專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脂肪來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及將來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞在體外向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于組織工程脂肪組織的構(gòu)建，制備彌補(bǔ)軟組織凹陷、組織修復(fù)以及正常組織的填充物。
背景技術(shù)：
對(duì)于軟組織凹陷、組織修復(fù)及正常組織的填充，最初人們利用吸脂術(shù)提取出來(lái)的脂肪顆粒細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)移植，但沒(méi)有取得理想的效果。植入的脂肪細(xì)胞多數(shù)很快壞死、液化和吸收(Ellenbogen R.1990)。這是由于成熟的脂肪細(xì)胞胞漿中80％～90％是由脂滴組成，容易受機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞活性的喪失。此外，成熟的脂肪細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，不能夠在體內(nèi)有效的增殖發(fā)育。
近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人體組織內(nèi)具有一類(lèi)能夠不斷自我更新和增殖，具有多向分化潛能的細(xì)胞群體——干細(xì)胞。它能夠在體外培養(yǎng)、增殖并且分化成不同的組織細(xì)胞。有證據(jù)表明(Zuk P.A，2001)分離自經(jīng)膠原酶處理后的脂肪組織的基質(zhì)-血管部分含有大量的前脂肪細(xì)胞，或傾向于分化為脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞。這些細(xì)胞能以較低的頻率自發(fā)地分化為脂肪細(xì)胞，在脂肪促進(jìn)劑(如地塞米松，IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)等)的作用下，可提高這些細(xì)胞的分化效率。他們很容易從脂肪組織獲取，能夠在體外大規(guī)模培養(yǎng)和擴(kuò)增，性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械抵抗力強(qiáng)。它們?cè)隗w外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境或體內(nèi)固有的微環(huán)境下能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪和血管內(nèi)皮等組織。誘導(dǎo)分化的細(xì)胞不僅可用于組織工程化脂肪組織的構(gòu)建，并且與脂肪顆粒相比，在面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復(fù)、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，膨體、硅膠片、人工骨粉填充后殘留部分凹陷的矯正及美容中具有更大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了來(lái)源于脂肪組織的干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的方法和組合物，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞群可用于面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復(fù)、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容等。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的分離培養(yǎng)1)人類(lèi)脂肪組織可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缡中g(shù)或脂肪抽吸術(shù)而獲得。脂肪抽吸術(shù)是目前應(yīng)用最為普遍的方法，因此脂肪抽吸物是本發(fā)明細(xì)胞的一個(gè)特別優(yōu)選來(lái)源。
2)獲取的脂肪組織以生理學(xué)相容性溶液諸如磷酸緩沖液沖洗，隨后在脂肪組織中加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和紅細(xì)胞等。
3)用蛋白水解酶(例如膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等)水解方法解離組織，此類(lèi)酶可減弱或破壞細(xì)胞間的結(jié)合，從脂肪結(jié)締組織基質(zhì)中釋放出游離的脂肪細(xì)胞。由于成熟脂肪細(xì)胞的密度較低，通常浮在等滲緩沖溶液的上層，脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞將沉淀到溶液下層，而中間層則包括結(jié)締組織基質(zhì)和脂肪細(xì)胞聚集體。
4)使用平衡密度離心方法分離得到富含脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群體的部分(下層)。
5)用磷酸緩沖液懸浮沉淀的細(xì)胞，通過(guò)加入高張鹽溶液保溫及加入紅細(xì)胞裂解液等方法破壞并除去殘留的紅細(xì)胞。懸浮的細(xì)胞可經(jīng)過(guò)一次或連續(xù)多次(2～3次)的洗滌，再離心和重懸浮以獲得更高的純度?；蛘?，這些細(xì)胞可通過(guò)使用流式細(xì)胞儀分選或根據(jù)細(xì)胞的大小和基粒的有無(wú)進(jìn)行分離，干細(xì)胞較小并相對(duì)無(wú)基粒。
6)最終的分離和重懸浮之后，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以增加干細(xì)胞的數(shù)量。常用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，馬血清等)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)或者D/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)傳代的細(xì)胞形態(tài)如附圖1所示。
(2)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，離心。以PBS洗滌細(xì)胞2～3次后，用1ml PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，按5×105個(gè)細(xì)胞/管將細(xì)胞平均分至多個(gè)EP管中，分別將PE或FITC標(biāo)記的多個(gè)抗體進(jìn)行組合，加入各管中，室溫下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
