專利名稱：使用新型菌種保藏技術(shù)制造多不飽和脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以下內(nèi)容，其包括產(chǎn)生含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物的微生物，且含有上述微生物的微生物生物量，及由其生物量提取粗制油及/或粗磷脂，以及由粗制油及/或粗磷脂精煉提取精制油及/或精制磷脂的制造方法；還包括經(jīng)添加了該生物量及該油脂(粗制油及/或精制油)及/或該磷脂(粗磷脂及/或精制磷脂)制成的飲料、食品、治療用營(yíng)養(yǎng)食品、飼料及醫(yī)藥制品。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的多不飽和脂肪酸(以下稱“PUFA”)的生物合成有兩大代表系列，即ω3系列和ω6系列(ω表示從脂肪酸的甲基末端開(kāi)始數(shù)，第一個(gè)雙鍵所處位置的碳原子數(shù))，例如ω6系列是由亞油酸(18:2ω6)反復(fù)進(jìn)行去飽和與碳鏈延長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)換為γ-亞麻酸(18:3ω6)、二同型(dihomo)-γ-亞麻酸(20:3ω6)、花生四烯酸(20:4ω6)及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)的。
同樣ω3系列是由α-亞麻酸(18:3ω3)反復(fù)進(jìn)行去飽和與碳鏈延長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)換為二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)的。眾所周知，ω3系列的PUFA中，二十碳五烯酸(以下稱“EPA”)、二十二碳六烯酸(以下稱“DHA”)在動(dòng)脈硬化、血栓等成人病的預(yù)防效果上，在抗癌作用以及提高學(xué)習(xí)能力等方面尤其具有多種生理機(jī)能，并在醫(yī)藥、特定保健食品的利用上也多有嘗試。但近來(lái)ω3系列以外的PUFA(ω6系列及ω9系列)的生理機(jī)能也受到關(guān)注。
花生四烯酸在構(gòu)成血液、肝臟等重要器官的脂肪酸中約占10％左右(例如，人體血液的磷脂中脂肪酸的組成比為花生四烯酸占11％、二十碳五烯酸占1％、二十二碳六烯酸占3％)，其作為細(xì)胞膜的主要構(gòu)成成分在參與細(xì)胞膜流動(dòng)性的調(diào)節(jié)及體內(nèi)代謝上表現(xiàn)出各種功能，同時(shí)，作為前列腺素類的直接前驅(qū)物質(zhì)也起著重要的作用。特別是近來(lái)作為嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)成份之一的花生四烯酸，還以作為表示神經(jīng)活性作用的內(nèi)源性大麻酯(Cannabinoids)(2-四氫大麻酚(Arachidonoyl)單甘油、內(nèi)源性大麻酯(Anandamide))的結(jié)構(gòu)脂肪酸而引人注目。通常來(lái)說(shuō)，攝取富含亞油酸的食品可轉(zhuǎn)換成花生四烯酸，但由于成人病患者及其易患人群、嬰兒、老年人的體內(nèi)參與生物合成的酶活力低下，易導(dǎo)致花生四烯酸不足，所以應(yīng)直接攝取以花生四烯酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的油脂(甘油三酯)。
對(duì)于ω3系列PUFA的EPA和DHA，其豐富的供給源為魚(yú)油，而ω6系列PUFA的γ-亞麻酸、二同型(dihomo)-γ-亞麻酸、花生四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)，從一般的油脂供給源中幾乎得不到，目前一般使用由微生物發(fā)酵獲得的含有以PUFA為結(jié)構(gòu)脂肪酸的油脂(以下稱“含有PUFA的油脂”)。例如，推薦使用以下方法，通過(guò)培養(yǎng)各種能產(chǎn)生含有以花生四烯酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的油脂的微生物(以下稱“含有花生四烯酸的油脂”)，獲得含有花生四烯酸的油脂的方法。
其中已知，特別是通過(guò)使用被孢霉屬微生物，可得到在結(jié)構(gòu)脂肪酸中花生四烯酸占較高比例的油脂(以下稱“含有高比例花生四烯酸的油脂”)(特開(kāi)昭63-44891、特開(kāi)昭63-12290)。近年來(lái)，作為花生四烯酸必不可少的用途，例如在嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說(shuō)在配方奶粉中已開(kāi)始使用由發(fā)酵獲得的含有花生四烯酸的油脂。此外，含有花生四烯酸的油脂的新成果(特開(kāi)2003-48831具有預(yù)防或改善由腦機(jī)能下降引起的癥狀或疾病作用的合成物)也已漸趨明了，并期待今后有更大的進(jìn)展。
由培養(yǎng)被孢霉屬微生物獲得的油脂，其大部分為甘油三酯(約占重量的70％以上)和磷脂。食用油脂的形態(tài)為甘油三酯，以該用途為目的時(shí)，可從培養(yǎng)微生物時(shí)獲得的菌體生物量中，提取由菌生成的原始油脂(將從菌體中經(jīng)提取獲得的油脂，稱“粗制油”)，再將此粗制油經(jīng)食用油的精煉工序(脫膠、脫酸、脫臭、脫色)除去磷脂獲得精制油。
培養(yǎng)被孢霉屬微生物所得的含有PUFA的油脂因在菌絲內(nèi)蓄積，所以為使該油脂的生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)化，需進(jìn)行更高濃度的培養(yǎng)，以提高培養(yǎng)液中含有PUFA的油脂的產(chǎn)量。培養(yǎng)液中含有PUFA的油脂的產(chǎn)量是由菌體濃度和菌體中含有PUFA的油脂的含量積算而得的，所以需同時(shí)提高菌體濃度和菌體中含有PUFA的油脂二者的含量。為提高菌體濃度，一般可提高培養(yǎng)基中可轉(zhuǎn)換成菌體成分的氮源濃度。
為提高菌體中含有PUFA的油脂的含量，須將菌形態(tài)控制在良好狀態(tài)，且需供給充足的氧。已知控制菌形態(tài)的方法有使培養(yǎng)基中鹽類組成最優(yōu)化等方法(再公表特許98/029558)，另外，已知有關(guān)供給氧的方法有加壓培養(yǎng)法、氧富集空氣通氣法等方法(特開(kāi)平06-153970)。但由于菌體受培養(yǎng)條件微小變化的影響，所以即使有上述方法，也很難確保培養(yǎng)的重復(fù)性，在制造時(shí)也不能達(dá)到穩(wěn)定的生產(chǎn)。
專利文獻(xiàn)1特開(kāi)昭63-44891號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開(kāi)63-12290號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3特開(kāi)2003-48831號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4再公表特許98/029558號(hào)專利文獻(xiàn)5特開(kāi)平06-153970號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容因此，為確保通過(guò)微生物進(jìn)行含有PUFA的油脂的穩(wěn)定生產(chǎn)，開(kāi)發(fā)確保培養(yǎng)重復(fù)性的方法是眾望所歸的。
