安, 張寰, 秦啟聯(lián), 王玉珠, 曲良建 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所