專利名稱：胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和分離提純培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和分離提純培養(yǎng)方法，尤其涉及胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和分離提純培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是由哺乳動(dòng)物早期胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的一類未分化二倍體細(xì)胞，具有自我更新和全能分化的潛能[1]。特定條件下胚胎干細(xì)胞能保持未分化狀態(tài)并可無限擴(kuò)增，具有分化為構(gòu)成機(jī)體所有組織和細(xì)胞的潛能，是一種無限的細(xì)胞來源，它在臨床細(xì)胞、組織、器官修復(fù)和移植治療上的潛力十分巨大。能控制胚胎干細(xì)胞的定向分化生成各種所需的目的細(xì)胞用于細(xì)胞治療甚或構(gòu)建所需的器官，這正是眾多研究者夢(mèng)寐以求的。人類ES細(xì)胞的建系使得干細(xì)胞研究連續(xù)兩年被Science雜志評(píng)為世界十大科技進(jìn)展，胚胎干細(xì)胞的研究熱潮也就此掀起[2]。已有多項(xiàng)研究結(jié)果示胚胎干細(xì)胞能分化生成成熟的肝細(xì)胞。[3]-[5]我們先前的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[6]。作為一種肝干細(xì)胞，肝卵圓細(xì)胞(Hepatic oval cells)是具有自我更新能力、能分化生成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞等肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的成體干細(xì)胞。1958年Leduc和Wilson在用電鏡研究藥物誘導(dǎo)小鼠肝損傷后局部形態(tài)變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)了肝卵圓細(xì)胞。它是是一類體積較小、卵圓型細(xì)胞核、胞質(zhì)較少呈嗜堿性、核漿比較高的、細(xì)胞器不發(fā)達(dá)的細(xì)胞。如果肝臟嚴(yán)重受損致使肝細(xì)胞大部分壞死，或由于某些原因(肝毒性物質(zhì)、致癌物質(zhì)的作用)抑制殘留肝細(xì)胞增殖時(shí)，肝內(nèi)卵圓細(xì)胞被激活。正是基于這個(gè)理論，人們以嚙齒類動(dòng)物為對(duì)象建立了較成熟的肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪澄镏谐掷m(xù)添加低劑量2-乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene，2-AAF)加上三分之二肝切除[7]，或者食物中添加3，5-二乙羰基-1，4-二氫-三甲基吡啶(3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-collidine，DDC)[8]等。借助這些動(dòng)物模型，人們對(duì)嚙齒類動(dòng)物肝卵圓細(xì)胞的認(rèn)識(shí)有了很大的提高。誘導(dǎo)后對(duì)肝卵圓細(xì)胞的分離方法，現(xiàn)多采用改良的兩步膠原酶灌注法分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，然后使用等密度梯度離心法離心(將percoll液配成不連續(xù)濃度的梯度離心液)，最后于50％至70％percoll層間獲得肝卵圓細(xì)胞。[9]-[10]一系列的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了卵圓細(xì)胞有雙向分化潛能，既能增殖分化生成肝細(xì)胞，又能增殖分化生成膽管細(xì)胞[11]-[14]。也有研究示卵圓細(xì)胞亦可轉(zhuǎn)分化生成非肝系細(xì)胞，如胰島內(nèi)分泌細(xì)胞[15]等?，F(xiàn)已知肝損傷刺激能引起肝內(nèi)如肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells)等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，包括肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth factor，HGF)，轉(zhuǎn)生長因子α(Transforming growth factorα，TGF-α)，轉(zhuǎn)生長因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)，表皮生長因子(epidermal growth facter，EGF)，酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acid fibroblast growth factor，α-FGF)等，它們對(duì)卵圓細(xì)胞激活、增生、分化過程有著重要調(diào)控作用。卵圓細(xì)胞表達(dá)HGF配體c-met，星形細(xì)胞分泌的HGF結(jié)合c-met后強(qiáng)烈地促進(jìn)卵圓細(xì)胞的增殖(使其DNA合成水平明顯增高)。使用攜帶HGF cDNA的重組腺病毒轉(zhuǎn)染卵圓細(xì)胞，增殖細(xì)胞核抗原PCNA(+)的卵圓細(xì)胞量可明顯增高。