專利名稱：離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6－氨基青霉烷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青霉素發(fā)酵液萃取和酶促催化反應一體化制備半合成抗藥物中間體的工藝方法，特別涉及離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法。
背景技術(shù)：
6-APA(6-氨基青霉烷酸)是制藥行業(yè)重要的中間體，它采用青霉素為原料，在青霉素?；傅拇呋滤馍赡繕水a(chǎn)物6-APA與副產(chǎn)物PAA(苯乙酸)， 而6-APA可以繼續(xù)合成其它類型的半合成抗生素?，F(xiàn)有青霉素的生產(chǎn)方法是將青霉素發(fā)酵液固液分離后，利用有機萃取溶劑從青霉素濾液中提取青霉素，經(jīng)過反萃、結(jié)晶與干燥等步驟得到產(chǎn)品青霉素，然后溶解于水溶液進行酶促催化反應。該工藝存在三大缺點一是萃取過程需要調(diào)低pH值，造成青霉素的效價降低以及蛋白質(zhì)的乳化現(xiàn)象；二是有機溶劑污染環(huán)境；三是青霉素提取與酶催化步驟不連續(xù)，浪費了能量(Process Biochemistry，vol 8，146～152，1989)。
針對以上問題，人們嘗試采用雙水相萃取青霉素，并直接在青霉素萃取相中進行酶催化反應。實驗發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇(PEG)-鹽體系對青霉素的分配系數(shù)可達10以上，沒有環(huán)境污染，而且酶在雙水相中能保證一定的活性。但PEG原料難以回收，導致純化產(chǎn)物非常困難，限制了工業(yè)的實際用途(Sep.Sci.Technol.，1996，131，2589～2594.)。
離子液體是新型綠色溶劑，具有結(jié)構(gòu)可調(diào)、性質(zhì)多變的特點，在溶劑萃取與有機催化方面已有廣泛的應用。劉慶芬等報道了用親水性離子液體形成的雙水相萃取青霉素，得到94％的萃取率(《科學通報》，Vol 50(4)，756～759，2005)。但該法沒有考慮青霉素水相與親水離子液體間的分離，導致青霉素水相中離子液體含量過高，降低了后續(xù)酶催化的活性，阻礙了青霉素萃取反應生產(chǎn)半合成藥物中間體6-APA耦合工藝的實現(xiàn)。本申請?zhí)岢鲈陔x子液體雙水相萃取青霉素的基礎(chǔ)上，采用疏水離子液體進行二次萃取，將青霉素萃取相中的親水離子液體萃入到疏水離子液體相，大大減少了青霉素萃余相的離子液體的含量，保證后續(xù)酶催化反應的活性(見附圖1)。如此，使青霉素萃取反應耦合一體化工藝得以實現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是實現(xiàn)離子液體雙水相-二次萃取青霉素及酶促催化反應制備半合抗藥物中間體耦合新工藝，利用親水-疏水離子液體之間吸引作用改善青霉素水相的酶催化效率的方法，提出離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法。
本發(fā)明的離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法，包括以下步驟(1).離子液體雙水相的制備與青霉素的萃取過程向青霉素發(fā)酵液中加入親水離子液體和無機鹽，使混合液中的青霉素質(zhì)量百分含量為0.5～8％，親水離子液體的質(zhì)量百分含量為10～50％，無機鹽的質(zhì)量百分含量為10～30％；攪拌混合后靜置出現(xiàn)平衡的兩相，青霉素進入離子液體輕相；(2).疏水離子液體二次萃取回收離子液體原料取步驟(1)含親水離子液體輕相的萃取水溶液，優(yōu)選輕相中親水離子液體的濃度為20～70wt％，加入疏水離子液體，將疏水離子液體與親水離子液體的水溶液相比控制在1∶1～1∶30范圍內(nèi)。振蕩離心后，90％以上的親水離子液體會被萃入到疏水離子液體相中，而萃余相是含絕大部分青霉素與少量無機鹽的水溶液。
(3).處理后的青霉素水溶液進行酶促催化反應取步驟(2)二次萃取后含青霉素與無機鹽的水溶液，加入固定化青霉素?；?，固定化青霉素?；冈诨旌弦褐械臐舛瓤刂圃?～25mg/ml之間，37℃振蕩反應，測定初始反應酶活，分離得到6-氨基青霉烷酸。
所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經(jīng)純水洗脫有68％以上的親水離子液體分離析出，用于步驟(1)。
所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經(jīng)升溫到70℃以上有83％以上的親水離子液體分離析出，用于步驟(1)。
所述的親水性離子液體的陽離子包括咪唑鹽、吡啶鹽以及季胺鹽等，親水性離子液體的陰離子類型可為四氟硼酸鹽[BF4]-、Br-或Cl-等。
所述的疏水性離子液體的陰離子類型可為六氟磷酸鹽[PF6]-或[(CF3SO2)2N]-等。疏水性離子液體的陽離子為咪唑鹽，優(yōu)選疏水離子液體是[C4mim]PF6(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽)。
