專利名稱：新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型果聚糖蔗糖酶基因，以及該基因所構(gòu)建的工程菌株。本發(fā)明還涉及所述工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖方面的用途。
背景技術(shù)：
果聚糖是一種果糖聚合物，聚合度較低的果聚糖是低聚果糖，具有多種應(yīng)用價值。如在食品工業(yè)中可用作甜味劑和增稠劑，在制藥工業(yè)中可用作血漿供體和抗腫瘤試劑；低聚果糖在化妝品和紡織品方面也有潛在的應(yīng)用價值。
現(xiàn)有技術(shù)對果聚糖的生產(chǎn)是通過選擇恰當?shù)陌l(fā)酵果聚糖的微生物，優(yōu)化發(fā)酵條件或者用基因工程方法改造發(fā)酵微生物等。所述微生物包括Streptococcus salivarius，Erwinia herbicola，Aerobacter levanicum，Bacillus spp.和Zymomonas mobilis等，可用于發(fā)酵蔗糖，得到果聚糖。
運動發(fā)酵單胞菌是一種可發(fā)酵的兼性厭氧的革蘭氏陰性細菌，其具有三種蔗糖水解酶胞內(nèi)蔗糖水解酶sacA(sucrase)和胞外蔗糖水解酶sacC(sucrase)及胞外果聚糖蔗糖酶sacB(levansucrase)。sacA和sacC水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，sacB具有蔗糖水解活性和果聚糖合成活性，其水解蔗糖生成葡萄糖和果聚糖。sacB的蔗糖水解活性是運動發(fā)酵單胞菌總的蔗糖水解活性的1/3。目前常利用該菌經(jīng)E-D途徑對碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖進行代謝，產(chǎn)生乙醇。
盡管在理論上可利用運動發(fā)酵單胞菌進行果聚糖的生產(chǎn)，但效果不好。如用野生型的運動發(fā)酵單胞菌XW101在以蔗糖為發(fā)酵底物時，產(chǎn)生的果聚糖是副產(chǎn)物，濃度很低(4.8g/l)。同時運功發(fā)酵單胞菌果聚糖蔗糖酶合成的果聚糖聚合度太高，而非真正有應(yīng)用價值的低聚果糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種新型的高產(chǎn)低聚果糖的工程菌，使其可用于較大量生產(chǎn)低聚果糖。
本發(fā)明的技術(shù)方案是制備一種新型果聚糖蔗糖酶基因，用于構(gòu)建工程菌株，并用此工程菌發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖。
本發(fā)明人從運動發(fā)酵單胞菌中克隆果聚糖蔗糖酶基因sacB，對其進行定點突變后得到新型果聚糖蔗糖酶基因，將所述基因連接到表達載體中，然后導入到相應(yīng)的宿主菌中，得到高產(chǎn)低聚果糖的基因工程菌。
上述新型果聚糖蔗糖酶基因的序列如SEQ ID NO1所示，其大小為1272bp，該基因所編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；sacB基因的序列如SEQ ID NO3所示。
實驗證實，上述基因工程菌可顯著提高低聚果糖(從4.8g/l到20g/l)的發(fā)酵速度及產(chǎn)率。
本發(fā)明進行了如下實驗A運動發(fā)酵單胞菌XW101總DNA的提取本發(fā)明使用CTAB法提取運動發(fā)酵單胞菌XW101的總DNA；B果聚糖蔗糖酶基因sacB的克隆通過比較相關(guān)基因核苷酸序列，設(shè)計出果聚糖蔗糖酶基因sacB的兩個特異性引物，分別是sacB-F(BamHI)5’-GGATCCGGAATGTTGAACAAAGCAG-3’和sacB-R(SalI)5’-GTCGACGGAATAGGAAGGGTGTC-3’，經(jīng)PCR擴增得到1.3Kb左右的產(chǎn)物。將這一PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)蘭白斑篩選，酶切，瓊脂糖凝膠電泳進行驗證；C果聚糖蔗糖酶基因sacB的定點突變設(shè)計另外兩條中間引物Primer25’-AATGGCGACTGATCGTAAAGAGATAGG-3’，Primer35’-AGTCGCCATTCGACTTATGCCG-3’。分別用sacB-F(BamHI)/Primer2、sacB-R(SalI)/Primer3、sacB-F(BamHI)/sacB-R(SalI)三對引物對果聚糖蔗糖酶基因進行定點突變從而將果聚糖蔗糖酶的296位His變?yōu)锳rg。將PCR擴增得到的1.3Kb產(chǎn)物與pGEM-T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)蘭白斑篩選，酶切，瓊脂糖凝膠電泳后進行測序驗證；D帶有目的基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及其對低聚果糖產(chǎn)率的影響用BamHI和SalI將連在pGEM-T載體上的果聚糖蔗糖酶定點突變基因sacB’切下來，與經(jīng)BamHI和SalI完全酶切的表達載體pET28a重組，得到重組質(zhì)粒pEB1’，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，用含有卡那霉素(10μg/ml)的LB培養(yǎng)基篩選重組子。經(jīng)測序驗證果聚糖蔗糖酶定點突變基因sacB’的編碼框大小為1.272Kb。