本發(fā)明者等在通過(guò)微生物培養(yǎng)進(jìn)行含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生產(chǎn)中，對(duì)于影響培養(yǎng)菌體增殖期的培養(yǎng)初始階段的有關(guān)條件進(jìn)行銳意研究，其結(jié)果通過(guò)改善從前工程中獲得菌絲或孢子的移植條件，提高了培養(yǎng)的重復(fù)性，同時(shí)找到能穩(wěn)定生產(chǎn)含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的方法。
因此本發(fā)明以改善從前工程中獲得菌絲或孢子的移植條件為特征，通過(guò)培養(yǎng)重復(fù)性的改善及含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的穩(wěn)定生產(chǎn)，提供一種含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或含有PUFA的菌體的制造方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種利用微生物，可產(chǎn)生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物的微生物的保藏方法，其包括(a)在含有由無(wú)機(jī)鹽類和糖類為營(yíng)養(yǎng)源且pH為4～7的孢子形成培養(yǎng)基上使孢子形成；(b)把上述(a)中得到的孢子懸浮于滅菌水或表面活性劑及/或含有無(wú)機(jī)鹽類的滅菌水中制成孢子懸浮液，再加入占總?cè)芤?～15％的冷凍保護(hù)劑制成冷凍保藏孢子懸浮液；(c)將上述(b)中制成的冷凍保藏孢子懸浮液置于-100℃～-20℃保藏。
在上述方法中，上述無(wú)機(jī)鹽類從硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸美、氯化鉀及硫酸亞鐵中優(yōu)選，且至少選擇一種；上述孢子形成培養(yǎng)基優(yōu)選pH為4～7的Czapek瓊脂培養(yǎng)基或Czapek-dox瓊脂培養(yǎng)基。
在上述方法中，冷凍保護(hù)劑優(yōu)選甘油。
上述多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物是，例如以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的甘油三酯或以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的磷脂，上述多不飽和脂肪酸優(yōu)選ω6系列多不飽和脂肪酸、ω3系列多不飽和脂肪酸或ω9系列多不飽和脂肪酸或這些系列的組合。
上述ω6系列多不飽和脂肪酸優(yōu)選9，12-十八碳二烯酸(亞油酸)18:2ω6、6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亞麻酸)18:3ω6、8，11，14-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-γ-亞麻酸)20:3ω6、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)20:4ω6、7，10，13，16-(二十二碳四烯酸)22:4ω6或4，7，10，13，16-(二十二碳五烯酸)22:5ω6。
上述ω3系列多不飽和脂肪酸優(yōu)選9，12，15-十八碳三烯酸(α-亞麻酸)18:3ω3、6，9，12，15-十八碳四烯酸(Stearidonie acid)18:4ω3、11，14，17-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-α-亞麻酸)20:3ω3、8，11，14，17-二十碳四烯酸20:4ω3、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸20:5ω3、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸22:5ω3或4，7，10，13，16，19-(二十二碳六烯酸)22:6ω3。
上述ω9系列多不飽和脂肪酸優(yōu)選6，9-十八碳二烯酸18:2ω9、8，11-二十碳二烯酸20:2ω9或5，8，11-二十碳三烯酸(M酸(Meadacid))20:3ω9。
在上述方法中，上述微生物優(yōu)選被孢霉(Mortiere11a)屬，例如高山被孢霉(Mortierellaalpina)。
本發(fā)明還涉及多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物的制造方法，其特征為使用由上述方法保藏的微生物。
更詳細(xì)地說(shuō)，以液體培養(yǎng)中被孢霉屬霉菌的實(shí)時(shí)變化為特征，首先由菌體增殖引起細(xì)胞質(zhì)增加(菌體增殖期)。從細(xì)胞質(zhì)增加基本停止時(shí)，含有PUFA的油脂在菌體內(nèi)的蓄積開(kāi)始活躍(油脂蓄積期)，最后在細(xì)胞內(nèi)蓄積了大量含有PUFA的油脂。本發(fā)明者曾報(bào)導(dǎo)過(guò)菌體增殖期約為2日，油脂蓄積期約為6日的培養(yǎng)(J.Biosci.Bioeng.，87489-494(1999))。
而且有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為在菌體增殖期菌形態(tài)已基本確定，培養(yǎng)初期的條件設(shè)定及管理是非常重要的。盡管培養(yǎng)初期的條件設(shè)定及管理的重要性已被指出，但對(duì)培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的條件設(shè)定，特別是有關(guān)菌絲或孢子的移植條件仍沒(méi)有成文的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明者就此著眼，銳意研究，發(fā)現(xiàn)移植方法對(duì)培養(yǎng)結(jié)果有很大影響且改善移植方法對(duì)提高含有PUFA的油脂的生產(chǎn)率有很大貢獻(xiàn)的結(jié)論。
為得到含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂)，通過(guò)微生物的液體培養(yǎng)，首先將保藏菌種接種在少量培養(yǎng)液中，使其開(kāi)始增殖(種子培養(yǎng)第一階段)。之后向大容量培養(yǎng)基中依次接種進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，本培養(yǎng)指的是為得到含有PUFA的油脂，將回收微生物生物量作為培養(yǎng)的最后階段的培養(yǎng)。另外，種子培養(yǎng)是指依次傳代培養(yǎng)的同時(shí)逐級(jí)擴(kuò)大產(chǎn)量的各階段培養(yǎng)。