所述的咪唑鹽選自1-乙基-3-甲基咪唑[C2mim]+、1-丁基-3-甲基咪唑[C4mim]+、1-辛基-3-甲基咪唑[C8mim]+、1-乙基-2，3-甲基咪唑[C2dmim]+或1-丁基-2，3-甲基咪唑[C4dmim]+中的一種等。
所述的吡啶鹽是1-乙基吡啶[C2py]+或1-丁基-3-甲基咪唑[C4py]+等。
所述的季胺鹽是1，2，3，4-四丁基胺[(C4H9)4N]+或1，2，3-三乙基-4-辛基胺[(C2H5)3NC8H17]+等。
所述的無機鹽是NaH2PO4、Na2HPO4或(NH4)SO4等。
本發(fā)明采用親水離子液體與無機鹽形成的雙水相，將青霉素萃取到離子液體上相。而該相經(jīng)疏水離子液體二次萃取后，親水性離子液體會萃入到疏水離子液體，而青霉素保留在水溶液中，二者順利實現(xiàn)分離。含青霉素的萃余水相可直接進行酶催化反應，而被萃入疏水相的親水離子液體可經(jīng)水洗循環(huán)利用。如圖1所示。
從青霉素的酶催化過程可看出，萃取后水相中的青霉素經(jīng)青霉素?；冈?7℃催化3小時，得到產(chǎn)物6-APA與副產(chǎn)物PAA，產(chǎn)率達95％以上。
從圖2含親水性離子液體[C4mim]BF4與青霉素的水溶液被[C4mim]PF6二次萃取的效果圖看出，當疏水離子液體與親水性離子液體水溶液保持相比在1∶10，隨水溶液中無機鹽含量增加(離子液體雙水相需要一定量的無機鹽)，親水離子液體的二次萃取率逐漸升高，從沒有無機鹽時的35％上升到無機鹽濃度為20％鹽時90％萃取率，而青霉素的萃取率不超過10％，因此，水相中親水離子液體與青霉素實現(xiàn)分離。
本發(fā)明以離子液體雙水相與疏水性離子液體二次萃取結(jié)合的工藝替代傳統(tǒng)青霉素萃取工藝，實現(xiàn)青霉素萃取反應耦合制備半合抗藥物中間體的綠色新工藝。在采用離子液體雙水相萃取發(fā)酵液內(nèi)青霉素的基礎(chǔ)上，其萃取液可利用疏水離子液體進行二次萃取，將所含的大部分親水離子液體從溶液中得以分離，而降低了離子液體含量的青霉素萃余相水溶液可直接用于酶促催化反應，其酶活可達到水相80％以上。整個過程只采用離子液體與無機鹽，屬于綠色化過程，優(yōu)于使用揮發(fā)性有機溶劑傳統(tǒng)工藝。
本發(fā)明二次萃取后的青霉素水溶液，在5～25mg/ml酶用量時酶活能超過純水的80％以上。
本發(fā)明具有以下特點(1)疏水性離子液體對青霉素輕相的萃取作用，可實現(xiàn)親水性離子液體與青霉素水溶液的分離，達到降低酶催化水相中親水離子液體含量的目的。
(2)疏水性離子液體對水相中青霉素萃取率很低，可保證90％青霉素停留在水相。
(3)二次萃取后萃余相的青霉素水溶液可直接進行酶催化反應，酶活性可達純水的70％以上，優(yōu)化達85％。
(4)整個過程只采用離子液體與無機鹽，是完全綠色化過程。
(5)可采用純水及高溫手段將親水離子液體從疏水離子液體中洗脫出來，洗脫率可達83％，實現(xiàn)離子液體原料的循環(huán)再生。
(6)可根據(jù)反應需要，設(shè)計不同結(jié)構(gòu)的離子液體，保證整個萃取催化過程的優(yōu)化。


圖1.本發(fā)明離子液體萃取青霉素及酶促催化反應制備半合抗藥物中間體耦合工藝流程示意圖。
圖2.本發(fā)明實施例1疏水離子液體[C4mim]PF6對親水離子液體與青霉素的萃取率。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述1，疏水離子液體二次萃取分離親水離子液體實施例1取10ml雙水相的離子液體輕相，含47％(w/w)[C4mim]BF4、18％(w/w)Na2HPO4·12H2O及青霉素1.4％，加入2ml[C4mim]PF6，振蕩2分鐘，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為5.8ml，80％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相水溶液體積6.2ml，含1.44％的青霉素以及少量Na2HPO4。取5ml含青霉素和Na2HPO4的水溶液加入15mg固定化青霉素?；?，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為162IU/g，為純水中190IU/g活性的85％。取5ml離子液體萃取相，直接采用1∶1相比的純水洗滌，約52％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例2取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]BF4、9.3％(w/w)Na2HPO4·12H2O及青霉素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2分鐘，靜置分層，疏水相為5.5ml，78％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，6％的青霉素被萃取。