專利名稱：通過阻斷負(fù)調(diào)控基因提高格爾德霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用分子生物學(xué)操作技術(shù)、通過阻斷生物合成調(diào)控基因提高抗生素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
吸水鏈霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所從中國土壤中分離到的，經(jīng)鑒定其發(fā)酵產(chǎn)物為格爾德霉素(geldanamycin，GDM)，該抗生素具有抗腫瘤和廣譜抗病毒的作用。近年研究顯示，GDM可以特異性抑制熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)的功能。Hsp90是許多信號蛋白的伴侶分子，GDM通過對Hsp90的抑制，可以間接影響細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的功能，因此GDM是一種很有潛力的抗腫瘤和抗病毒藥物。吸水鏈霉菌17997產(chǎn)生GDM的過程諸如微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成，是一個有多種酶參與并極其耗能和消耗底物的生化過程。因此，其合成過程受到非常嚴(yán)格的調(diào)控，如當(dāng)微生物的生長不受限制，能以最佳速度進(jìn)行時，次級代謝產(chǎn)物的合成一般會受到抑制；只有當(dāng)生長速度因某種營養(yǎng)因素受限或環(huán)境條件不利而減慢時，便引起細(xì)胞分化和次級代謝產(chǎn)物的合成。因此，環(huán)境因素中過剩的營養(yǎng)往往對次級代謝產(chǎn)物的合成起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。適宜的環(huán)境因素如溫度、pH、溶解氧水平、適度的營養(yǎng)供應(yīng)等均有利于次級代謝產(chǎn)物的合成。除環(huán)境因素對次級代謝產(chǎn)物合成的生理性調(diào)節(jié)以外，還存在著對不同抗生素生物合成途徑所形成的代謝產(chǎn)物的途徑特異調(diào)控因子。如參與放線紫紅素和十一烷基靈紅菌素合成的調(diào)控基因actII-orf4和redD基因；鏈霉素產(chǎn)生菌灰色鏈霉菌中的調(diào)節(jié)基因strR；棒酸產(chǎn)生菌中的ccaR基因等。它們大多數(shù)對生物合成是正調(diào)控基因起著轉(zhuǎn)錄激活的作用。對抗生素生物合成起負(fù)調(diào)節(jié)作用的基因比較少見。負(fù)調(diào)節(jié)基因是指該基因的存在不利于生物合成基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。如果將負(fù)調(diào)控基因破壞，將有利于抗生素的形成。迄今相關(guān)的報道有與次甲基霉素生物合成相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因mmyR，參與放線紫紅素生物合成的負(fù)調(diào)控基因actII-orf1，四并菌素生物合成中的負(fù)調(diào)控基因tcm R等，這些基因均與抗生素的抗性基因連鎖，有的與抗生素輸出胞外機(jī)制相關(guān)，它們可能是通過抗性的調(diào)節(jié)來調(diào)控抗生素的產(chǎn)生，從捷達(dá)霉素產(chǎn)生菌中也發(fā)現(xiàn)了負(fù)調(diào)控基因iadR2。通過阻斷其基因，捷達(dá)霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高了41％。本實(shí)驗(yàn)室在研究吸水鏈霉菌17997格爾德霉素的生物合成基因簇中，通過序列分析比較，發(fā)現(xiàn)在基因簇內(nèi)有兩個調(diào)節(jié)基因gdm RI和gdm RII，屬于LuxR家族。在吸水鏈霉菌NRRL3602中也曾有過類似基因的報道[Rascher A，et al(2003)FEMS Microbiol Lett.218(2)223-230]。已知LuxR家族的基因在革蘭氏陰性菌中普遍存在，是群體感應(yīng)(Quorum sensing)系統(tǒng)中的受體蛋白，在其N端有ATP/GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域WalkerA/B基序，在C端有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-turn-helix)，分子量比較大。在鏈霉菌中也發(fā)現(xiàn)了LuxR家族的蛋白，如Streptomyces avermitilis MA4680 oligomycin基因簇中olmRI，avermictin基因簇中ave R，Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253的rap H，莫能素產(chǎn)生菌Streptomyces cinnamonensis的mon H，苦霉素產(chǎn)生菌Streptomyces venezuelae的pik D，匹馬菌素產(chǎn)生菌Streptomycesnatalensis的pim R等基因編碼蛋白。