單用HGF時(shí)，卵圓細(xì)胞明顯誘導(dǎo)膽管上皮的增生，HGF與EGF、SCF等聯(lián)用時(shí)能明顯誘導(dǎo)肝板或肝索樣結(jié)構(gòu)的形成，EGF對(duì)卵圓細(xì)胞到肝細(xì)胞的定向誘導(dǎo)有關(guān)鍵性作用。[16]-[18]到目前為止，在胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)生成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過程中是否存在著有雙向分化能力的胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞這個(gè)中間分化階段，及HGF與EGF對(duì)胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的生成是否有作用，國內(nèi)外一直沒有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一個(gè)高效的肝卵圓細(xì)胞新誘導(dǎo)模型。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是解決現(xiàn)有技術(shù)中嚙齒類動(dòng)物卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)模型誘導(dǎo)過程煩瑣耗時(shí)、誘導(dǎo)劑均為化學(xué)毒性物質(zhì)，具有不利影響，從而限制其應(yīng)用范圍的缺陷；證實(shí)在胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)生成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過程中存在著有雙向分化能力的胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞這個(gè)中間分化階段，及HGF與EGF對(duì)胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的生成有顯著性誘導(dǎo)作用；以及快速便捷地誘導(dǎo)并分選出合適的肝卵圓細(xì)胞。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)選用小鼠胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)成擬胚體分化3天后分組，誘導(dǎo)組添加肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)作定向誘導(dǎo)分化；期間用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞標(biāo)志物A6等的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀分析并使用Sca-1和CD34雙指標(biāo)篩選A6+肝卵圓細(xì)胞，所篩選的卵圓細(xì)胞行RT-PCR、透射電鏡檢測(cè)，并計(jì)算肝卵圓細(xì)胞分化率；篩選的A6+/Sca-1+/CD34+肝卵圓細(xì)胞繼續(xù)體外培養(yǎng)并檢驗(yàn)其是否具有雙向分化能力；用原子力顯微鏡研究A6陽性肝卵圓細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明首次證實(shí)胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)生成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過程中存在著A6陽性的胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞(RT-PCR及透射電鏡檢測(cè)亦證實(shí)其存在)；FACS篩選的A6陽性卵圓細(xì)胞能分化生成成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。
HGF和EGF能顯著性誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞源性卵圓細(xì)胞的生成，誘導(dǎo)組肝卵圓細(xì)胞分化率均顯著的高于對(duì)照組，最高時(shí)可達(dá)4.46％左右；使用雙指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)能篩選出較高比例A6+肝卵圓細(xì)胞(約92.48％)，篩選出的A6+肝卵圓細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例為1.12％左右，整個(gè)誘導(dǎo)方法較簡便，誘導(dǎo)周期也很短。
利用本發(fā)明所闡述的肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，利用很少的胚胎干細(xì)胞種源便可誘導(dǎo)生成足夠多的、能滿足臨床需要的肝卵圓細(xì)胞，進(jìn)而可用于肝卵圓細(xì)胞移植、肝臟組織工程學(xué)等臨床范疇，對(duì)各種原因所致肝功能衰竭、肝代謝疾病等起到輔助支持治療或治愈疾病的功用。
四