實驗室中在同等條件下進行批量發(fā)酵，轉(zhuǎn)化菌低聚果糖的產(chǎn)量為20g/l，較野生型運動發(fā)酵單胞菌XW101有明顯提高，表明轉(zhuǎn)化菌中重組質(zhì)粒攜帶的果聚糖蔗糖酶定點突變基因得到了有效表達。
具體實施例方式以下實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株來源如下BL21/JM109購于中科院生物所pET28a購于北京天為時代公司pGEM-T vector日本寶生物公司市售產(chǎn)品實施例1果聚糖蔗糖酶基因sacB的定點突變1、CTAB法提取細菌總DNA1)取單菌落接種于5ml相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在合適的溫度下培養(yǎng)。根據(jù)細菌的生長率不同培養(yǎng)時間可由幾小時到幾天不等。
2)取1.0ml菌液于1.5ml離心管中，13,000rpm離心2min，棄上清。
3)沉淀重懸于1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室溫13,000rpm離心2min，棄上清。
5)沉淀重懸于550μl 1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃溫育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃溫育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃溫育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混勻。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min。
11)加等體積(0.7～0.8ml)氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩混勻。
12)室溫，13,000rpm離心10min。
13)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。
14)重復第12)步。
15)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕振蕩混勻。
16)重復第12)步。
17)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入0.6體積異丙醇，混勻后室溫靜置60min。
18)20℃13,000rpm離心20min。
19)棄上清，加500μl 70％乙醇，輕輕顛倒數(shù)次(洗鹽)。
20)4℃15,000rpm離心20min。
21)重復洗鹽兩次。
22)倒置離心管，干燥DNA沉淀10～15min。
23)DNA沉淀溶于20μl無菌水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、果聚糖蔗糖酶基因的克隆PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl50μM sacB-F 0.5μl50μM sacB-R 0.5μl模板DNA2μl(200-300ng)5U/μl Ex Taq酶0.5μl加無菌水至20μlPCR反應(yīng)條件1、94℃預變性 5min2、94℃30s55℃ 1min72℃ 1min(25個循環(huán))3、72℃10min4℃保存將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上連接體系與連接反應(yīng)2×buffer 5μlpGEM-T 0.5μlPCR產(chǎn)物3.5μlT4連接酶(3U/μl) 1μl4℃過夜連接。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)蘭白斑篩選，酶切，瓊脂糖凝膠電泳后進行測序驗證電擊轉(zhuǎn)化及蘭白斑篩選感受態(tài)細胞的制備所有步驟均在冰浴條件下操作
1)挑取LB固體培養(yǎng)基上的新鮮單菌落，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)2小時，菌液OD值達到0.5-0.6，冰上冷卻培養(yǎng)物至0℃。
2)將菌液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，4℃4000g收集菌體，去上清，在吸水紙上倒置空干。
3)加入20ml的預冷10％甘油，置于冰上，不時輕輕顛倒離心管，將菌體泡溶。
4)4℃4000g收集菌體，去上清，在吸水紙上倒置空干。
5)加入10ml的預冷10％甘油，輕搖離心管，將菌體泡溶。
6)重復步驟4)7)加入10ml的預冷10％甘油，輕搖離心管，將菌液泡溶。