對大多數(shù)這類基因的調(diào)控方式還不十分清楚，而對苦霉素產(chǎn)生菌Streptomyces venezuelae中pik D調(diào)節(jié)基因的研究表明，pik D為正調(diào)控基因，它參與苦霉素聚酮合酶及其糖苷化的調(diào)控，但是不影響羥基化酶的功能，其調(diào)控是發(fā)生在聚酮合酶PikAI、Pik抗性基因RI和糖苷化基因desI的啟動子，而對抗性基因和羥基化酶基因pik C啟動子無影響。在Streptomyces natalensis中pim R是調(diào)控匹馬菌素的正調(diào)節(jié)基因，激活其合成匹馬菌素的相關(guān)基因。吸水鏈霉菌格爾德霉素產(chǎn)生菌中有關(guān)兩個LuxR家族的調(diào)節(jié)基因gdm RI和gdm RII的具體功能和調(diào)控作用迄今尚未見有報道。本發(fā)明通過基因阻斷的方法，研究證明gdm RII是一個負(fù)調(diào)控基因，將該基因破壞后獲得的格爾德霉素變株—吸水鏈霉菌17997-WHLR-2的GDM發(fā)酵產(chǎn)量可以提高近60％。本發(fā)明的目的在于，通過阻斷吸水鏈霉菌17997中格爾德霉素生物合成負(fù)調(diào)控基因gdm RII的方法，以提高格爾德霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所說的通過阻斷負(fù)調(diào)控基因gdm RII提高格爾德霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法主要包含以下步驟1.gdm RII基因的獲得與序列分析利用參與格爾德霉素生物合成的氨甲?；D(zhuǎn)移酶(CT)基因序列(Genbank AY179507，gdmN)，設(shè)計引物，經(jīng)PCR獲得732bp產(chǎn)物，以此為探針，從S.hygroscopicus 17997基因柯斯質(zhì)粒文庫(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，經(jīng)菌落雜交、分子雜交及核苷酸序列測定，確定柯斯質(zhì)粒pCT4中含有g(shù)dm RII基因。經(jīng)同源性比較表明，gdm RII基因產(chǎn)物屬于LuxR家族，它們是一族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其C端含有保守的螺旋—旋轉(zhuǎn)—螺旋(helix-turn-helix)與DNA結(jié)合域，gdm RII的N端含有ATP結(jié)合域(ABC輸出)，含有WalkerA/B基序。
2.構(gòu)建gdm RII基因阻斷重組載體采用基因同源重組原理，通過PCR的方法或利用gdm RII基因序列中的酶切位點(diǎn)分別擴(kuò)增或克隆兩個同源片段，每個片段的大小應(yīng)基本相符并大于500bp，在兩個同源片段中間連入可供選擇的標(biāo)記基因，再將三片段的連接產(chǎn)物克隆到具有另一種選擇標(biāo)記的大腸桿菌及鏈霉菌穿梭載體pGH112、pKC1139等，構(gòu)建gdm RII基因阻斷載體pGARII。
3.gdm RII基因阻斷變株的篩選和獲得將構(gòu)建的gdm RII基因阻斷載體，通過接合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入吸水鏈霉菌S.hygroscopicus 17997中，獲得接合轉(zhuǎn)移子。將接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)插入標(biāo)記和載體上原有標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，獲得gdmRII基因同源基因片段與宿主菌染色體基因雙交換的基因阻斷菌株。利用PCR的方法，驗(yàn)證gdm RII基因的阻斷。
4.gdm RII基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)量的檢測gdm RII基因阻斷變株進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)提取后用HPLC進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，基因阻斷株GDM發(fā)酵產(chǎn)量提高近60％，證明gdm RII基因?yàn)镚DM生物合成負(fù)調(diào)控基因，其阻斷后有利于GDM的形成。
發(fā)明效果本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)首次證明，gdm RII基因?yàn)镚DM生物合成負(fù)調(diào)控基因，通過阻斷吸水鏈霉菌17997中格爾德霉素生物合成負(fù)調(diào)控基因gdm RII，可以提高格爾德霉素的發(fā)酵產(chǎn)量近60％，為格爾德霉素的工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了有利條件，也在利用分子生物學(xué)操作技術(shù)、通過阻斷生物合成調(diào)控基因提高抗生素產(chǎn)量的理論與實(shí)踐方面探索和拓寬了一條新路。