圖1.ESC向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的細(xì)胞生長狀態(tài)。(A)ESC呈集落樣生長，緊密排列，界限不清(200×)；(B)ESC呈透明的球形(400×)；(C)誘導(dǎo)組-Day8，形態(tài)較均一，呈鋪路石樣(100×)；(D)對(duì)照組-Day8，形態(tài)較復(fù)雜，三角形、圓形、梭形細(xì)胞相混生長(100×)圖2.胚胎干細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞及流式分選細(xì)胞培養(yǎng)后的子代細(xì)胞A6抗原和ALB抗原的表達(dá)。(A)-(E)示第9天誘導(dǎo)組分化細(xì)胞群A6(+)細(xì)胞(箭頭示)。(B)-(D)為(A)的局部放大。單個(gè)A6(+)細(xì)胞呈卵圓形，A6陽性卵圓細(xì)胞主要分布在擬胚體貼壁后所形成的細(xì)胞集落之中(圖2B、C)，以及外周分化較成熟細(xì)胞群之間的小集落中(圖2E)。細(xì)胞集落的左下方可見兩個(gè)長梭形的A6陽性膽管上皮樣細(xì)胞(圖2D)。(F)示第15天誘導(dǎo)組分化細(xì)胞群中ALB(+)肝細(xì)胞，其中可見多個(gè)雙核肝細(xì)胞(箭頭示)。(G)示流式細(xì)胞儀分選的CD34+/Sca-1+細(xì)胞培養(yǎng)第15天后的ALB(+)肝細(xì)胞，其中可見多個(gè)雙核肝細(xì)胞(箭頭示)。(H)陰性對(duì)照。圖中陽性染色為棕色(DAB顯色)，蘇木精染細(xì)胞核后呈藍(lán)色。A、E、H×100，F(xiàn)、G×200，B、C、D×400。
圖3.胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的三色FACS分析。R1框選出FACS分析的細(xì)胞群，R2框選為Sca-1門選，Sca-1+細(xì)胞進(jìn)一步行CD34/CD45雙標(biāo)分析。UL為CD34+/CD45-，UR為CD34+/CD45+，LL為CD34-/CD45-，LR為CD34-/CD45+。誘導(dǎo)組的分化子代細(xì)胞中Sca-1+/CD34+/CD45+占總細(xì)胞數(shù)(R1)的2.38％，而對(duì)照組的三陽細(xì)胞只有0.10％。Sca-1+的細(xì)胞幾乎均共表達(dá)CD45(UL和UR中的細(xì)胞數(shù)為0)。
圖4.胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的雙色FACS分析。取分化第4天至第10天的誘導(dǎo)組和對(duì)照組的分化子代細(xì)胞，分析抗原Sca-1和CD34的表達(dá)情況(以Sca-1為門選)。誘導(dǎo)組的分化子代細(xì)胞中Sca-1+/CD34+細(xì)胞陽性率從分化第4天開始上升，至第8天達(dá)到高峰(1.20％)后下降；而對(duì)照組的基本上維持在一個(gè)低水平(0.03％-0.21％)。R1區(qū)中的細(xì)胞以小細(xì)胞為主，大多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較簡單，對(duì)照組分化第8天細(xì)胞分成兩群，而誘導(dǎo)組則無此現(xiàn)象。R2區(qū)(Sca-1 Gated)中對(duì)照組細(xì)胞點(diǎn)圖一直較分散，而誘導(dǎo)組的隨著分化時(shí)間的推移細(xì)胞點(diǎn)圖趨向于集中且向右移。對(duì)照組細(xì)胞峰群相對(duì)位置一直改變不大且處于低水平，而誘導(dǎo)組的隨著分化時(shí)間的推移細(xì)胞峰群不斷向右移(雙陽細(xì)胞比例增大)，至第8天達(dá)到最大值。
圖5.分化第8天誘導(dǎo)組流式細(xì)胞儀篩選細(xì)胞A6抗原的表達(dá)情況。(A)Sca-1+/CD34+細(xì)胞(92.48％±2.01％)，絕大部分呈A6陽性，部分呈強(qiáng)陽性。(B)非雙陽細(xì)胞僅少數(shù)呈A6陽性(1.66％±1.57％)。(C)陰性對(duì)照。圖中陽性染色為棕色(DAB顯色)。A、B、C×100圖6.流式細(xì)胞儀篩選雙陽細(xì)胞的透射電鏡檢測(cè)。細(xì)胞體積較小(13μm左右)，核漿比高；核呈卵圓形，可見濃縮的染色質(zhì)；核漿內(nèi)細(xì)胞器較少，可見少量線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；細(xì)胞邊緣可見少量微絨毛。標(biāo)尺1μm圖7.RT-PCR分析。A為流式細(xì)胞儀篩選雙陽細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果，肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、ALB，膽管細(xì)胞標(biāo)志物ck19，肝系細(xì)胞標(biāo)志物ck8、ck18均為陽性，而成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物G6Pase和成熟膽管細(xì)胞標(biāo)志物BG為陰性；B為篩選雙陽細(xì)胞培養(yǎng)20天的細(xì)胞群的RT-PCR結(jié)果，與A不同的是AFP無表達(dá)，而G6Pase和BG有表達(dá)。BG指biliary glycoprotein，G6Pase指glucose-6-phosphatase。Marker為100-2000。內(nèi)參為β-actin。
圖8.A6陽性肝卵圓細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡分析。(A)，(B)誘導(dǎo)組第9天的單個(gè)肝卵圓細(xì)胞通過用A6單克隆抗體染色定位(箭頭示)，(A×100；B×400)。(C)-(F)為該細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的原子力掃描圖，后者為前者框選區(qū)域的局部放大。(G)-(I)是作為對(duì)照的單個(gè)胚胎干細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的原子力掃描圖，后者為前者框選區(qū)域的局部放大。胚胎干細(xì)胞呈圓形，直徑約為9μm，細(xì)胞膜表面有多數(shù)橢球形顆粒，顆粒大小為40-80nm。肝卵圓細(xì)胞呈橢圓形，體積略大(直徑約為11μm)，細(xì)胞膜表面顆粒數(shù)量更多且更大(大小為200-400nm)，呈粗大的長橢球形。掃描范圍(C)20×20μm2；(D)，(H)5×5μm2；(E)，(I)2×2μm2；(F)1×1μm2；(G)15×15μm2。