上相體積5.5ml，含1.6％的青霉素以及少量Na2HPO4。取5ml含青霉素和Na2HPO4的萃余液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為145IU/g，為純水中190IU/g活性的76％。取5ml離子液體萃取相，1∶1相比的純水70℃洗滌，約93％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例3取10ml雙水相的離子液體輕相，含34.5％(w/w)[C4mim]BF4及21.4％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青霉素0.8％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為3.7ml，82％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，但少于8％的青霉素被萃取。上相體積7.5ml，含0.9％的青霉素以及少量Na2HPO4。取5ml含青霉素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為164IU/g，為純水中190IU/g活性的85％。取3.5ml離子液體萃取相，直接采用1∶1相比的純水洗滌，約56％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例4取10ml雙水相的離子液體輕相，含36％(w/w)[C2mim]BF4及14％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青霉素1％，加入1ml[C2mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為3.8ml，73％的[C2mim]BF4被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相體積7.2ml，含1.6％的青霉素以及少量無機鹽。取5ml含青霉素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為132IU/g，為純水中190IU/g活性的70％。取4ml所得的離子液體下相，采用1∶1相比的純水，并升高溫度到70℃，約91％的[C2mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例5取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]Br及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青霉素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為5.3ml，74％的[C4mim]Br被萃入疏水相，但少于6％的青霉素被萃取。上相體積6.5ml，含1.5％的青霉素以及少量NaH2PO4。取5ml含青霉素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素?；?，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為150IU/g，為純水中190IU/g活性的80％。取5ml離子液體萃取相，直接采用1∶1相比的純水洗滌，約72％的[C4mim]Br從疏水相分離出來。
實施例6取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]Br及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青霉素1％，加入1ml[C4mim][(CF3SO2)2N]，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為5.9ml，85％的[C4mim]Br被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相體積6.1ml，含1.5％的青霉素以及少量無機鹽。取5ml含青霉素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為172IU/g，為純水中190IU/g活性的90％。取5ml離子液體萃取相，直接采用1∶1相比的純水洗滌，約63％的[C4mim]Br從疏水相分離出來。
實施例7取10ml雙水相的離子液體輕相，含43％(w/w)[C4py]BF4及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青霉素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為4.1ml，72％的[C4py]BF4被萃入疏水相，但少于8％的青霉素被萃取。上相體積6.9ml，含1.5％的青霉素以及少量無機鹽。取5ml含青霉素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素?；?，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為156IU/g，為純水中190IU/g活性的82％。取4ml離子液體萃取相，直接采用1∶1相比的純水洗滌，約67％的[C4py]BF4從疏水相分離出來。