圖1.以吸水鏈霉菌17997基因組DNA為模板，用CT引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖其中1-DLDL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2-PCR產(chǎn)物圖2.gdm RII基因阻斷載體的構(gòu)建圖3.gdm RII基因阻斷變株P(guān)CR驗(yàn)證結(jié)果其中M-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA MakerIII1-17997原株對照2-gdm RII基因阻斷變株17997-WHLR-2圖4.gdm RII基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)物GDM的HPLC檢測其中A-17997原株對照B-gdm RII基因阻斷變株17997-WHLR-2HPLC中保留時間在25min左右的主峰為GDM具體實(shí)施方案以下實(shí)施例對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，其目的是為進(jìn)一步加深對本發(fā)明的理解。
實(shí)施例1gdm RII基因的獲得與序列分析根據(jù)Genbank AY179507，以格爾德霉素生物合成相關(guān)的氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因gdm N序列編碼蛋白的保守區(qū)設(shè)計引物上游引物15’CCGGAATTCTGGGCCACCGCAGCATCGTC 3’下游引物25’CCGGAATTCTGAGGAACCGCTGCTCCCAC 3’(劃線部分為便于克隆加入的的EcoRI酶切位點(diǎn))以吸水鏈霉菌17997的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出732bp目的條帶(圖1)。以此為探針，通過與吸水鏈霉菌17997基因柯斯文庫菌落雜交和Southern分子雜交，將gdm N基因定位在6個柯斯質(zhì)粒pCT1-6上，對柯斯質(zhì)粒pCT4的外源片段所含基因序列進(jìn)行測序，從中發(fā)現(xiàn)含有完整的gdm RII基因。該基因由2784bp(SEQ ID No1)組成，編碼927個氨基酸的蛋白序列(SEQ ID No2)。經(jīng)過同源性比較，本發(fā)明從鏈霉菌17997中所獲得的Gdm RII與Streptomyceshygroscopicus NRRL3602中的Gdm RII一致性為90％。
實(shí)施例2構(gòu)建gdm RII基因阻斷載體引物設(shè)計根據(jù)gdm RII基因序列，設(shè)計兩對引物上游引物35’-CCGGAATTCTTCACCGAGCAGGAGGAC-3’下游引物45’-CTAGTCTAGATCCAATGGCTCAGCAAGTC-3’上游引物55’-AAACTGCAGTCATGGTCGCCGGAGCT-3’下游引物65’-CCGGAATTCCGCCGCACAGCAGAAAG-3’(劃線部分為加入的克隆位點(diǎn)EcoRI、XbaI、PstI位點(diǎn))以鏈霉菌17997為模板，通過PCR的方法，用primer3和4擴(kuò)增出帶有EcoRI和XbaI位點(diǎn)1200bp的gdm RII上游同源基因片段，用primer5和6擴(kuò)增出另外一段帶有PstI和EcoRI 1000bp的gdm RII下游同源基因片段。在gdm RII上、下游兩個同源基因片段之間，通過XbaI和PstI位點(diǎn)，插入阿泊拉霉素(apramycin，Am)抗性基因(1500bp)片段，并通過EcoRI位點(diǎn)將此三個基因片段與pGH112載體(含有硫鏈絲菌素抗性，tsrR)[購自中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏中心]相連，得到pGARII重組載體(圖2)。
實(shí)施例3gdm RII基因阻斷變株的篩選與獲得將構(gòu)建好的重組載體pGARII轉(zhuǎn)化到含輔助質(zhì)粒的大腸桿ET12567/pUZ8002[購自英國John Innes Centre，網(wǎng)址www.jic.ac.uk]中，以載體pGH112上的Amr為篩選標(biāo)記，從篩選到的Amr轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，驗(yàn)證其分子量大小。將含pGARII重組載體的大腸桿菌ET12567/pUZ8002與鏈霉菌17997成熟孢子混合，涂布在MS平板培養(yǎng)基(甘露醇2％，黃豆粉2％，瓊脂2％)上28℃共培養(yǎng)。次日，用含有Am(50ug/ml)和萘啶酸(100ug/ml)的無菌水覆蓋MS平板。將Amr接合轉(zhuǎn)移子在含有Am抗性的MY培養(yǎng)基(葡萄糖0.4％，酵母膏0.4％，麥芽浸膏1％，瓊脂2％)中傳代培養(yǎng)。確證其為阿泊拉霉素抗性接合轉(zhuǎn)移子，然后在不含Am抗性的MY培養(yǎng)基中傳代數(shù)次，使重組載體pGARII上的gdm RII基因的兩個同源基因片段與鏈霉菌17997染色體發(fā)生雙交換，表現(xiàn)為載體pGH112上硫鏈絲菌素抗性、tsrR的丟失。通過接合轉(zhuǎn)移子Amr和Tsrs的篩選，獲得gdm RII基因阻斷變17997-WHLR-2。提取gdm RII基因阻斷變株17997-WHLR-2總DNA，以引物3和6進(jìn)行PCR反應(yīng)(圖3)。由圖3可見，17997-WHLR-2變株中由于在gdm RII基因中插入了Amr基因，故其PCR產(chǎn)物比原株大1500bp。由此證明17997-WHLR-2為gdm RII基因阻斷變株。