五具體實(shí)施例方式
以下具體的實(shí)施例只是對(duì)技術(shù)方案作進(jìn)一步描述，并不限制本發(fā)明的范圍。
(一)實(shí)驗(yàn)材料以及器材1.胚胎干細(xì)胞的來源選取商業(yè)可得的Balb/c系小鼠胚胎干細(xì)胞。
2.細(xì)胞培養(yǎng)試劑2.1細(xì)胞培養(yǎng)基(1)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基成分含高糖和谷氨酰胺的DMEM(Dubecco′s modifided Eagle′smedium)(美國Hyclone公司)；20％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季清公司)；1000U/ml重組小鼠白血病抑制因子(recombinant murineleukemia inhibitory factor，LIF)(美國ESGRO-Chemicon公司)；0.1mmol/Lβ-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)(美國Invitrogen公司)；25mmol/L HEPES(美國Invitrogen公司)；100U/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)(美國Invitrogen公司)。
(2)分化階段基本培養(yǎng)基與胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基相比較，不含LIF外，且胎牛血清的濃度變?yōu)?5％，并添加了0.1mmol/L非必需氨基酸(nonessentialaminoacids)(美國Invitrogen公司)，其余成分同。
2.2細(xì)胞生長因子肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth factor，HGF)(美國Peprotech公司)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(美國Peprotech公司)。
2.3其它試劑、器材一次性塑料培養(yǎng)瓶、一次性塑料培養(yǎng)板(美國Corning公司)，消化液0.25％Trypsin-1mM EDTA·4Na(美國Invitrogen公司)。
3.免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)試劑大鼠A6單克隆抗體為商業(yè)可得；抗小鼠/人白蛋白(albumin，ALB)單克隆抗體(美國R&D公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；PE-Cy5共軛的抗小鼠Sca-1單克隆抗體(美國eBioscience公司)；R-PE共軛的抗小鼠CD34單克隆抗體(美國BD Pharmingen公司)；FITC共軛的抗小鼠CD45單克隆抗體(美國Biolegend公司)；帶拍攝系統(tǒng)(日本NIKON E4500)的倒置相差顯微鏡(日本Nikon Eclipse TS100)；流式細(xì)胞儀為美國BECTON DICKINSON FACScalibur FlowCytometers。
4.RT-PCR試劑TROZOL(TRI REAGENT-美國MRC公司)；cDNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)；PCR試劑盒(美國Fermentas公司)；引物合成由上海生工生物工程公司合成。引物序列及引物長度、退火溫度如下a-fetoprotein，5’-ACT CAC CCC AAC CTT CCT GTC-3’forward，5’-CAG CAG TGG CTG ATA CCA GAG-3’reverse，423bp，退火溫度為56℃；albumin，5’-CAT GAC ACC ATG CCT GCT GAT-3’forward，5’-CTC TGA TCT TCA GGA AGT GTA C-3’reverse，452bp，退火溫度為53℃；cytokeratin 19，5’-GTC CTA CAG ATT GAC AAT GC-3’forward，5’-CAC GCT CTG GAT CTG TGA CAG-3’reverse，569bp，退火溫度為53℃；
cytokeratin 18，5’-GGA CCT CAG CAA GAT CAT GGC-3’forward，5’-CCA CGA TCT TAC GGG TAG TTG-3’reverse，515bp，退火溫度為55℃；cytokeratin 8，5’-AGT CTC AGA TCT CAG ACA CG-3’forward，5’-CCA TAG GAT GAA CTC AGT CC-3’reverse，561bp，退火溫度為55℃；glucose-6-phosphatase，5’-AAC CCA TTG TGA GGC CAG AGG-3’forward，5’-TAC TCA TTA CAC TAG TTG GTC-3’reverse，438bp，退火溫度為55℃；biliary glycoprotein，5’-GAA CTA GAC TCT GTC ACC CTG-3’forward，5’-GCC AGA CTT CCT GGA ATA GA-3’reverse，407bp，退火溫度為53℃；β-actin，5’-TTC CTT CTT GGG TAT GGA AT-3’forward，