菌株的保藏方法已知的有將瓊脂斜面培養(yǎng)基(斜面slant)中培養(yǎng)的菌置于5℃冷藏冰箱或-20℃冷凍冰箱中保藏的方法，把霉菌孢子懸浮液置于5℃冷藏冰箱內(nèi)保藏的方法，添加冷凍保護(hù)劑置于液氮罐或置于用液氮獲得的-150℃～-196℃的超低溫中的保藏方法，土壤培養(yǎng)干燥法及將菌株冷凍干燥后冷藏保藏的方法等(《發(fā)酵工程學(xué)的基礎(chǔ)》(発酵工學(xué)の基礎(chǔ))(1988)、石崎文彬譯、學(xué)會(huì)出版中心(學(xué)會(huì)出版センタ一))。
另外，在《Maintaining Cultures for Biotechnology andIndustry(1996).edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt，Academic Press》中，對(duì)采用斜面-20℃保藏、液氮保藏及冷凍干燥保藏的方法進(jìn)行了比較，歸納了其對(duì)存活率和保持生產(chǎn)率的影響，此報(bào)導(dǎo)指出，-20℃斜面保藏法可維持最佳的存活率和保持生產(chǎn)率(同書(shū)、P.25)。
另外霉菌在存活狀態(tài)下很難保持純種和穩(wěn)定，且無(wú)廣泛適用于全部霉菌的方法，但普遍認(rèn)為在液氮中保藏是最理想的(同書(shū)、P.105)。而且縱覽各種冷凍保護(hù)劑的使用例，冷凍保護(hù)劑與液氮保藏或冷凍干燥法的結(jié)合使用為傳統(tǒng)技術(shù)(同書(shū)、P.118、Table 4)。因液氮在一個(gè)大氣壓下的沸點(diǎn)為-195.8℃，所以在液氮條件下保藏溫度約可達(dá)-196℃。
被孢霉屬霉菌的保藏方法及用于種子培養(yǎng)的接種方法，使用的是本發(fā)明者等(J.Am.Oil Chem.Soc.，751501-1505(1998))中所述的，由Czapek瓊脂培養(yǎng)基制成斜面的冷藏保藏法。Park等的報(bào)告(Biotechnol.Bioprocess Eng.，6161-166(2001))中采用的是用瓊脂培養(yǎng)基斜面配制103spores/mL的孢子懸浮液，之后再用此懸液在培養(yǎng)基中進(jìn)行接種的方法。
本發(fā)明者認(rèn)為培養(yǎng)初期的條件設(shè)定及管理是非常重要的，所以針對(duì)影響培養(yǎng)初期的菌株保藏的重要性進(jìn)行深入研究。其結(jié)果找到不屬于已報(bào)導(dǎo)的斜面保藏、液氮保藏或冷凍干燥等任何一種的新型保藏方法，即添加冷凍保護(hù)劑后置于-100℃-20℃保藏的方法且發(fā)現(xiàn)其有效性，并且找到優(yōu)秀的孢子懸浮液的配制方法。
因此本發(fā)明使用通過(guò)新型保藏菌株制備法制備及保藏方法保藏的菌株進(jìn)行接種培養(yǎng)，并以其為特征，通過(guò)改善培養(yǎng)重復(fù)性和進(jìn)行穩(wěn)定的含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生產(chǎn)，提供一種含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或PUFA含有菌體的制造方法。
本發(fā)明使用通過(guò)新型保藏菌株制備法制備及保藏方法保藏的菌株進(jìn)行接種培養(yǎng)，涉及一種含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的生產(chǎn)及產(chǎn)生該化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的菌體的制造方法。
因此，培養(yǎng)能產(chǎn)生含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物是必須的。此處所提到的微生物是指產(chǎn)生甘油三酯及/或磷脂的微生物，其主要結(jié)構(gòu)脂肪酸為碳數(shù)18以上雙鍵為3個(gè)以上的ω6系列多不飽和脂肪酸、碳數(shù)18以上雙鍵為2個(gè)以上的ω9系列多不飽和脂肪酸及碳數(shù)18以上雙鍵為3個(gè)以上的ω3系列多不飽和脂肪酸中至少一種多不飽和脂肪酸。
并且碳數(shù)18以上雙鍵為3個(gè)以上的ω6系列多不飽和脂肪酸可為γ-亞麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、二同型(dihomo)-γ-亞麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22∶4ω6)及DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)，碳數(shù)18以上雙鍵為2個(gè)以上的ω9系列多不飽和脂肪酸可為6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸及M酸(Mead acid)(5，8，11-二十碳三烯酸)，碳數(shù)18以上雙鍵為3個(gè)以上的ω3系列多不飽和脂肪酸可為α-亞麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20∶4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)及DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
因此，本發(fā)明中只要是能產(chǎn)生含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物均可使用。例如具有生產(chǎn)油脂(甘油三酯)能力的微生物，構(gòu)成此油脂的結(jié)構(gòu)脂肪酸為花生四烯酸，此微生物可為屬于被孢霉屬(Mortierella)、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、毛霉屬(Mucor)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲(chóng)霉屬(Entomophthora)、刺孢囊霉屬(Echinosporangium)、水霉屬(Saprolegnia)的微生物。
被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)的微生物有例如長(zhǎng)孢被孢霉(Mortierellaelongata)、微小被孢霉(Mortierellaexigua)、喜濕被孢霉(Mortierellahygrophila)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)等。具體地說(shuō)可以是長(zhǎng)孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571、喜濕被孢霉(Mortierellahygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierellaalpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的菌株。