實(shí)施例4gdm RII基因阻斷變株的GDM發(fā)酵產(chǎn)量檢測將gdm RII基因阻斷變株—鏈霉菌17997-WHLR-2涂布在加有Am(50ug/ml)的MY培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)7天后，接種到種子培養(yǎng)基(葡萄糖1％，酵母浸膏0.4％，玉米漿0.5％，棉子餅粉0.5％，KH2PO40.05％，MgSO40.05％，CaCO30.3％)，在28℃的搖床培養(yǎng)24-28h后，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉2％，棉子餅粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米漿0.5％，酵母粉0.5％，CaCO30.2％)，28℃的搖床發(fā)酵培養(yǎng)5天，用乙酸己酯萃取發(fā)酵培養(yǎng)物的上清，提取物進(jìn)行HPLC檢測(圖4)。該變株進(jìn)行了3批次發(fā)酵、提取和HPLC重復(fù)實(shí)驗(yàn)。由圖4可以清楚地看到，原株GDM產(chǎn)量在HPLC檢測中所占峰面積為45.1％(圖4A)，gdm RII基因阻斷變株17997--WHLR-2的GDM產(chǎn)量峰面積為76.2％(圖4B)，GDM產(chǎn)量提高值達(dá)59.2％。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)首次證明，gdm RII基因?yàn)镚DM生物合成負(fù)調(diào)控基因，通過阻斷吸水鏈霉菌17997中格爾德霉素生物合成負(fù)調(diào)控基因gdm RII，可以提高格爾德霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>通過阻斷負(fù)調(diào)控基因提高格爾德霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法<160>2<210>1<211>2784<212>DNA<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220>
<221>CDS<222>(1)(2784)<400>
atgcccttca gctatgccat gccggtgaat accgagcgga attcccatcc gatggacacg60gtattgaatg ccgcggcgca cctcggacac gcgttcggtg actctttggt gcggcccggg120caggctcttc tcctggacgg accgctggca tgcggtaaga ccaccctgct ccggtcgttc180gccgagcggg ccgcggcggc cggccggctc gtcatcacgg cgacgtgttc tccctgcgag240cgggatcttc ccttcggtgt cgtctcccaa ctggcccgcg gcgcccggaa gtcagcgggc300gggccgcccg aggtgccggg gctgccggac atcctccgcg ggaccagcga cccggtggac360cgggccgaga tcgcccggct gtgccatcgg ctgtgcacct tgctgatcga ctacgcggaa420cacaccccgc tgctgctcgc cgtggacgat gtgcgccaca gcgatccggc ctccgcgcac480ttcctcctcc aactggtgcg gcggctggac tcggcacgga tcgccgccgt gttcaccgac540gatctgagcc tgcccgcgcc caccctgccg ctccgctacg aactgctgcg ctcccagcgc600ctgcaccgga tcggcctcgg cccgctcacc cccgacgagg tggccgacgt ggtcgtggcg660gagctggggg agaccgcgag cccccgcgcc ggcgatgtct acgccgccac cggtggcaac720cggctgctgc tgcacaccct gctggccgac taccgcgagc acggcgaggc ccgccagacc780ggctatggcc agtccttcct gagctgtctg caccgcaatg agccgatctt cctggacgtg840gtgcgcgcgc tggccgtggt gggcttctcc ttgcccgcca ccgacctggc ctggctgacc900ggacacgagc ccgagcccat cggccaggtg ctggcggcgc tgaccggcgc cggactgatg960gacgagggcg cgttccggca ggaggcggcg cggctgagcg tgctcaacga cacgccggcg1020ctgacccgca ggaccctgca ccagcgggcc gcgcggctgc tgcacgacca gggcaggccc1080gccaccacga tcgcccgtca tctggtgcgg gccgggcgga tccccgattc atggtcgccg1140gagctgctgc tggaagtggc cgagcaggtc gcggtgggcg aagaggcgtc cgtcgccgtc1200gacttactgg agcagtccct cgaacagtgt ccgcaccagg agcggcgcgc cgccttgcag1260gcgaagctcg ccgaggcgga atggaagatc aacccgtcca ccgccacccg gcaccacaca1320ccgctgtacg gcgccgtccg ggccggccgg ctcggcctcc ccgacagcgt caccctgctc1380atgcagctgc tgtggaaggg cgggctgacc gaggtggagg