(3)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞的成脂肪誘導(dǎo)分化1)將擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞應(yīng)用誘導(dǎo)分化的限定培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
2)誘導(dǎo)脂肪組織發(fā)生的培養(yǎng)基可以是含有糖皮質(zhì)激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類(lèi)似物)以及其他一些物質(zhì)。例如一種誘導(dǎo)方案是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
應(yīng)用本發(fā)明方法所獲得的含有脂肪干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的細(xì)胞群體可應(yīng)用于組織工程化脂肪組織的構(gòu)建，制備彌補(bǔ)軟組織凹陷和組織修復(fù)的填充物以及制備用于美容的正常組織填充物。
本發(fā)明是將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞在體外向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后，將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞群用于組織工程化脂肪組織的構(gòu)建，面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復(fù)、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容等。因此，市場(chǎng)價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1第二代脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100倍)。
圖2脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的流式分析(1)FITC陰性對(duì)照；(2)CD90表達(dá)陽(yáng)性；(3)CD45表達(dá)陰性；(4)CD44表達(dá)陰性；(5)CD71表達(dá)陽(yáng)性；(6)CD16表達(dá)陰性；(7)CD30表達(dá)陰性；(8)PE陰性對(duì)照；(9)CD34表達(dá)陰性；(10)CD29表達(dá)陽(yáng)性；(11)CD3表達(dá)陰性；(12)CD11b表達(dá)陰性；(13)CD133表達(dá)陰性；(14)CD19表達(dá)陰性。
圖3脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的向脂肪細(xì)胞分化a成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，細(xì)胞內(nèi)充滿脂質(zhì)的液泡呈油紅O染色陽(yáng)性；b成脂誘導(dǎo)一周的細(xì)胞中充滿脂質(zhì)的小滴(×100倍)；c成脂誘導(dǎo)二周細(xì)胞充滿脂質(zhì)的小滴(×200倍)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)擴(kuò)增用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)反復(fù)沖洗吸脂手術(shù)得到的吸出物，隨后在其中加入PBS，攪拌并放置至澄清，以除去損傷組織、血液和部分紅細(xì)胞等，然后加入濃度約為0.1％的膠原酶，輕輕攪拌下37℃消化45分鐘。1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀物，并將沉淀懸浮于紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl)中，室溫靜置10分鐘后，再次離心收集細(xì)胞。如此反復(fù)處理兩次，以盡可能地破碎并除去紅細(xì)胞。細(xì)胞懸液離心收集下層細(xì)胞沉淀物，然后使用溴酚蘭染料排除法檢測(cè)細(xì)胞的存活率并計(jì)數(shù)活細(xì)胞的比例。
存活細(xì)胞在含10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基中37℃、5％CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80％匯合時(shí)，傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞形成單層后用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化解離單層并收集游離的細(xì)胞，準(zhǔn)備用于分化培養(yǎng)基中進(jìn)行干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)。
實(shí)施例2脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，離心。以PBS洗滌細(xì)胞2次后，用1ml PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，按5×105個(gè)細(xì)胞/管將細(xì)胞平均分至多個(gè)EP管中，分別將PE或FITC標(biāo)記的多個(gè)抗體(CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19)進(jìn)行組合，加入各管中，室溫下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。結(jié)果顯示，脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，CD90、CD29和CD71表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明其是間質(zhì)來(lái)源的一類(lèi)具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化及應(yīng)用使用含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％青霉素/鏈霉素，0.5mM IBMX的DMEM培養(yǎng)基在常規(guī)條件(37℃，5％CO2)下對(duì)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)7～15天后，取誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞克降，甲醇固定2min，50％酒精漂洗，加入油紅O染料染色10min，50％酒精漂洗后，用水沖洗，蘇木精復(fù)染1min，鏡下觀察染色情況，呈油紅O染色陽(yáng)性，表明細(xì)胞內(nèi)有脂質(zhì)小泡存在，根據(jù)這一特征可判定干細(xì)胞已出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化的趨勢(shì)。