5’-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3’reverse，203bp。
5.透射電鏡為PHILIPS TECNAL 10；原子力顯微鏡為Auto-probe CP Research(Si3N4Cantilevers with integral tips；Thermomicroscopes，美國)。
(二)胚胎干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和分離提純培養(yǎng)過程1.胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)將液氮中凍存的Balb/c胚胎干細(xì)胞快速取出，立即置于37℃溫水中快速解凍復(fù)溫(1-2分鐘內(nèi))，終止液清洗，1000rpm離心5min，棄上清，加入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，適中密度轉(zhuǎn)種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70％-80％左右傳代，平均每2～3d傳代1次。
2.生成擬胚體將胚胎干細(xì)胞以適中密度轉(zhuǎn)至玻璃培養(yǎng)瓶中，用分化階段基本培養(yǎng)基重懸，搖動(dòng)培養(yǎng)法培養(yǎng)(平均每1小時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶1次，保持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)生長以發(fā)育為擬胚體)。每天換液1次，培養(yǎng)3天。開始培養(yǎng)擬胚體的當(dāng)天作為誘導(dǎo)分化的第1天。
3.向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化擬胚體培養(yǎng)3天后，擬胚體大小均勻適度。將其適中密度轉(zhuǎn)至塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶并分組，誘導(dǎo)組的培養(yǎng)基為含HGF(30ng/ml)和EGF(100ng/ml)的分化階段基本培養(yǎng)基；對(duì)照組的培養(yǎng)基僅為分化階段基本培養(yǎng)基，擬胚體將自然隨機(jī)分化。
4.免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC)4.1.染色程序如下(1)培養(yǎng)細(xì)胞(貼壁生長)用冷的4％多聚甲醛室溫固定20min，蒸餾水洗；(2)檢測(cè)ALB抗原時(shí)用的0.3％Triton X100室溫破膜20min，蒸餾水洗；(3)30％H2O2純甲醇(1∶50)滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫20min，蒸餾水洗3次；(4)5％BSA室溫封閉20min，甩去多余液體(不洗)；(5)滴加稀釋的一抗(A6-McAb 1∶20；ALB-McAb 1∶100)4℃孵育過夜，PBS(PH7.2-7.6)洗3次，每次2min；
(6)滴加生物素化羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，PBS(PH7.2-7.6)洗3次，每次2min；(7)滴加SABC(鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物)，37℃孵育，20min，PBS(PH7.2-7.6)洗4次，每次5min；(8)新鮮配制的DAB室溫顯色(鏡下控制反應(yīng)時(shí)間)，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水封片鏡檢。
陰性對(duì)照則用PBS替代一抗孵育，其余步驟不變。
4.2.A6陽性卵圓細(xì)胞百分率誘導(dǎo)組和對(duì)照組消化后的單細(xì)胞懸液及流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞行A6單抗染色，其染色程序大體同上述ICC的，DAB顯色后滴在載玻片上鏡檢并細(xì)胞計(jì)數(shù)。不同培養(yǎng)時(shí)間(誘導(dǎo)分化第5、7、9、11天)的細(xì)胞各取3個(gè)樣本，每次樣本均隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)A6陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，兩者的比例即為A6陽性卵圓細(xì)胞百分率。誘導(dǎo)組和對(duì)照組結(jié)果間的差異行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))，P＜0.05時(shí)為差異顯著性。
5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)流式細(xì)胞儀分選的CD34+/Sca-1+細(xì)胞及其培養(yǎng)20天的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR分析(按試劑盒說明書操作)。大體步驟如下用Trizol抽提細(xì)胞總RNA；
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；PCR反應(yīng)，具體為冰上加入(50ul體系)2×PCR Mix 25ul，forward primer 1ul，reverse primer 1ul，Template DNA 5ul，H2O 18ul.