8)重復步驟4)9)加入200ul的預冷10％甘油，溶解菌體，分裝成40ul/1.5ml離心管。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞1)將電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD Gene PulserII System)調(diào)到2.5kV，脈沖控制器調(diào)到400Ω。
2)將2ul連接產(chǎn)物(水溶)加入到盛有40ul新鮮制備的或融化的凍存的感受態(tài)細胞小管中，混勻。
3)將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移到預冷的電轉(zhuǎn)化池中，吸干池的外表面，然后放入樣品槽中。
4)進行脈沖電轉(zhuǎn)化，然后取出電轉(zhuǎn)化池，馬上加入1ml LB培養(yǎng)液，于37℃中訊速振蕩培養(yǎng)45min。
5)取200ul涂布于含有氨芐青霉素(50μg/ml)、IPTG(4μg/ml)、x-gal(32μg/ml)的LB平板(4μl IPTG+40μl x-gal混合后涂于平板上)上。
BamHI和SalI酶切重組載體限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體系與酶切反應(yīng)10×T buffer3μl10×BSA 2μlDNA樣品 3μl限制性內(nèi)切酶BamHI 0.5μl限制性內(nèi)切酶SalI0.5μl加無菌水至20μl37℃酶切兩小時，瓊脂糖凝膠電泳正確后測序驗證。
3、三步PCR反應(yīng)對果聚糖蔗糖酶基因sacB進行定點突變PCR反應(yīng)體系反應(yīng)序號12PCR產(chǎn)物 AB CD
PCR擴增的sacB 0.5μl 0.5μl5’引物sacB-F 0.5μl Primer3 0.5μl3’引物Primer2 0.5μl sacB-R 0.5μl10×PCR buffer 2μl 2μl2.5mMdNTP 2μl 2μl5U/μl Ex Taq酶0.5μl 0.5μl加無菌水至20μlPCR反應(yīng)條件1、94℃預變性 5min2、94℃30s50℃ 2min72℃ 1min(25個循環(huán))3、72℃10min4℃保存PCR反應(yīng)體系反應(yīng)序號 3PCR產(chǎn)物 AD(sacB’)模板1AB 0.5μl模板2CD 0.5μl5’引物sacB-F 0.5μl3’引物sacB-R 0.5μl10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl5U/μl Ex Taq酶0.5μl加無菌水至20μlPCR反應(yīng)條件1、94℃預變性 5min2、94℃30s50℃ 2min72℃ 1min(25個循環(huán))
3、72℃ 10min4℃保存將最終得到的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)蘭白斑篩選，酶切，瓊脂糖凝膠電泳后進行測序驗證。連接轉(zhuǎn)化及驗證法同上。
4、用BamHI和SalI酶切重組質(zhì)粒得到果聚糖蔗糖酶定點突變基因sacB’與相同酶切的表達載體pET28a連接，得到重組質(zhì)粒pEB1’。酶切連接方法同上。
5、重組質(zhì)粒pEB1’轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用含有卡那霉素(10μg/ml)的LB培養(yǎng)基篩選重組子。轉(zhuǎn)化法同上。
實施例2酶活及產(chǎn)物的產(chǎn)量測定1.培養(yǎng)條件1.1培養(yǎng)基成分蔗糖10％、酵母浸膏0.5％、蛋白胨1％、氯化鈉1％、pH7.01.2培養(yǎng)條件37攝氏度振蕩培養(yǎng)2酶來源及酶活性的測定2.1酶來源將按上述條件培養(yǎng)的細胞經(jīng)3000g，4攝氏度，離心15分鐘，培養(yǎng)液作為胞外酶，用50mM醋酸緩沖液(pH5.0)將細胞洗三次并重懸浮，超聲波振蕩破碎細胞，10000g，4攝氏度，離心10分鐘，上清液作為胞內(nèi)酶。
2.2酶活性的定義在實驗條件下一分鐘內(nèi)水解蔗糖得到1μmol的還原糖所需的酶量定義為一個蔗糖水解酶單位。
在實驗條件下一分鐘內(nèi)水解蔗糖得到1μg果聚糖所需的酶量定義為一個果聚糖合成酶單位。
2.3酶活性的測定反應(yīng)混合物2ml酶液+2ml 5％蔗糖(溶于50mM pH5.0醋酸緩沖液中)蔗糖水解酶活性通過酶水解蔗糖釋放的還原糖來測定，反應(yīng)混合物30攝氏度溫育30分鐘，。
果聚糖合成酶活性是通過將反應(yīng)混合物30攝氏度溫育120分鐘，540nm測生成的果聚糖的光吸收值來測定。
2.3.1蔗糖酶水解活性的測定
2.3.1.1葡萄糖標準溶液的配制準確稱取100mg分析純的無水葡萄糖(預先105攝氏度干燥)，少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，定容到刻度，搖勻。濃度為1mg/ml。
取九支25×250mm試管，分別按表加入試劑

將各管溶液混合均勻，沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即冷卻至室溫，再向每管中加入10ml蒸餾水，搖勻，于540nm測A值。以葡萄糖μmol數(shù)為橫軸，A值為縱軸，做標準曲線。