ggctgctcgc ccatctgcgc1440gaggaccccg ccgccaccga ccagctccat gccatcgagg ccgcgctcac ctgcacctac1500ccctggctcg cggagcggcg gccggccccg gcgcaccacg gtggctccgc cgcgacgcgg1560gcggcggtgt ggccgcgggc cggcaccgta ctcgcggacg tgctcaccgg cgggcagacc1620catgacaccg tccggcgggc cgaggaggtg ctgcgcgaac tccagctcgg gcacgacccg1680gcgtgccagg agcaggccgg gctgttcgcc ctgctcgcgc tggtctacgg cggccggatc1740gacctggcgt ccgcatggtg cgagggggcg ctcggcgaga ccggcgcggg gccgcacgtc1800ccgatgcggc aggcggtgct ggcggcggcc aggtcggaga tcgcgctgcg ccgaggtgac1860
ctcgccgagg ccgcggagcg gtcccgggcc gccctcaccc acgcctctcc cggcgcctgg1920ggtgtcgcgg tcgggctgcc gctcggctcc ctgatcctgg cgtgtacgcg gatgggccgg1980cacgaggagg cggggttcca cgtcgcgcag accgtgccca acgccatgtt caaaagctcc2040tacgggctgc actacctgta cgcgcgcggc cactacttcc tggcggccgg ccggcaccag2100gccgcgctcg cggactttct gctgtgcggc gagctgctca ccgactgggg gctgagcagc2160ggctgcgacc cggtgccatg gcggatcggc gcggcggagg catggctcgc gcagggcaac2220cacgaccagg cccggatcct ggtctaccag cagctcagcc gtccgcatac ggacggcgcc2280cgggcccgcg ggcagtcctt gcgcctcctg gccgccacca gctcggccaa gcggcggccg2340cagctgctca acgaggcggt gggcctgttc accgagcagg aggacaagta cgagctggct2400cgcacgctgt gggacctcag ccaggcgtac cacgcgctcg gcgagaagaa gcaggcccgc2460cggaccatgc gccgggcctg gcatgtggcg aagatgtgcg acgccgcgtc gctgtacgag2520gagtggctgc cggccgacga ccagtcccag gccgtggcgc cggctccgaa ggcggacgcc2580gggatcgagc ggttgacgca ctccgaacgg cgtgtcgcgt cgctggccgc catgggctac2640accaaccggg agatcgccgg gaagctgtat gtcacggcca gcacggtgga gcagcatctg2700acccgggtct tccgcaagct ggacatcaag caccgggagc agctgcccac cgaactctac2760gcggaccgca tggagttggc gtga 2784<210>2<211>927<212>PRT<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220>
<400>
Met Pro Phe Ser Tyr Ala Met Pro Val Asn Thr Glu Arg Asn Ser His1 5 10 15Pro Met Asp Thr Val Leu Asn Ala Ala Ala His Leu Gly His Ala Phe20 25 30Gly Asp Ser Leu Val Arg Pro Gly Gln Ala Leu Leu Leu Asp Gly Pro35 40 45Leu Ala Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Ala50 55 60Ala Ala Ala Gly Arg Leu Val Ile Thr Ala Thr Cys Ser Pro Cys Glu65 70 75 80Arg Asp Leu Pro Phe Gly Val Val Ser Gln Leu Ala Arg Gly Ala Arg85 90 95Lys Ser Ala Gly Gly Pro Pro Glu Val Pro Gly Leu Pro Asp Ile Leu100 105 110Arg Gly Thr Ser Asp Pro Val Asp Arg Ala Glu Ile Ala Arg Leu Cys115 120 125His Arg Leu Cys Thr Leu Leu Ile Asp Tyr Ala Glu His Thr Pro Leu130 135 140Leu Leu Ala Val Asp Asp Val Arg His Ser Asp Pro Ala Ser Ala His145 150 155 160Phe Leu Leu Gln Leu Val Arg Arg Leu Asp Ser Ala Arg Ile Ala Ala165 170 175