混勻后短暫離心，置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，退火1min，72℃延長1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延長10min。
PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳成像，紫外線下觀察結(jié)果并拍照。
6.流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)誘導(dǎo)組及對(duì)照組的培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)首先適當(dāng)消化(0.25％Trypsin-1mM EDTA·4Na)，并充分吹打成單細(xì)胞懸液。0.1mM的PBS(PH7.2-7.4)清洗細(xì)胞后，計(jì)數(shù)細(xì)胞取約1×106個(gè)，依次加入抗小鼠Sca-1-PE-Cy5、抗小鼠CD34-PE、抗小鼠CD45-FITC及適量的PBS(反應(yīng)體系為20μl)，充分混勻后避光室溫孵育20分鐘。PBS充分清洗并重懸后上機(jī)檢測(cè)。不同培養(yǎng)時(shí)間(分化第4天至第10天)的細(xì)胞行FACS檢測(cè)，以分析Sca-1、CD34和CD45抗原的表達(dá)程度及趨勢(shì)；分化第4、6、8、10天的細(xì)胞各取3個(gè)樣本，獲得的數(shù)值取均值作為該天的CD34+/Sca-1+細(xì)胞陽性率，誘導(dǎo)組和對(duì)照組結(jié)果間的差異行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))，P＜0.05時(shí)為差異顯著性。
7.透射電鏡檢測(cè)(TEM)流式細(xì)胞儀分選的CD34+/Sca-1+細(xì)胞于4℃下用2.5％戊二醛固定約4小時(shí)，用0.01M的PBS充分清洗。然后用1％OsO4預(yù)固定30分鐘，常規(guī)梯度酒精脫水，之后用環(huán)氧樹脂包埋。制備超薄切片，并用醋酸雙氫鈾及枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。
8.原子力顯微鏡檢測(cè)(AFM)取誘導(dǎo)組分化第9天的分化細(xì)胞進(jìn)行A6抗原染色(步驟同ICC)。未分化的胚胎干細(xì)胞作為對(duì)照。胚胎干細(xì)胞用0.25％胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液(濃度為1×106/ml)，用2.5％的戊二醛室溫固定30min后，滴在蓋玻片上空氣干燥20min備用。待檢細(xì)胞置于云母片上，然后置入樣品臺(tái)的掃描區(qū)內(nèi)。在監(jiān)視器上確定目的細(xì)胞的大致位置，將掃描探針針尖小心的移至在目的細(xì)胞所在區(qū)域。調(diào)整為Autoprobe CP Tapping模式下，懸臂(ParkScientific Instruments，Microlever)針尖曲率半徑為10nm，力常數(shù)約為2.8N/m，掃描速率為0.5-1Hz，正常大氣壓、室溫下觀察。AFM圖像僅經(jīng)平滑處理(使用Thermomicroscopes ProscanImage Processing Software Version 2.1軟件)，利用軟件的線分析和面分析功能，對(duì)圖像進(jìn)行分析。
(三)結(jié)果1.胚胎干細(xì)胞及其向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的細(xì)胞生長狀態(tài)胚胎干細(xì)胞克隆增殖，生長迅速，細(xì)胞緊密排列，界限不清(圖1-A)。消化后用分化階段基本培養(yǎng)基重懸，行搖動(dòng)法培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞相互聚集并形成透明的球形擬胚體(圖1-B)。3天后，待擬胚體生長成適度大小，將其分組并轉(zhuǎn)入塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。約3-4小時(shí)擬胚體貼壁后，將誘導(dǎo)組的培養(yǎng)基換成含HGF和EGF的培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)分化。分化細(xì)胞群以擬胚體著壁處為中心向四周輻射生長，誘導(dǎo)組的分化細(xì)胞群為形態(tài)較均一的上皮細(xì)胞，呈鋪路石樣(圖1-C)。而對(duì)照組的分化細(xì)胞群較復(fù)雜，形態(tài)多樣，可見三角形、圓形、梭形細(xì)胞相混生長(圖1-D)。
2.胚胎干細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞A6抗原和ALB抗原的表達(dá)分化的第6、9、12、15天對(duì)ESC定向誘導(dǎo)分化子代細(xì)胞群用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)了A6抗原和ALB抗原的表達(dá)。分化的第6天已能測(cè)到A6抗原的表達(dá)，圖2(A)-(E)示分化第9天誘導(dǎo)組分化細(xì)胞群A6抗原的表達(dá)情況。A6陽性肝卵圓細(xì)胞主要分布在擬胚體貼壁后所形成的緊密排列的細(xì)胞集落之中(圖2B、C)，以及集落外周部位分化較成熟細(xì)胞群之間的小集落中(圖2E)。圖2B中可見細(xì)胞集落的上部夾雜著一個(gè)A6陽性卵圓細(xì)胞，它的旁邊可見一個(gè)雙核肝細(xì)胞。細(xì)胞集落的左下方可見兩個(gè)長梭形的A6陽性膽管上皮樣細(xì)胞(圖2D)。圖2(F)示第15天誘導(dǎo)組分化細(xì)胞群中ALB抗原的表達(dá)情況，可見多個(gè)ALB陽性雙核肝細(xì)胞。