2.3.1.2還原糖的測定取兩支試管分別加入用pH5，50mM醋酸緩沖液適當稀釋過的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活(做對照)，另一支做測定管；把兩支試管和5％的蔗糖溶液都放在30攝氏度水浴中預熱恒溫；上述兩試管中分別加入2ml 5％的蔗糖液，并準確計算時間，30分鐘后于測定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3，5二硝基水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加去離子水稀釋至10ml，搖勻，于540nm處測光密度。在723分光光度計上，可指示出光密度值所對應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計算酶活力蔗糖酶活力單位＝葡萄糖μmol數(shù)×9×30×酶的稀釋倍數(shù)2.3.2果聚糖及果聚糖合成酶活力單位測定準確稱取20mg分析純的無水果聚糖(預先105攝氏度干燥)，少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到5ml容量瓶中，定容到刻度，搖勻，濃度為4mg/ml。
取九支25×250mm試管，分別按表加入試劑

向每管中加入蒸餾水，定容至5ml搖勻，于540nm測A值。以果聚糖μg數(shù)為橫軸，A值為縱軸，做標準曲線。
取兩支試管分別加入用pH5，50mM醋酸緩沖液適當稀釋過的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活(做對照)，另一支做測定管；把兩支試管和5％的蔗糖溶液都放在30攝氏度水浴中預熱恒溫；上述兩試管中分別加入2ml 5％的蔗糖液，并準確計算時間，120分鐘后于測定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加去離子水稀釋至10ml，搖勻，于540nm處測光密度。在723分光光度計上，可指示出光密度值所對應(yīng)的果聚糖含量，按下面公式計算酶活力果聚糖合成酶活力單位＝果聚糖μg數(shù)×9×120×酶的稀釋倍數(shù)3.果聚糖產(chǎn)量測定將發(fā)酵液經(jīng)3000g，4攝氏度，離心15分鐘去菌體，上清液(或?qū)⑸锨逡河镁凭恋?，干燥，用水溶解?于540nm處測光密度，根據(jù)標準曲線計算果聚糖產(chǎn)量。
4.結(jié)果分析在誘導物IPTG或乳糖存在下，酶大量分泌到胞外合成果聚糖，并在五到八小時達到最大值，最大可達20g/L，遠大于野生菌運動發(fā)酵單胞菌XW101果聚糖產(chǎn)量(4.8g/L)。
附錄SEQ ID NO1新型果聚糖蔗糖酶基因核苷酸序列atgttgaaca aagcaggcat tgcagagccg agcttgtgga ctcgtgcgga tgctatgaaa 60gtgcataccg atgatcccac ggcaaccatg cctaccattg attatgactt tcctgtcatg120accgataaat attgggtttg ggacacttgg cccttacgcg atattaacgg tcaggttgtc180ggcttccaag gttggtcggt gatctttgct ttggtcgctg atcgcaccaa atatggttgg240cataatcgca atgatggcgc cagaattggt tatttctatt cacgtggtgg aagcaactgg300atttttggtg gtcatcttct gaaagatggt gccaatccgc gttcttggga atggtctggt360tgcacgatta tggcaccggg tacggccaat tctgtcgaag tattctttac gtctgtcaat420gatacgccgt cagaatccgt tcctgcccag tgcaagggct acatctatgc cgatgataaa480tcggtatggt ttgacggttt tgataaagtg accgatctgt ttcaggcaga tggcctttat540tatgctgatt atgcagaaaa taatttctgg gatttccgcg atccgcatgt cttcattaac600cccgaagatg gcaaaacata tgccttgttt gaaggtaatg ttgccatgga gcgcggtacg660gtcgctgttg gcgaagagga aattggccct gttccaccaa aaaccgaaac gcctgatggc720gctcgctatt gtgctgctgc cattggtatt gcacaggccc ttaatgaagc ccgcaccgaa780tggaaattgt taccgccttt ggtaaccgcc tttggtgtca atgaccagac ggagcggcct840