實施例8取10ml雙水相的離子液體輕相，含52％(w/w)[(C4H9)4N]Br及20％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青霉素1％，加入1ml[C2mim][(CF3SO2)2N]，振蕩2min，靜置分層，可發(fā)現(xiàn)疏水相為5.1ml，79％的[(C4H9)4N]Br被萃入疏水相，但少于7％的青霉素被萃取。上相體積5.9ml，含1.7％的青霉素以及少量Na2HPO4。取5ml含青霉素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青霉素?；?，37℃反應，分離得到6-氨基青霉烷酸，測得酶活性為142IU/g，為純水中190IU/g活性的75％。取5ml所得的離子液體下相，采用1∶1相比的純水，并升高溫度到70℃，約83％的[(C4H9)4N]Br從疏水相分離出來。
權(quán)利要求
1.一種離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法，其特征是該方法包括以下步驟(1).離子液體雙水相的制備與青霉素的萃取過程向青霉素發(fā)酵液中加入親水離子液體和無機鹽，使混合液中的青霉素質(zhì)量百分含量為0.5～8％，親水離子液體的質(zhì)量百分含量為10～50％，無機鹽的質(zhì)量百分含量為10～30％；攪拌混合后靜置出現(xiàn)平衡的兩相，青霉素進入離子液體輕相；(2).疏水離子液體二次萃取回收離子液體原料取步驟(1)含親水離子液體輕相的萃取水溶液，加入疏水離子液體，將疏水離子液體與親水離子液體的水溶液相比控制在1∶1～1∶30范圍內(nèi)；振蕩離心后，親水離子液體會被萃入到疏水離子液體相中，而萃余相為含青霉素與無機鹽的水溶液；(3).處理后的青霉素水溶液進行酶促催化反應取步驟(2)二次萃取后含青霉素與無機鹽的水溶液，加入固定化青霉素?；福潭ɑ嗝顾仵；冈诨旌弦褐械臐舛瓤刂圃?～25mg/ml之間，37℃振蕩反應，測定初始反應酶活，得到6-氨基青霉烷酸；所述的親水性離子液體的陽離子是咪唑鹽、吡啶鹽或季胺鹽，親水性離子液體的陰離子類型為四氟硼酸鹽、Br-或Cl-；所述的疏水性離子液體的陰離子類型為六氟磷酸鹽或[(CF3SO2)2N]-；疏水性離子液體的陽離子為咪唑鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經(jīng)純水洗脫后的親水離子液體分離析出，用于步驟(1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經(jīng)升溫到70℃以上后的親水離子液體分離析出，用于步驟(1)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的六氟磷酸鹽是1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的咪唑鹽選自1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑、1-辛基-3-甲基咪唑、1-乙基-2，3-甲基咪唑或1-丁基-2，3-甲基咪唑中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的吡啶鹽是1-乙基吡啶或1-丁基吡啶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的季胺鹽是1，2，3，4-四丁基胺或1，2，3-三乙基-4-辛基胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的無機鹽是NaH2PO4、Na2HPO4或(NH4)SO4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(2)取含親水離子液體輕相的萃取水溶液中的親水離子液體的濃度為20～70wt％。
全文摘要
本發(fā)明涉及青霉素發(fā)酵液萃取和酶促催化反應一體化制備半合成抗藥物中間體的工藝方法，特別涉及離子液體萃取青霉素及酶促催化反應耦合制備半合成抗生素6－氨基青霉烷酸的方法。利用親水性離子液體形成的雙水相，將青霉素萃取到含離子液體的上相，用疏水離子液體進行二次萃取，能使親水離子液體被萃取到疏水相中，而萃余相的青霉素水溶液可直接進行酶促催化，酶活可達水相80％以上。本發(fā)明與傳統(tǒng)工業(yè)用有機溶劑從水相萃取青霉素，純化后再進行酶催化制備半合抗藥物的工藝相比，不采用有機溶劑，是完全綠色化過程，同時疏水離子液體的二次萃取能將親水性離子液體從青霉素水溶液中分離出來，保證后續(xù)水相酶催化工藝的效率。
文檔編號C12P37/00GK1948316SQ20051008661
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者夏寒松, 余江, 胡雪生, 劉慶芬, 劉會洲 申請人:中國科學院過程工程研究所