將未分化的或部分向脂肪細(xì)胞分化的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞單獨(dú)注射或手術(shù)方式植入到接受治療的區(qū)域如臉頰、嘴唇等部位以除皺和/或美容。還可將未分化的或部分向脂肪細(xì)胞分化的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞注射植入需要改變的有缺陷的受區(qū)內(nèi)，以改變完善受區(qū)的形態(tài)。常見(jiàn)的有面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復(fù)、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正。
權(quán)利要求
1.一種脂肪來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞應(yīng)用成脂分化培養(yǎng)基向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于所述的脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞其分離方法包括以下步驟(1)以磷酸緩沖液沖洗脂肪組織后，加入緩沖液，攪拌并放置至澄清，除去損傷組織、血液和紅細(xì)胞；(2)蛋白水解酶水解脂肪組織；(3)平衡密度離心，分離脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞群；(4)磷酸緩沖液重懸分離的細(xì)胞，加入高張鹽溶液保溫及加入紅細(xì)胞裂解液，破壞并除去殘留的紅細(xì)胞；(5)離心去除上清液，加入磷酸緩沖液重懸及離心洗滌，得到脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于用于誘導(dǎo)脂肪來(lái)源干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化的培養(yǎng)基可以是含有糖皮質(zhì)激素(例如，異丁基-甲基黃嘌呤、地塞米松、氫化可的松、可的松等等)、胰島素、一種提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的化合物(例如二丁縮醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一種抑制cAMP降解的化合物(例如，一種磷酸二酯酶抑制劑，如甲基異丁基黃嘌呤、消炎痛，及其它類(lèi)似物)以及其他-些物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪來(lái)源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于用于脂肪來(lái)源干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞分化的一種誘導(dǎo)方案可以是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM引哚美辛，1％鏈霉素/青霉素劑，0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，泛酸鹽，生物素。
5.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可為工程化脂肪組織的制備提供種子細(xì)胞。
6.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可用于制備彌補(bǔ)面部皮下凹陷性缺損或畸形修復(fù)的填充物，常見(jiàn)的面部皮下凹陷性缺損或畸形如面部軟組織發(fā)育不良，面部手術(shù)或外傷導(dǎo)致的凹陷，單側(cè)或雙側(cè)顏面萎縮，顴、顳、額、眶區(qū)的凹陷，上唇過(guò)薄或人中過(guò)短，鼻唇溝過(guò)深，耳垂較小。
7.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可用于制備彌補(bǔ)身體其他部位軟組織凹陷的填充物，常見(jiàn)的身體其他部位軟組織凹陷如先天性乳房發(fā)育不良，哺乳后乳房萎縮，雙側(cè)乳房大小不對(duì)稱(chēng)，乳頭凹陷畸形，臀部、大腿、小腿彎曲，吸脂術(shù)后的凹陷，手部軟組織萎縮。
8.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可用于制備生殖器的改型塑造填充物。
9.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充凹陷后，仍留存少部分凹陷的矯正。
10.誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法得到的誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞群可用于美容，即可填充于正常組織，達(dá)到美容的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及將來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞在體外向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法，利用此方法可提供大量的細(xì)胞，用于組織工程脂肪組織的構(gòu)建，制備彌補(bǔ)軟組織凹陷、組織修復(fù)以及正常組織的填充物。應(yīng)用本方法得到的脂肪細(xì)胞群，不僅可以用于面部皮下凹陷性缺損或畸形的修復(fù)、身體其他部位軟組織凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，還可以用于膨體、硅膠片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矯正及美容。因此，市場(chǎng)價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1912110SQ20051008984
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者裴雪濤, 管利東, 王韞芳, 閆舫, 李紹青, 白慈賢, 岳慧敏, 南雪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所