catgtcgttt tccagaatgg cttgacctat ctctttacga tcagtcgcca ttcgacttat 900gccgatggtt tgtcgggtcc tgatggggtt tatggctttg tttctgaaaa cggcattttt 960ggcccttatg aaccgctgaa tggttccggt ttggttctcg gtaacccttc ttcacagcct1020tatcagactt attcccatta tgtgatgaca aatgggctgg tgacctcctt cattgatacc1080attccgagtt ctgacccgaa tgtctatcgt tatggtggca ccttggcacc gaccatcaaa1140ttggaattgg ttggccatcg cagcttcgtt accgaagtga agggttatgg ctatattccg1200ccacagatcg agtggttggc agaagatgaa tcttctaatt ctgcggcagc cctgtcttta1260ttgaataaat aa1272SEQ ID NO2新型果聚糖蔗糖酶基因所編碼的氨基酸序列Met Leu Asn Lys Ala Gly Ile Ala Glu Pro Ser Leu Trp Thr Arg Ala1 5 10 15Asp Ala Met Lys Val His Thr Asp Asp Pro Thr Ala Thr Met Pro Thr20 25 30Ile Asp Tyr Asp Phe Pro Val Met Thr Asp Lys Tyr Trp Val Trp Asp35 40 45
Thr Trp Pro Leu Arg Asp Ile Asn Gly Gln Val Val Gly Phe Gln Gly50 55 60Trp Ser Val Ile Phe Ala Leu Val Ala Asp Arg Thr Lys Tyr Gly Trp65 70 75 80His Asn Arg Asn Asp Gly Ala Arg Ile Gly Tyr Phe Tyr Ser Arg Gly85 90 95Gly Ser Asn Trp Ile Phe Gly Gly His Leu Leu Lys Asp Gly Ala Asn100 105 110Pro Arg Ser Trp Glu Trp Ser Gly Cys Thr Ile Met Ala Pro Gly Thr115 120 125Ala Asn Ser Val Glu Val Phe Phe Thr Ser Val Asn Asp Thr Pro Ser130 135 140Glu Ser Val Pro Ala Gln Cys Lys Gly Tyr Ile Tyr Ala Asp Asp Lys145 150 155 160Ser Val Trp Phe Asp Gly Phe Asp Lys Val Thr Asp Leu Phe Gln Ala165 170 175
Asp Gly Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr Ala Glu Asn Asn Phe Trp Asp Phe180 185 190Arg Asp Pro His Val Phe Ile Asn Pro Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Ala195 200 205Leu Phe Glu Gly Asn Val Ala Met Glu Arg Gly Thr Val Ala Val Gly210 215 220Glu Glu Glu Ile Gly Pro Val Pro Pro Lys Thr Glu Thr Pro Asp Gly225 230 235 240Ala Arg Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Ala Gln Ala Leu Asn Glu245 250 255Ala Arg Thr Glu Trp Lys Leu Leu Pro Pro Leu Val Thr Ala Phe Gly260 265 270Val Asn Asp Gln Thr Glu Arg Pro His Val Val Phe Gln Asn Gly Leu275 280 285Thr Tyr Leu Phe Thr Ile Ser Arg His Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Leu290 295 300
Ser Gly Pro Asp Gly Val Tyr Gly Phe Val Ser Glu Asn Gly Ile Phe305 310 315 320Gly Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Gly Ser Gly Leu Val Leu Gly Asn Pro325 330 335Ser Ser Gln Pro Tyr Gln Thr Tyr Ser His Tyr Val Met Thr Asn Gly340 345 350Leu Val Thr Ser Phe Ile Asp Thr Ile Pro Ser Ser Asp Pro Asn Val355 360 365Tyr Arg Tyr Gly Gly Thr Leu Ala Pro Thr Ile Lys Leu Glu Leu Val370 375 380Gly His Arg Ser Phe Val Thr Glu Val Lys Gly Tyr Gly Tyr Ile Pro385 390 395 400Pro Gln Ile Glu Trp Leu Ala Glu Asp Glu Ser Ser Asn Ser Ala Ala405 410 415Ala Leu Ser Leu Leu Asn Lys420