3.胚胎干細(xì)胞的肝系定向誘導(dǎo)分化過程中的流式細(xì)胞術(shù)分析取分化第4天至第10天的誘導(dǎo)組和對(duì)照組的分化子代細(xì)胞，用FACS分析抗原Sca-1、CD34和CD45的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3、4。Sca-1作為門選指標(biāo)。圖3結(jié)果提示幾乎所有的Sca-1+細(xì)胞均復(fù)表達(dá)CD45，也就是說CD45對(duì)肝卵圓細(xì)胞的分選無明顯作用。所以只用Sca-1和CD34雙指標(biāo)來分析分化第4天至第10天兩組的分化子代細(xì)胞。大體上(圖4)，誘導(dǎo)組的分化子代細(xì)胞中Sca-1+/CD34+細(xì)胞陽性率從分化第4天開始上升，至第8天達(dá)到高峰(1.20％)后下降；而對(duì)照組的基本上維持在一個(gè)低水平(0.03％-0.21％)。從R1區(qū)中數(shù)據(jù)點(diǎn)分布來看，誘導(dǎo)組的細(xì)胞以小細(xì)胞為主，且大多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較簡單；對(duì)照組的細(xì)胞于分化第8天分成兩群，而誘導(dǎo)組則一直無此現(xiàn)象。R2區(qū)(Sca-1 Gated)中對(duì)照組細(xì)胞點(diǎn)圖一直較分散，而誘導(dǎo)組的隨著分化時(shí)間的推移細(xì)胞點(diǎn)圖趨向于集中且向右移。誘導(dǎo)組細(xì)胞的總體熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)并于第8天達(dá)到高峰，而對(duì)照組的一直處于低水平。分化第4、6、8、10天的細(xì)胞各取3個(gè)樣本，取均值作為該天的CD34+/Sca-1+細(xì)胞陽性率，誘導(dǎo)組和對(duì)照組結(jié)果間的差異行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表1。
表1.胚胎干細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Sca-1+/CD34+細(xì)胞陽性率的統(tǒng)計(jì)

p＜0.05示有顯著性差異；p＜0.01示有極顯著性差異。
4.流式細(xì)胞儀篩選雙陽細(xì)胞行A6抗原及透射電鏡的檢測(cè)我們檢測(cè)了分化第8天誘導(dǎo)組流式細(xì)胞儀篩選Sca-1+/CD34+細(xì)胞中表達(dá)A6抗原細(xì)胞所占的比例(見圖5)。Sca-1+/CD34+細(xì)胞中A6+細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的92.48％±2.01％，部分細(xì)胞呈強(qiáng)陽性；而非雙陽細(xì)胞的占1.66％±1.57％。透射電鏡結(jié)果見圖6，卵圓細(xì)胞體積較小，一般7-15μm左右，胞核大而胞漿較少，核漿比高；核呈卵圓形，可見濃縮的染色質(zhì)；核漿內(nèi)細(xì)胞器較少，可見少量線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；細(xì)胞邊緣可見少量微絨毛。
5.流式細(xì)胞儀篩選雙陽細(xì)胞及其培養(yǎng)子代細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)RT-PCR結(jié)果見圖7。圖7 A為流式細(xì)胞儀新鮮篩選Sca-1+/CD34+細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果，可見肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、ALB，膽管細(xì)胞標(biāo)志物ck19，肝系細(xì)胞標(biāo)志物ck8、ck18均為陽性，而成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物glucose-6-phosphatase(G6Pase)和成熟膽管細(xì)胞標(biāo)志物biliaryglycoprotein(BG)為陰性；圖7B為篩選Sca-1+/CD34+細(xì)胞培養(yǎng)了20天的細(xì)胞群的RT-PCR結(jié)果，與A不同的是，AFP不表達(dá)，而glucose-6-phosphatase和biliaryglycoprotein則有陽性條帶。
6.胚胎干細(xì)胞源性卵圓細(xì)胞的分化率分化的第5、7、9、11天將誘導(dǎo)組和對(duì)照組各取樣消化成單細(xì)胞懸液行A6-McAb染色，DAB顯色后滴在載玻片上鏡檢計(jì)數(shù)。所得的兩組A6(+)卵圓細(xì)胞的分化率見表2。誘導(dǎo)組A6(+)卵圓細(xì)胞的分化率變化范圍為1.25％-4.46％，誘導(dǎo)第7天左右達(dá)到高峰；而對(duì)照組的一直保持在低水平(0.14％-0.25％)。t檢驗(yàn)結(jié)果示同期誘導(dǎo)組A6(+)卵圓細(xì)胞的分化率比對(duì)照組的高，且差異有顯著性。