Val Phe Thr Asp Asp Leu Ser Leu Pro Ala Pro Thr Leu Pro Leu Arg180 185 190Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu His Arg Ile Gly Leu Gly Pro195 200 205Leu Thr Pro Asp Glu Val Ala Asp Val Val Val Ala Glu Leu Gly Glu210 215 220Thr Ala Ser Pro Arg Ala Gly Asp Val Tyr Ala Ala Thr Gly Gly Asn225 230 235 240Arg Leu Leu Leu His Thr Leu Leu Ala Asp Tyr Arg Glu His Gly Glu245 250 255Ala Arg Gln Thr Gly Tyr Gly Gln Ser Phe Leu Ser Cys Leu His Arg260 265 270Asn Glu Pro Ile Phe Leu Asp Val Val Arg Ala Leu Ala Val Val Gly275 280 285Phe Ser Leu Pro Ala Thr Asp Leu Ala Trp Leu Thr Gly His Glu Pro290 295 300Glu Pro Ile Gly Gln Val Leu Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gly Leu Met305 310 315 320Asp Glu Gly Ala Phe Arg Gln Glu Ala Ala Arg Leu Ser Val Leu Asn325 330 335Asp Thr Pro Ala Leu Thr Arg Arg Thr Leu His Gln Arg Ala Ala Arg340 345 350Leu Leu His Asp Gln Gly Arg Pro Ala Thr Thr Ile Ala Arg His Leu355 360 365Val Arg Ala Gly Arg Ile Pro Asp Ser Trp Ser Pro Glu Leu Leu Leu370 375 380Glu Val Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Glu Glu Ala Ser Val Ala Val385 390 395 400Asp Leu Leu Glu Gln Ser Leu Glu Gln Cys Pro His Gln Glu Arg Arg405 410 415Ala Ala Leu Gln Ala Lys Leu Ala Glu Ala Glu Trp Lys Ile Asn Pro420 425 430Ser Thr Ala Thr Arg His His Thr Pro Leu Tyr Gly Ala Val Arg Ala435 440 445Gly Arg Leu Gly Leu Pro Asp Ser Val Thr Leu Leu Met Gln Leu Leu450 455 460Trp Lys Gly Gly Leu Thr Glu Val Glu Gly Leu Leu Ala His Leu Arg465 470 475 480Glu Asp Pro Ala Ala Thr Asp Gln Leu His Ala Ile Glu Ala Ala Leu485 490 495Thr Cys Thr Tyr Pro Trp Leu Ala Glu Arg Arg Pro Ala Pro Ala His500 505 510His Gly Gly Ser Ala Ala Thr Arg Ala Ala Val Trp Pro Arg Ala Gly515 520 525
Thr Val Leu Ala Asp Val Leu Thr Gly Gly Gln Thr His Asp Thr Val530 535 540Arg Arg Ala Glu Glu Val Leu Arg Glu Leu Gln Leu Gly His Asp Pro545 550 555 560Ala Cys Gln Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Val Tyr565 570 575Gly Gly Arg Ile Asp Leu Ala Ser Ala Trp Cys Glu Gly Ala Leu Gly580 585 590Glu Thr Gly Ala Gly Pro His Val Pro Met Arg Gln Ala Val Leu Ala595 600 605Ala Ala Arg Ser Glu Ile Ala Leu Arg Arg Gly Asp Leu Ala Glu Ala610 615 620Ala Glu Arg Ser Arg Ala Ala Leu Thr His Ala Ser Pro Gly Ala Trp625 630 635 640Gly Val Ala Val Gly Leu Pro Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Cys Thr645 650 655Arg Met Gly Arg His Glu Glu Ala Gly Phe His Val Ala Gln Thr Val660 665 670Pro Asn Ala Met Phe Lys Ser Ser Tyr Gly Leu His Tyr Leu Tyr Ala675 680 685Arg Gly His Tyr Phe Leu Ala Ala Gly Arg His Gln Ala Ala Leu Ala690 695 700Asp Phe Leu