例如產(chǎn)生DHA的微生物可為屬于(Crypthecodenium)、(Thrautochytrium)、(Schizochytrium)、(Ulkenia)、(Japonochytrium)或(Haliphthoros)的微生物。
這些菌株中任一種均可從日本的大阪市發(fā)酵研究所(IFO)、美國(guó)典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection.ATCC)及荷蘭的霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))中不受限制地得到。另外也可使用本發(fā)明研究小組從土壤中分離的菌株高山被孢霉1S-4株和菌株長(zhǎng)孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703號(hào))(微工研條寄第1239號(hào))。
為培養(yǎng)本發(fā)明所使用的菌株，首先需制備獲得菌的保藏菌株。作為保藏菌株的制備方法，先要配制孢子形成培養(yǎng)基。孢子形成培養(yǎng)基時(shí)由硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸美、氯化鉀及硫酸亞鐵及糖類的全部或一部分配制的，pH為4～7，優(yōu)選為5～6.5。在此配制培養(yǎng)基中加入瓊脂，經(jīng)加熱滅菌后冷卻凝固，把其產(chǎn)物作為孢子形成培養(yǎng)基。只要能使菌絲增殖和孢子形成，對(duì)孢子形成培養(yǎng)基無(wú)特別要求，其特征為把pH調(diào)至適合孢子形成的4～7范圍內(nèi)。
具體舉例，如在Czapek瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將pH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。再舉一例，如在Czapek-dox瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將pH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。
用此方法在試管內(nèi)制成斜面培養(yǎng)基(slant培養(yǎng)基)或在培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板培養(yǎng)基(plate培養(yǎng)基)，在此培養(yǎng)基上接種菌絲或孢子，在好氣條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度保持在0～40℃，優(yōu)選10～35℃，更優(yōu)選在15～30℃使其增殖和孢子形成。培養(yǎng)溫度可在中途改變，例如可使其在25℃條件下增殖后，在5℃條件下培養(yǎng)。
確認(rèn)孢子形成后，在固體培養(yǎng)菌絲中添加滅菌水，用常用方法攪拌獲得孢子懸浮液。添加于滅菌水中的添加物無(wú)特別要求，可為純水，亦可添加表面活性劑、無(wú)機(jī)鹽類等，還可使用預(yù)先調(diào)制的生理鹽水。攪拌方法可從外部給固體培養(yǎng)容器加力，亦可使用預(yù)先滅菌的刷子等直接攪拌菌絲。
將上述得到的孢子懸浮液或?qū)㈡咦雍途z的懸浮液作為保藏原液。此保藏原液可用滅菌水或表面活性劑或含有無(wú)機(jī)鹽類的水溶液稀釋后再重新作為保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷凍保護(hù)劑。對(duì)冷凍保護(hù)劑的使用一般無(wú)特別要求，可從瓊脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脫脂牛奶等中選一種或多種添加。具體舉例，如為使保藏液中甘油濃度達(dá)到10％，可把甘油作為冷凍保護(hù)劑添加。
添加冷凍保護(hù)劑后，將保藏液分裝在保藏容器中。容器宜使用滅菌塑料凍存管等，具體舉例，如把保藏液在無(wú)菌操作條件下分裝于容量1.2mL的凍存管中等。之后將此保藏容器置于超低溫冰箱內(nèi)保藏。超低溫冰箱內(nèi)的溫度需控制在-100℃～-20℃范圍內(nèi)，優(yōu)選在-90℃～-30℃，更優(yōu)選在-85℃～-50℃。
由此，在超低溫冰箱內(nèi)保藏的菌株可長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定地保藏。
為將保藏菌株用于培養(yǎng)，首先需解凍保藏液。解凍盡可能快速進(jìn)行，優(yōu)選在40℃以下的溫水中30分鐘之內(nèi)解凍，更優(yōu)選在30℃以下30分鐘之內(nèi)解凍，最優(yōu)選在30℃以下10分鐘之內(nèi)解凍。
把解凍后的保藏液接種于液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的碳源一般可使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但對(duì)使用種類此處無(wú)特殊要求。
氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麥芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽餅等的天然氮源之外，還可使用尿素等有機(jī)氮源及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無(wú)機(jī)氮源，特別是從大豆中得到的氮源，具體為大豆、脫脂大豆、大豆餅、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等，尤其是脫脂大豆加熱變性后的產(chǎn)物，更優(yōu)選的是可將脫脂大豆進(jìn)行70～90℃熱處理，除去其乙醇可溶成分后的產(chǎn)物單獨(dú)或復(fù)數(shù)或與上述氮源結(jié)合使用。
其他，必要時(shí)除可使用磷酸離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子以外，還可把鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷等的金屬離子和維生素等作為微量營(yíng)養(yǎng)源使用。只要對(duì)微生物的生長(zhǎng)和發(fā)育無(wú)害，對(duì)培養(yǎng)基成分的濃度均無(wú)特殊要求。從實(shí)用上，一般碳源的總添加量為0.1～40％(重量)，優(yōu)選為1～25％(重量)；氮源的總添加量為2～15％(重量)，優(yōu)選為2～10％(重量)，更優(yōu)選為初次的碳源添加量為1～5％(重量)，初次的氮源添加量為3～8％(重量)，培養(yǎng)過(guò)程中流加碳源及氮源，最優(yōu)選的是只流加碳源進(jìn)行培養(yǎng)。
另外，為使含有PUFA的油脂的產(chǎn)量增加，作為不飽和脂肪酸的前軀體，例如十六烷或類十六烷酸的碳?xì)浠?；油酸或類亞油酸的脂肪酸或其鹽，或是脂肪酸酯，例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯；或是類似橄欖油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油的油脂類均可被單獨(dú)或結(jié)合使用?；|(zhì)的添加量針對(duì)培養(yǎng)基為0.001～10％，優(yōu)選在0.5～10％。并可把這些基質(zhì)作為唯一的碳源用于培養(yǎng)。
