專利名稱：一種改良針葉樹種胚性愈傷組織質(zhì)量的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改良針葉樹種胚性愈傷組織質(zhì)量的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)外已有多種落葉松體細(xì)胞胚誘導(dǎo)成功的報(bào)道。要得到高質(zhì)量的體細(xì)胞胚，首先是通過落葉松外植體誘導(dǎo)，發(fā)生與形成符合要求的胚性愈傷組織，然后，利用培養(yǎng)基控制多胚的發(fā)生，大量繁殖得到體細(xì)胞胚。胚性愈傷組織不同階段的發(fā)育、高質(zhì)量早期原胚的形成是培養(yǎng)的關(guān)鍵。
現(xiàn)階段，落葉松胚性愈傷組織的培養(yǎng)基常用的有MS、DCR、SH、LP、GD等針葉樹離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基，存在的問題主要有早期原胚形成的狀態(tài)不好、胚性愈傷組織質(zhì)量不高、早期原胚發(fā)育不完全與子葉發(fā)育不正常、玻璃化問題、下胚軸不伸長、體細(xì)胞胚不生根等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種針葉樹種胚性愈傷組織培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的針葉樹種胚性愈傷組織培養(yǎng)基，包括以下組分KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O300-450mg/L，MgSO4.7H2O130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，蔗糖5-120g/L。
其中，培養(yǎng)基中蔗糖濃度優(yōu)選為15-45mg/L，更優(yōu)選為30-35mg/L。
為了能促進(jìn)在培養(yǎng)過程中胚性愈傷組織的成胚和發(fā)育，所述培養(yǎng)基中還含有450-550mg/L酸水解酪蛋白，400-500mg/L谷氨酰胺，0.2-2.2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.02-1.1mg/L 6-芐氨基嘌呤，1-7g/L瓊脂。
本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基的各種組分，特別是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中蔗糖濃度，使培養(yǎng)基更加有利于針葉樹種原胚的發(fā)育，并可以提高將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)基后形成子葉胚的數(shù)量和質(zhì)量，發(fā)生率可達(dá)到每克胚性愈傷組織320-360個(gè)高質(zhì)量體細(xì)胞胚，可以廣泛應(yīng)用于落葉松等針葉樹種的培養(yǎng)、發(fā)育。


圖1為原胚發(fā)育照片；圖2為所獲得的體細(xì)胞胚照片；圖3為成熟的子葉胚照片。
具體實(shí)施例方式
一、實(shí)驗(yàn)材料供試材料為日本落葉松(Larix leptolepis)、華北落葉松(Lari principis-Rupprechtii)、長白落葉松(Larix olgensis)、日本落葉松x長白雜種落葉松(Larix leptolepis x Larixolgensis)、日本落葉松x華北雜種落葉松(Larix leptolepis x L.principis-Rupprechtii)，采集于遼寧清源縣大孤家林場落葉松種子園。
二、實(shí)驗(yàn)方法將未成熟種子用0.1％的氯化汞溶液消毒9min，75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3～5次，切割種子、剝出幼胚，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基(表1)上，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，挑選其白色、粘性、半透明的轉(zhuǎn)接于上述培養(yǎng)基中，經(jīng)不斷繼代、增殖后，轉(zhuǎn)入2，4-D、BA、KT分別降到1/10的培養(yǎng)基上增殖幾代后，經(jīng)倒置顯微鏡檢查其含有不同發(fā)育時(shí)期的胚性胚柄團(tuán)，確定為胚性愈傷組織，進(jìn)行編號。
然后，將胚性愈傷組織接種于實(shí)驗(yàn)用的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，20d后分別觀察、檢查每個(gè)培養(yǎng)基中各個(gè)不同發(fā)育階段原胚的形態(tài)及發(fā)生數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
表1.啟動(dòng)培養(yǎng)基組分(mg/L)