表2.胚胎干細(xì)胞源性卵圓細(xì)胞的分化率

p＜0.05示有顯著性差異；p＜0.01示有極顯著性差異。
7.A6陽性肝卵圓細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡分析誘導(dǎo)組第9天的肝卵圓細(xì)胞通過用A6單克隆抗體染色定位(圖8.A、B)，圖8.C-F為肝卵圓細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的原子力掃描圖。胚胎干細(xì)胞作為對(duì)照(圖8.G-I)，呈圓形，直徑約為9μm，細(xì)胞膜表面有多數(shù)橢球形顆粒，顆粒大小為40-80nm。肝卵圓細(xì)胞呈橢圓形，體積略大(直徑約為11μm)，細(xì)胞膜表面顆粒數(shù)量更多且更大(大小為200-400nm)，呈粗大的長橢球形。為了進(jìn)一步分析細(xì)胞膜表面顆粒分布情況，肝卵圓細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞各取相同面積(2×2μm)的局部膜表面(圖8.E和I)進(jìn)行定量分析。圖8.(1)和(2)分別為圖8.E和I中全部掃描區(qū)域細(xì)胞膜表面顆粒直徑的直方圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。肝卵圓細(xì)胞的膜表面顆粒(圖8.(1))中高度為335nm的數(shù)據(jù)點(diǎn)(data points)最多，而胚胎干細(xì)胞的(圖8.(2))高度為602nm的數(shù)據(jù)點(diǎn)最多。使用IP2.1軟件的線分析和面分析功能測(cè)量圖8.E和I區(qū)域中細(xì)胞膜表面顆粒分布情況，并通過四個(gè)參數(shù)——平均粗糙度(average roughness，Ra)、最大峰谷間距(maximumpeak-to-valley distance，Rp-v)、均方根粗糙度(root-mean-squared roughness，Rrms)、平均高度(mean height，z)來進(jìn)一步定量分析肝卵圓細(xì)胞膜和胚胎干細(xì)胞膜間的特征差異(表3)。胚胎干細(xì)胞膜的四個(gè)參數(shù)(尤其是Ra和Rrms)均大于肝卵圓細(xì)胞膜的，也就是說胚胎干細(xì)胞局部膜表面比肝卵圓細(xì)胞的更粗糙些。
表3.肝卵圓細(xì)胞膜和胚胎干細(xì)胞膜間特征差異的定量分析

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權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞源性肝卵圓細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法，其特征在于用肝細(xì)胞生長因子HGF、表皮生長因子EGF對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化；對(duì)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行A6+肝卵圓細(xì)胞的篩選。
2.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)方法，其中胚胎干細(xì)胞為轉(zhuǎn)成擬胚體分化3天后的胚胎干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的體外誘導(dǎo)方法，其中胚胎干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或2所述的體外誘導(dǎo)方法，其中胚胎干細(xì)胞為小鼠胚胎干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)方法，其中的篩選利用Sca-1和CD 34為雙指標(biāo)。
6.如權(quán)利要求5所述的體外誘導(dǎo)方法，其中的篩選利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)方法，其中HGF為30ng/ml以及EGF為100ng/ml。
8.用權(quán)利要求1-7中任一方法獲得的肝卵圓細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)高效的肝卵圓細(xì)胞新誘導(dǎo)模型。該模型中利用HGF和EGF顯著性誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞源性卵圓細(xì)胞的生成，整個(gè)誘導(dǎo)方法較簡便，誘導(dǎo)周期也很短。利用本發(fā)明的肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)模型，利用很少的胚胎干細(xì)胞種源便可誘導(dǎo)生成足夠多的、能滿足臨床需要的肝卵圓細(xì)胞，進(jìn)而可用于肝卵圓細(xì)胞移植、肝臟組織工程學(xué)等臨床范疇，對(duì)各種原因所致肝功能衰竭、肝代謝疾病等起到輔助支持治療或治愈疾病的功用。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1948465SQ200510086599
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日
發(fā)明者銀東智, 蔡繼業(yè), 鄭啟昌, 劉美莉 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)