產(chǎn)生含有PUFA的油脂的微生物的培養(yǎng)溫度雖因所使用的微生物而異，但一般為5～40℃，優(yōu)選為20～30℃，亦可先在20～30℃下培養(yǎng)，菌體增殖后再于5～20℃下繼續(xù)培養(yǎng)使其生產(chǎn)含有PUFA的油脂。此種溫度管理還可使含有PUFA的油脂的結(jié)構(gòu)脂肪酸中PUFA的比例上升。種子培養(yǎng)包括通氣攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或靜置液體培養(yǎng)，本培養(yǎng)為通氣攪拌培養(yǎng)。將本培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)(種子培養(yǎng)液接種時(shí))培養(yǎng)基的pH調(diào)至5～7，優(yōu)選為5.5～6.5。在種子培養(yǎng)的各階段中，培養(yǎng)期間通常為1～10日，優(yōu)選為1～5日，更優(yōu)選為1～3日。本培養(yǎng)的培養(yǎng)期間通常為2～30日，優(yōu)選為5～20日，更優(yōu)選為5～15日。
屬于被孢霉屬被孢霉亞屬的微生物是作為產(chǎn)生含有以花生四烯酸為主要結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(油脂(含有花生四烯酸的甘油三酯)及/或含有花生四烯酸的磷脂)的微生物而被眾所周知的，但由于本發(fā)明者等對(duì)上述菌株施以誘變處理，因而獲得了能產(chǎn)生含有以二同型(dihomo)-γ-亞麻酸為主要結(jié)構(gòu)脂肪酸的油脂的微生物(特開(kāi)平5-91887)和能產(chǎn)生含有以ω9系列多不飽和脂肪酸為主要結(jié)構(gòu)脂肪酸的油脂的微生物(特開(kāi)平5-91888)。
另外，還獲得在高濃度碳源中有耐性的微生物(特開(kāi)平5-91888、特開(kāi)平10-57085、特開(kāi)平5-91886)，這些微生物屬于被孢霉屬被孢霉亞屬，本發(fā)明的培養(yǎng)法，具體來(lái)說(shuō)是使用通過(guò)新型保藏菌株制備法制備及保藏法保藏的保藏菌株進(jìn)行培養(yǎng)，可生產(chǎn)出含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂。但本發(fā)明不只限于屬于被孢霉屬被孢霉亞屬的微生物，能產(chǎn)生含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物，本發(fā)明的培養(yǎng)法均適用，并依此法可得到所需的微生物生物量、粗制油及/或粗磷脂以及由粗制油及/或粗磷脂精煉的精制油及/或精制磷脂。
從菌體內(nèi)有油脂蓄積的微生物中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，是在培養(yǎng)結(jié)束后，把培養(yǎng)液原樣或經(jīng)殺菌、濃縮、氧化等處理后，再經(jīng)自然沉淀、離心分離及/或過(guò)濾等常用的固液分離手段以獲得培養(yǎng)菌體的。為加速固液分離，可添加促凝劑或助濾劑。促凝劑可使用例如氯化鋁、氯化鈣、藻膠、聚氨基葡萄糖等。助濾劑可使用例如硅藻土。培養(yǎng)菌體適宜水洗、破碎、干燥。干燥可進(jìn)行冷凍干燥、風(fēng)干、流動(dòng)層干燥等。
作為從干燥菌體中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，可使用有機(jī)溶劑提取法或壓榨法，優(yōu)選在氮?dú)庵杏糜袡C(jī)溶劑提取。有機(jī)溶劑可使用乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氯甲烷、石油醚、丙酮等，也可使用甲醇和石油醚的交替提取或氯仿-甲醇-水的一層系溶劑提取。但提取粗制油及/或粗磷脂的方法不只限于上述方法，能從菌體內(nèi)有效提取油脂(甘油三酯)及/或磷脂的方法均可使用。例如可使用超臨界CO2流體萃取法等有效手段。
將從有機(jī)溶劑或超臨界流體中提取的提取物置于減壓等條件下，除去有機(jī)溶劑或超臨界流體成分后，可得到所需的粗制油及/或粗磷脂。另外，取代上述方法，可用濕菌體進(jìn)行提取。此時(shí)雖可用與干燥菌體同樣的方法提取粗制油及/或粗磷脂，但如使用甲醇、乙醇、丙酮等與水混溶的溶劑或使用由這些水及/或其他溶劑組成的與水混溶的混合溶劑時(shí)，有可能提高提取效率。
可將在本發(fā)明中獲得的含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的微生物生物量或粗制油及/或粗磷脂直接添加于動(dòng)物飼料中使用。但用于食品時(shí)，一般需使用經(jīng)過(guò)精煉的精制油。油脂精煉工序常用的有脫膠、脫酸、脫臭、脫色、柱層析處理、分子蒸餾、脫蠟等。
有關(guān)本發(fā)明的微生物生物量、粗制油、精制油(甘油三酯)、粗磷脂、精制磷脂等的用途具有無(wú)限的可能性，可作為食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥品的原料及添加物使用。并且其使用目的和使用量亦不受限制。
例如，作為食品成分，除一般性食品外，在功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品、早產(chǎn)兒配方奶粉、成熟兒配方奶粉、嬰兒奶粉、嬰兒食品、孕產(chǎn)婦或老年人食品等上均可使用。含有油脂的食品例如，肉、魚(yú)或干果等含有天然油脂的天然食品、制湯時(shí)需加入油脂的食品、炸面圈等需使用油脂作加熱介質(zhì)的食品、黃油等油脂類食品、曲奇餅等需加入油脂的加工食品或硬餅干等在加工完成時(shí)需噴油或涂油的食品等。另外還可添加到不含油脂的農(nóng)產(chǎn)品、發(fā)酵食品、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品或飲料中。還可用于功能性食品、醫(yī)藥品，其形態(tài)可為如經(jīng)腸營(yíng)養(yǎng)劑、粉劑、顆粒、錠劑、內(nèi)服液、懸浮液、乳濁液、糖漿等的加工形態(tài)。
實(shí)施例以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更具體的說(shuō)明。但本發(fā)明不局限于實(shí)施例。
實(shí)施例1孢子懸浮液的冷凍保藏方法使用作為花生四烯酸生產(chǎn)菌的高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株。在試管中配制Czapek瓊脂培養(yǎng)基(調(diào)整pH到6.0并滅菌)的斜面，25℃下靜置培養(yǎng)7日，確認(rèn)菌絲增殖后，把試管置于冷藏冰箱(4℃)內(nèi)保藏10日。