SEQ ID NO3sacB基因序列atgttgaaca aagcaggcat tgcagagccg agcttgtgga ctcgtgcgga tgctatgaaa 60gtgcataccg atgatcccac ggcaaccatg cctaccattg attatgactt tcctgtcatg120accgataaat attgggtttg ggacacttgg cccttacgcg atattaacgg tcaggttgtc180agcttccaag gttggtcggt gatctttgct ttggtcgctg atcgcaccaa atatggttgg240cataatcgca atgatggcgc cagaattggt tatttctatt cacgtggtgg aagcaactgg300atttttggtg gtcatcttct gaaagatggt gccaatccgc gttcttggga atggtctggt360tgcacgatta tggcaccggg tacggccaat tctgtcgaag tattctttac gtctgtcaat420gatacgccgt cagaatccgt tcctgcccag tgcaagggct acatctatgc cgatgataaa480tcggtatggt ttgacggttt tgataaagtg accgatctgt ttcaggcaga tggcctttat540tatgctgatt atgcagaaaa taatttctgg gatttccgcg atccgcatgt cttcattaac600cccgaagatg gcaaaacata tgccttgttt gaaggtaatg ttgccatgga gcgcggtacg660gtcgctgttg gcgaagagga aattggccct gttccaccaa aaaccgaaac gcctgatggc720gctcgctatt gtgctgctgc cattggtatt gcacaggccc ttaatgaagc ccgcaccgaa780tggaaattgt taccgccttt ggtaaccgcc tttggtgtca atgaccagac ggagcggcct840catgtcgttt tccagaatgg cttgacctat ctctttacga tcagtcatca ttcgacttat900
gccgatggtt tgtcgggtcc tgatggggtt tatggctttg tttctgaaaa cggcattttt 960ggcccttatg aaccgctgaa tggttccggt ttggttctcg gtaacccttc ttcacagcct1020tatcagactt attcccatta tgtgatgaca aatgggctgg tgacctcctt cattgatacc1080attccgagtt ctgacccgaa tgtctatcgt tatggtggca ccttggcacc gaccatcaaa1140ttggaattgg ttggccatcg cagcttcgtt accgaagtga agggttatgg ctatattccg1200ccacagatcg agtggttggc agaagatgaa tcttctaatt ctgcggcagc cctgtcttta1260ttgaataa 1268
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO1所示的DNA序列。
2.權(quán)利要求1所示基因編碼的蛋白，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.含有權(quán)利要求1所示基因的重組質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，是含有權(quán)利要求1所示基因在大腸桿菌表達的質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求1所述基因的用途，是構(gòu)建高產(chǎn)低聚果糖的基因工程菌。
6.一種高產(chǎn)低聚果糖的基因工程菌，特征是含有權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求6所述高產(chǎn)低聚果糖的基因工程菌的制備方法，是將權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至受體菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型果聚糖蔗糖酶基因及其用途。本發(fā)明制備了一種新型果聚糖蔗糖酶基因并構(gòu)建了基因工程菌，此工程菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖。實驗證實，上述基因工程菌可顯著提高低聚果糖的發(fā)酵速度及產(chǎn)率。
文檔編號C12N9/00GK1772903SQ20051008662
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日
發(fā)明者林敏 , 李淑英, 張維, 徐玉泉, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所