實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基的配方如表2所示。
表2.培養(yǎng)基配方

注m1-m8培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基如下，并附加CH(酸水解酪蛋白)500mg/L，谷氨酰胺450mg/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.2mg/L，BA(6-芐氨基嘌呤)0.4mg/L，瓊脂3g/L，pH＝5.8。
基本培養(yǎng)基組分KNO32803mg/L，
NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 5.2mg/L，MnSO4.H2O10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O0.15mg/L，KI 0.51mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、蔗糖濃度對原胚發(fā)育的影響在m1-m8培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后，鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織狀態(tài)及原胚發(fā)育都有差異，結(jié)果如表3所示蔗糖濃度為10g/L時(shí)，愈傷組織輕度褐化，表面新產(chǎn)生的胚性愈傷組織較少，顯微鏡下單細(xì)胞很少，幾乎沒有形成的小ESM，甚至連II型ESM都很少見到，主要為III型ESM，且III型ESM的部分頭較園，表面光滑，但柄不發(fā)達(dá)，柄較短，也有一部分III型的ESM頭變薄、變小、變松，老化解體，同時(shí)也有很多老組織死亡；隨著蔗糖濃度的增加，胚性愈傷組織生長速度加快，表面生長出許多新的胚性愈傷細(xì)胞團(tuán)，顯微鏡下III型ESM比蔗糖濃度為10g/L時(shí)明顯少，而還未發(fā)育到III型，但頭較大、較園、接近III型的ESM較多，并出現(xiàn)較多剛形成的小ESM，單細(xì)胞的數(shù)量也大幅度上升；當(dāng)蔗糖濃度升到30g/L時(shí)，III型的ESM為0.2，而大胚頭的ESM也降為2，而剛形成的小ESM數(shù)增到4倍多，小胚頭的也增加2倍多，小頭和小ESM柄順、頭園、且相對同步，活力旺盛，也有一些頭不園的、頭松的，但柄順；隨著蔗糖濃度增到45g/L時(shí)，小頭、剛形成的小ESM都銳減，III型的和大頭的與30g/L時(shí)相似，但顯微鏡下死組織很多，整體活力差，部分ESM的胚頭細(xì)胞變大、變亂；當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)增到60g/L時(shí)，III型、大胚頭、剛形成各階段的原胚，包括單細(xì)胞都繼續(xù)減少；當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)增到75g/L時(shí)，顯微鏡下死組織較多、無大團(tuán)、單細(xì)胞也很少，只有一些剛形成的小ESM，但其活力也不旺盛；當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)增到100g/L時(shí)，顯微鏡下幾乎全為死組織，且質(zhì)壁分離相當(dāng)嚴(yán)重；當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)增到150g/L時(shí)，組織全部死亡，且質(zhì)壁分離。
表3.不同培養(yǎng)基下原胚的發(fā)育狀態(tài)比較(單位個(gè))

2、不同蔗糖濃度對子葉胚發(fā)育的影響將愈傷組織在含有ABA的成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所形成子葉胚的數(shù)量及質(zhì)量因其來源于不同蔗糖濃度培養(yǎng)基而差異明顯，結(jié)果如表4在蔗糖濃度為10～45g/L時(shí)，隨著蔗糖濃度的增加，子葉胚數(shù)量增加，其中蔗糖濃度為10g/L時(shí)，子葉胚數(shù)量明顯少，蔗糖濃度為20～30g/L之間差別不明顯；蔗糖濃度為45g/L時(shí)子葉胚數(shù)量增加、幅度大，約為蔗糖濃度10g/L時(shí)的3倍左右；隨著蔗糖濃度的繼續(xù)增高，子葉胚的數(shù)量逐漸下降，當(dāng)蔗糖濃度為150g/L時(shí)子葉胚發(fā)生，愈傷死亡。
表4.來自不同蔗糖濃度的愈傷組織在成熟培養(yǎng)基上形成子葉胚 (單位個(gè))

其中，所用的含ABA的成熟培養(yǎng)基配方如表5表5.成熟培養(yǎng)基組分 (mg/L)


以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)胚性愈傷組織兩周后，原胚發(fā)育照片如圖1所示，所獲得的體細(xì)胞胚照片如圖2，而成熟的子葉胚照片如圖3，由圖可見采用本發(fā)明的培養(yǎng)基，有利于胚性細(xì)胞的保持和快速增殖，能提高胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上所形成的原胚的數(shù)量和質(zhì)量，發(fā)生高質(zhì)量的子葉胚。
綜上所述，培養(yǎng)基中蔗糖濃度對于愈傷組織的原胚發(fā)育以及子葉胚的數(shù)量與質(zhì)量均有影響蔗糖濃度過高、高低都不利于原胚的形成與發(fā)育過低濃度的蔗糖有利于同步化，但I(xiàn)II型、大胚頭原胚質(zhì)量差，同樣也不利于形成高質(zhì)量的體細(xì)胞胚；另外，過高濃度的蔗糖也不利于原胚的形成與發(fā)育，甚至造成質(zhì)壁分離，使大多數(shù)胚性細(xì)胞死亡。比較而言，蔗糖濃度以20～30g/L時(shí)較好，其中最好的濃度為30g/L。
同時(shí)，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20-45g/L時(shí)，子葉胚的質(zhì)量也較好，體積大小適中、較長，子葉數(shù)量、形態(tài)正常，愈傷化胚較少；蔗糖濃度過高或過低時(shí)，其胚質(zhì)量都較差，總體較短，愈傷化胚比例較大。
權(quán)利要求
1.一種針葉樹種胚性愈傷組織培養(yǎng)基，包括以下組分KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O300-450mg/L，MgSO4.7H2O130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，蔗糖5-120g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中蔗糖濃度為15-45mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30-35mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中還含有450-550mg/L酸水解酪蛋白，400-500mg/L谷氨酰胺，0.2-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.02-1.1mg/L 6-芐氨基嘌呤，1-7g/L瓊脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了針葉樹種胚性愈傷組織培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的針葉樹種胚性愈傷組織培養(yǎng)基，包括以下組分KNO
文檔編號C12N5/04GK1733905SQ20051009028
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者齊力旺, 王建華, 張守攻, 韓素英 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所