在試管中加入滅菌水充分?jǐn)嚢?，制成孢子懸浮液。把孢子懸浮液涂布在已稀釋好的馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，使用平皿菌落計(jì)數(shù)法數(shù)孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，為1×106spores/mL。之后將此孢子懸浮液用滅菌水稀釋100倍。且此稀釋后的孢子懸浮液、甘油、水三者(水和甘油預(yù)先需混合、滅菌)用(稀釋后的孢子懸浮液∶甘油∶水＝1∶1∶8)的比例(體積比)混合。將此混合液1mL放入容量1.2mL的滅菌凍存管中，置于-80℃的超低溫冰箱內(nèi)冷凍保藏。
將M.alpina1S-4株用于液體培養(yǎng)時(shí)，把冷凍保藏菌株放在25℃恒溫箱內(nèi)迅速解凍后，接種于液體培養(yǎng)基中。
比較例1.孢子懸浮液的配制方法使用作為花生四烯酸生產(chǎn)菌的高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株。在試管中配制Czapek瓊脂培養(yǎng)基(調(diào)整pH到6.0并滅菌)的斜面，25℃下靜置培養(yǎng)7日，確認(rèn)菌絲增殖后，把試管置于冷藏冰箱內(nèi)保藏。
把高山被孢霉(M.alpina)1S-4株用于液體培養(yǎng)時(shí)，在試管內(nèi)加入滅菌水充分?jǐn)嚢?，配制孢子懸浮液。把此孢子懸浮液接種于液體培養(yǎng)基中。
實(shí)施例2.培養(yǎng)試驗(yàn)、保藏方法的不同造成重復(fù)性的差異使用高山被孢霉(M.alpina)1S-4株，培養(yǎng)用實(shí)施例1及比較例1的方法制備的菌種。
把保藏菌株0.1vol.％接種于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培養(yǎng)基上，振蕩100rpm，于溫度28℃條件下開(kāi)始種子培養(yǎng)，培養(yǎng)3日。
之后，于容量50L的通氣攪拌培養(yǎng)槽內(nèi)配制含脫脂大豆粉5.0％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、MgCl2·6H2O 0.05％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培養(yǎng)基25L，在其中接種種子培養(yǎng)液100mL，在攪拌次數(shù)92rpm、溫度26℃、槽內(nèi)壓200kPa、通氣量12.5L/min的條件下開(kāi)始培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，將葡萄糖如表1的濃度流加，培養(yǎng)10日。
表1葡萄糖的流加時(shí)間和濃度(相對(duì)于培養(yǎng)液中的濃度)

菌種保藏開(kāi)始后，在不同的保藏日數(shù)中用同樣的方法進(jìn)行多次培養(yǎng)。在各培養(yǎng)中，把培養(yǎng)第10天時(shí)所得的花生四烯酸生成量用表2表示。
使用實(shí)施例1的方法制備保藏菌種時(shí)，各培養(yǎng)中花生四烯酸生成量的重復(fù)性均表現(xiàn)良好。但使用比較例1的方法制備保藏菌種時(shí)，各培養(yǎng)的重復(fù)性均表現(xiàn)不良。
表2結(jié)果

實(shí)施例3.在培養(yǎng)試驗(yàn)、長(zhǎng)期保藏中生產(chǎn)率的變化使用高山被孢霉(M.alpina)1S-4株，培養(yǎng)用實(shí)施例1及比較例1的方法制備的菌種。
把保藏菌株0.1vol.％接種于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培養(yǎng)基中，振蕩100rpm，于溫度28℃的條件下開(kāi)始種子培養(yǎng)，培養(yǎng)3日。
之后，于容量50L的通氣攪拌培養(yǎng)槽內(nèi)配制含酵母膏1.0％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培養(yǎng)基25L，在其中接種種子培養(yǎng)液100mL，在攪拌次數(shù)200rpm、溫度28℃、槽內(nèi)壓150kPa、通氣量25L/min的條件下開(kāi)始培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，將葡萄糖如表3的濃度流加，培養(yǎng)7日。
表3葡萄糖的流加時(shí)間和濃度(相對(duì)于培養(yǎng)液中的濃度)

菌種保藏開(kāi)始后，在不同的保藏日數(shù)中用同樣方法進(jìn)行了多次培養(yǎng)。在各培養(yǎng)中，把培養(yǎng)第7天時(shí)所得的花生四烯酸生成量用表4表示。
使用實(shí)施例1的方法制備保藏菌種時(shí)，雖經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保藏，花生四烯酸仍表現(xiàn)出良好的生產(chǎn)率。但使用比較例1的方法制備保藏菌種時(shí)，在長(zhǎng)時(shí)間保藏過(guò)程中，花生四烯酸表現(xiàn)出生產(chǎn)率降低的傾向。
表4結(jié)果

實(shí)施例4.孢子形成培養(yǎng)基中pH的影響花生四烯酸生產(chǎn)菌使用高山被孢霉(M.alpina)1S-4株。在試管中配制2種pH不同且如表5中所示組成的Czapek瓊脂培養(yǎng)基。在實(shí)測(cè)未調(diào)整pH的Czapek培養(yǎng)基的pH時(shí)，pH為8.5。
表5

在pH不同的2種瓊脂培養(yǎng)基中，取一接種環(huán)左右量的菌絲進(jìn)行接種，在25℃下靜置培養(yǎng)7日，確認(rèn)菌絲增殖后，把試管放入冷藏冰箱(4℃)內(nèi)保藏10天。
在試管中加入滅菌水充分?jǐn)嚢瑁瞥涉咦討腋∫?。把孢子懸浮液涂布在稀釋好的馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，使用平皿菌落計(jì)數(shù)法數(shù)孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，在pH6.0的瓊脂培養(yǎng)基中得到1×106spores/mL的孢子，未調(diào)整pH(實(shí)測(cè)pH為8.5)的培養(yǎng)基中只得到5×104spores/mL的孢子。
將以上兩方法配制的孢子懸浮液用實(shí)施例3的方法培養(yǎng)，比較其花生四烯酸的生成量。其結(jié)果從pH60的培養(yǎng)基的孢子懸浮液中得到3.5g/L的花生四烯酸生成量，從未調(diào)整pH(實(shí)測(cè)pH為8.5)的培養(yǎng)基中只得到2.9g/L的花生四烯酸生成量。
實(shí)施例5.冷凍保藏方式實(shí)施例1中，把在1.2mL凍存管內(nèi)配制的孢子懸浮保藏液分別置于條件(5-1)中的-20℃冷凍冰箱、條件(5-2)中的-80℃的超低溫冰箱、條件(5-3)中的液氮中(約-196℃)中保藏。3種條件下保藏30日后，與實(shí)施例2進(jìn)行同法培養(yǎng)。其孢子存活率及花生四烯酸生產(chǎn)率均在-80℃的超低溫冰箱保藏條件下表現(xiàn)最佳。
表6

實(shí)施例6.大罐培養(yǎng)中冷凍菌株的培養(yǎng)重復(fù)性的實(shí)際驗(yàn)證使用高山被孢霉(M.alpina)1S-4株，培養(yǎng)用實(shí)施例1的方法制備的菌種。