Leu Cys Gly Glu Leu Leu Thr Asp Trp Gly Leu Ser Ser705 710 715 720Gly Cys Asp Pro Val Pro Trp Arg Ile Gly Ala Ala Glu Ala Trp Leu725 730 735Ala Gln Gly Asn His Asp Gln Ala Arg Ile Leu Val Tyr Gln Gln Leu740 745 750Ser Arg Pro His Thr Asp Gly Ala Arg Ala Arg Gly Gln Ser Leu Arg755 760 765Leu Leu Ala Ala Thr Ser Ser Ala Lys Arg Arg Pro Gln Leu Leu Asn770 775 780Glu Ala Val Gly Leu Phe Thr Glu Gln Glu Asp Lys Tyr Glu Leu Ala785 790 795 800Arg Thr Leu Trp Asp Leu Ser Gln Ala Tyr His Ala Leu Gly Glu Lys805 810 815Lys Gln Ala Arg Arg Thr Met Arg Arg Ala Trp His Val Ala Lys Met820 825 830Cys Asp Ala Ala Ser Leu Tyr Glu Glu Trp Leu Pro Ala Asp Asp Gln835 840 845Ser Gln Ala Val Ala Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gly Ile Glu Arg850 855 860Leu Thr His Ser Glu Arg Arg Val Ala Ser Leu Ala Ala Met Gly Tyr
865 870 875 880Thr Asn Arg Glu Ile Ala Gly Lys Leu Tyr Val Thr Ala Ser Thr Val885 890 895Glu Gln His Leu Thr Arg Val Phe Arg Lys Leu Asp Ile Lys His Arg900 905 910Glu Gln Leu Pro Thr Glu Leu Tyr Ala Asp Arg Met Glu Leu Ala915 920 925 92權(quán)利要求
1.通過阻斷格爾德霉素生物合成負(fù)調(diào)控基因gdm RII提高其發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征是所說方法包括以下步驟A、gdm RII基因阻斷重組載體的構(gòu)建；B、gdm RII基因阻斷變株的篩選與獲得；C、gdm RII基因阻斷變株的GDM發(fā)酵產(chǎn)量的檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻斷重組載體的構(gòu)建，是通過設(shè)計PCR引物或利用酶切位點(diǎn)從gdm RII基因取出兩個大小相近、分子量不低于500bp的片段，在其中間插入可供選擇的標(biāo)記基因，將這三個基因片段連接到質(zhì)粒載體如pGH112，構(gòu)建成用于gdm RII基因阻斷的重組載體；
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻斷變株的篩選與獲得，是將構(gòu)建的gdm RII基因阻斷重組載體，導(dǎo)入格爾德霉素產(chǎn)生菌，利用插入的標(biāo)記基因和載體上原有的標(biāo)記，進(jìn)行篩選獲得在染色體基因發(fā)生雙交換的gdm RII基因阻斷菌株；
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻斷變株的GDM發(fā)酵產(chǎn)量檢測，是將gdm RII基因阻斷菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物GDM進(jìn)行提取和HPLC分析，根據(jù)GDM的峰面積檢測其發(fā)酵產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用分子生物學(xué)操作技術(shù)、通過阻斷生物合成調(diào)控基因提高抗生素產(chǎn)量的方法，具體來講，就是在獲得gdm RII基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建gdm RII基因阻斷重組載體，篩選獲得gfm RII基因阻斷變株，再進(jìn)行g(shù)dm RII基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)量的檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，gdm RII基因?yàn)橐粋€負(fù)調(diào)控基因，將其阻斷后，可以提高格爾德霉素的發(fā)酵產(chǎn)量近60％，為其工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了有利條件，并在宏觀層面上，為提高抗生素產(chǎn)量展現(xiàn)了良好前景。
文檔編號C12N15/09GK1730661SQ20051008985
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者王以光, 赫衛(wèi)清, 劉玉瑛 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所