把保藏菌株0.1vol.％接種于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培養(yǎng)基中，振蕩100rpm，于溫度28℃的條件下開(kāi)始種子培養(yǎng)(第一階段)，培養(yǎng)3日。
之后，于容量50L的通氣攪拌培養(yǎng)槽內(nèi)配制含酵母膏1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培養(yǎng)基30L，在其中接種種子培養(yǎng)(第一階段)液，在攪拌次數(shù)200rpm、溫度28℃、槽內(nèi)壓150kPa的條件下開(kāi)始種子培養(yǎng)(第二階段)，培養(yǎng)2日。
之后將4500L培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A大豆粉336kg、KH2PO416.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH調(diào)整為4.5，在121℃、20分鐘條件下滅菌。另一培養(yǎng)基為把1000L培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B含水葡萄糖112kg)于140℃、40秒的條件下滅菌后，將其加入上述培養(yǎng)基A中制成培養(yǎng)基C。將培養(yǎng)基C的pH調(diào)整到6.3后，接種容量28L的種子培養(yǎng)液(第二階段)，與初期培養(yǎng)液配成合計(jì)5600L的培養(yǎng)液(培養(yǎng)槽容量10kL)。
把種子培養(yǎng)液(第二階段)接種于本培養(yǎng)的培養(yǎng)基中時(shí)，向種子培養(yǎng)槽和本培養(yǎng)槽間連接的配管內(nèi)輸入蒸汽殺菌(121～126℃、30分鐘以上)后，再輸入滅菌空氣冷卻，使配管表面溫度冷卻到60℃以下。冷卻后，將所定量的種子培養(yǎng)液(第二階段)輸送到本培養(yǎng)槽內(nèi)。從種子培養(yǎng)液向本培養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)接種完成后，在溫度26℃、通氣量49Nm3/hr、內(nèi)壓200kPa中開(kāi)始培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中如下表所示進(jìn)行流加，本培養(yǎng)共進(jìn)行306小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，由于向培養(yǎng)基內(nèi)流加時(shí)培養(yǎng)液增加及蒸發(fā)時(shí)培養(yǎng)液減少的影響，培養(yǎng)液的總量變?yōu)?750L。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)液中花生四烯酸的生成量為18.2g/L。

培養(yǎng)結(jié)束后，在120℃、20分鐘條件下滅菌，之后用連續(xù)式脫水機(jī)回收濕菌體，用振動(dòng)流動(dòng)層干燥機(jī)將水分含量干燥到1wt％，再用空氣輸送機(jī)將干燥菌體輸送到充填場(chǎng)所。將得到的干燥菌體與氮?dú)馔瑫r(shí)充填入容量約1m3的鋁制大包裝袋內(nèi)，將袋口熱封后，置于10℃以下的冷藏室保藏。
從大包裝袋內(nèi)取出干燥菌體進(jìn)行己烷提取，過(guò)濾己烷提取液除去固形成分后，減壓加熱除去己烷，可獲得以花生四烯酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的粗制油。
重復(fù)3次同樣試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)花生四烯酸生成量的結(jié)果如表7所示。
表7培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的花生四烯酸生成量

實(shí)施例7.二同型(dihomo)-γ-亞麻酸生產(chǎn)菌中冷凍菌株培養(yǎng)重復(fù)性的實(shí)際驗(yàn)證使用高山被孢霉(Mortierellaalpina)SAM1860株作為二同型(dihomo)-γ-亞麻酸生產(chǎn)菌。在試管中配制Czapek瓊脂培養(yǎng)基(調(diào)整pH到6.0并滅菌)的斜面，25℃下靜置培養(yǎng)12日，確認(rèn)菌絲增殖后，把試管置于冷藏冰箱(4℃)內(nèi)保藏20日。
在試管中加入滅菌水充分?jǐn)嚢?，配制孢子懸浮液。把孢子懸浮液涂布在稀釋好的馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，使用平皿菌落計(jì)數(shù)法數(shù)孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，為5×1055spores/mL。
之后將此孢子懸浮液用滅菌水稀釋100倍。把此稀釋后的孢子懸浮液、甘油、滅菌水三者按(稀釋后的孢子懸浮液∶甘油∶滅菌水＝1∶1∶8)的比例(體積比)混合。將此混合液1mL放入容量1.2mL的滅菌凍存管內(nèi)，置于-80℃的超低溫冰箱內(nèi)冷凍保藏1個(gè)月。
另外作為比較例，將用同樣的方法配制的孢子懸浮液放入冰箱(5℃)內(nèi)保藏1個(gè)月。
使用保藏了1個(gè)月的2種菌株，與實(shí)施例3同法培養(yǎng)。其結(jié)果可得到表8所示的DGLA生成量，其結(jié)果顯示了冷凍保藏法的有效性。
表8結(jié)果

實(shí)施例8.使用其他花生四烯酸生產(chǎn)菌冷凍菌株的培養(yǎng)重復(fù)性的實(shí)際驗(yàn)證使用作為花生四烯酸生產(chǎn)菌的長(zhǎng)孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570株、及高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS754.68株。
在試管中配制Czapek瓊脂培養(yǎng)基(調(diào)整pH到6.0并滅菌)的斜面，25℃下靜置培養(yǎng)10日，確認(rèn)菌絲增殖后，把試管置于冷藏冰箱(4℃)內(nèi)保藏20日。
在試管中加入滅菌水充分?jǐn)嚢?，制成孢子懸浮液后用滅菌水稀?0倍。把此稀釋后的孢子懸浮液、甘油、滅菌水三者按(稀釋后的孢子懸浮液∶甘油∶滅菌水＝1∶1.5∶7.5)的比例(體積比)混合。將此混合液1mL放入容量1.2mL的滅菌凍存管內(nèi)置于-80℃的超低溫冰箱內(nèi)冷凍保藏1個(gè)月。
另外作為比較例，把用同樣方法配制的孢子懸浮液放入冷藏冰箱(5℃)內(nèi)保藏1個(gè)月。
使用保藏了1個(gè)月的4種保藏菌株(菌種2種×保藏方法2種)分別在酵母膏1％、葡萄糖2％、pH6.3的培養(yǎng)基中接種，振蕩100rpm，于溫度28℃的條件下開(kāi)始種子培養(yǎng)3日。
之后，于容量50L的通氣攪拌培養(yǎng)槽內(nèi)配制(含葡萄糖500g、脫脂大豆粉775g、KH2PO450g、MgCl2·6H2O 7.5g/L、CaCl2·2H2O 7.5g/L、大豆油25g、pH6.0)的培養(yǎng)基25L，在其中接種種子培養(yǎng)液，在攪拌次數(shù)200rpm、溫度26℃、槽內(nèi)壓150kPa的條件下開(kāi)始培養(yǎng)。為使葡萄糖濃度達(dá)到1～2％，約每24小時(shí)需添加一次50％葡萄糖溶液，共培養(yǎng)186小時(shí)。其結(jié)果，可得到如表9所示的DGLA生成量，其結(jié)果顯示了冷凍保藏法的有效性。
表9結(jié)果

實(shí)施例9.比較使用L干燥法和冷凍保藏法保藏9年的孢子用實(shí)施例1的要領(lǐng)配制孢子懸浮液，用傳統(tǒng)的L干燥法(“Maintaining cultures for biotechnology and industry(1996)”edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt.Academic Press，p-115)制成孢子干燥安瓿管保藏。制成并保藏9年后，開(kāi)封6支L干燥安瓿管，復(fù)原后涂布在瓊脂培養(yǎng)基上計(jì)算其存活孢子數(shù)。與此同時(shí)，將用實(shí)施例1的方法制成的容量1.2mL的凍存管(9年的冷凍保藏品)6支解凍，計(jì)算其存活孢子數(shù)。
其結(jié)果如下表所示，用實(shí)施例1所述保藏方法比用傳統(tǒng)的L干燥法的存活率顯著增高。因此可以認(rèn)為本發(fā)明的方法在長(zhǎng)期進(jìn)行菌株保藏上是行之有效的。
表10

權(quán)利要求
1.一種微生物的保藏方法，其特征為利用微生物可產(chǎn)生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物，其包括(a)在含有由無(wú)機(jī)鹽類和糖類構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)源且pH為4～7的孢子形成培養(yǎng)基中使孢子形成；(b)把上述(a)中得到的孢子懸浮于滅菌水或表面活性劑及/或含有無(wú)機(jī)鹽類的滅菌水中制成孢子懸浮液，再加入占總?cè)芤?～15％的冷凍保護(hù)劑制成冷凍保藏孢子懸浮液；(c)將上述(b)中制成的冷凍保藏孢子懸浮液置于-100℃～-20℃保藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，上述無(wú)機(jī)鹽類從硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸美、氯化鉀及硫酸亞鐵中優(yōu)選，且至少選擇一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征為上述孢子形成培養(yǎng)基是pH為4～7的Czapek瓊脂培養(yǎng)基或Czapek-dox瓊脂培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征為上述冷凍保護(hù)劑為甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物指的是，以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的甘油三酯或以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的磷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述多不飽和脂肪酸為ω6系列多不飽和脂肪酸、ω3系列多不飽和脂肪酸或ω9系列多不飽和脂肪酸或這些系列的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述ω6系列多不飽和脂肪酸為9，12-十八碳二烯酸(亞油酸)182ω6、6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亞麻酸)183ω6、8，11，14-二十碳三烯酸(二同型(di homo)-γ-亞麻酸)203ω6、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)204ω6、7，10，13，16-二十二碳四烯酸224ω6或4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸225ω6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述ω3系列多不飽和脂肪酸為9，12，15-十八碳三烯酸(α-亞麻酸)183ω3、6，9，12，15-十八碳四烯酸(Stearidonie acid)184ω3、11，14，17-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-α-亞麻酸)203ω3、8，11，14，17-二十碳四烯酸204ω3、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸205ω3、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸225ω3或4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸226ω3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述ω9系列多不飽和脂肪酸為6，9-十八碳二烯酸182ω9、8，11-二十碳二烯酸202ω9或5，8，11-二十碳三烯酸(M酸(Meadacid))203ω9。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述微生物屬于被孢霉(Mortierella)屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的微生物的保藏方法，其特征為上述屬于被孢霉(Mortierella)屬的微生物為高山被孢霉(Mortierellaalpina)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的方法，其為以使用由上述方法保藏的微生物為特征的，多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物的制造方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物的保藏方法，其特征為利用微生物可產(chǎn)生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結(jié)構(gòu)脂肪酸的化合物，其內(nèi)容包括(a)在含有由無(wú)機(jī)鹽類和糖類構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)源且pH為4～7的孢子形成培養(yǎng)基中使孢子形成；(b)把上述(a)中得到的孢子懸浮于滅菌水或表面活性劑及/或含有無(wú)機(jī)鹽類的滅菌水中制成孢子懸浮液，再加入占總?cè)芤?～15％的冷凍保護(hù)劑制成冷凍保藏孢子懸浮液；并且(c)將上述(b)中制成的冷凍保藏懸浮液置于－100℃～－20℃保藏。
文檔編號(hào)C12P7/64GK1737109SQ20051008945
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月12日
發(fā)明者東山堅(jiān)一 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社