專利名稱:質(zhì)粒dna大規(guī)模純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及質(zhì)粒DNA大規(guī)模純化工藝。
背景技術(shù):
DNA疫苗是近年來剛發(fā)展的一種新型高效疫苗,它的主要特征是將外源基因克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒載體,將重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入機(jī)體后,質(zhì)粒以附加體的形式存在,并在宿主體內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白作為抗原,從而達(dá)到預(yù)防疫病的目的。
和現(xiàn)有疫苗相比,DNA疫苗的優(yōu)越性主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)產(chǎn)生的蛋白抗原可被提呈給MHC II和MHC I類分子,并分別與CD4+和CD8+相結(jié)合,引起全面的免疫保護(hù)應(yīng)答;可以對(duì)結(jié)核桿菌、利什曼原蟲等胞內(nèi)寄生蟲產(chǎn)生很好的免疫保護(hù);有效期可長(zhǎng)達(dá)1年,且有堅(jiān)強(qiáng)的免疫力;疫苗的設(shè)計(jì)和改造相對(duì)簡(jiǎn)單,疫苗的制備也相對(duì)容易;對(duì)人畜沒有毒副作用,不具毒力返強(qiáng)等不利因素;不存在注射部位的壞死、肉芽腫,可以改善肌肉品質(zhì),提高效益。
雖然DNA疫苗具有上述眾多優(yōu)點(diǎn),但是其質(zhì)量要求也十分嚴(yán)格,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)粒DNA的純化過程不能使用動(dòng)物源性的酶(RNaseA和蛋白酶K);不能使用對(duì)人畜有毒的苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑;避免大量使用易燃、易爆的無水乙醇和異丙醇等有機(jī)試劑。所純化的質(zhì)粒DNA純度要求高,參照人醫(yī)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),其OD260/OD280需在1.75-1.85之間,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不到RNA;二辛可寧酸檢測(cè)蛋白的含量在0.001μg/μg質(zhì)粒DNA;鱟試劑檢測(cè)的內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.01EU/μg質(zhì)粒DNA;宿主基因組的含量應(yīng)小于10ng/μg質(zhì)粒DNA;超螺旋的量應(yīng)大于90%。
質(zhì)粒DNA的純化相對(duì)困難,主要原因是其分子量較大、電荷負(fù)性和易碎性。DNA雙螺旋磷酸骨架的電負(fù)性與內(nèi)毒素和宿主雜蛋白的電荷性一致,使得質(zhì)粒DNA分子與這些分子之間的分離變得復(fù)雜;另外,長(zhǎng)分子鏈DNA分子的易斷裂性也給大規(guī)模純化質(zhì)粒DNA增加了難度。
目前大規(guī)模純化質(zhì)粒DNA的方法有氯化銫密度梯度離心法、親和層析法、分子截留法和多聚陽離子沉淀法等。其中氯化銫密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA是最經(jīng)典的方法,雖然用此方法所純化的質(zhì)粒DNA能夠達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),純度也相當(dāng)高。但是它必須在使用溴化乙錠和氯化銫的情況下長(zhǎng)時(shí)間高速離心制得,不僅耗時(shí)、耗力、污染環(huán)境,而且費(fèi)用昂貴,已經(jīng)不再適合繼續(xù)使用。
隨著無污染運(yùn)動(dòng)的興起,親和層析法純化質(zhì)粒DNA顯示出較好的前景,目前使用的多包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析等等。該方法的原理主要是利用質(zhì)粒DNA的電負(fù)性和親水性,純化的效果與氯化銫密度梯度離心接近或稍低。親和層析雖然沒有環(huán)境污染等嚴(yán)重問題,但是其耗時(shí)且成本昂貴,且需要進(jìn)行預(yù)處理,從而限制了其進(jìn)一步的使用。
用分子截留技術(shù)進(jìn)行質(zhì)粒DNA純化的設(shè)想雖好,但實(shí)際效果不佳,目前尚處于研究階段,它主要是利用所提取的細(xì)胞組分中各組分分子量的不同,控制好膜的孔徑和跨膜壓,從而達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的。根據(jù)綜合報(bào)道,該技術(shù)通常需要進(jìn)行預(yù)處理,純化步驟較多,且純化效果僅是中等。同時(shí),由于質(zhì)粒DNA主要以細(xì)長(zhǎng)并具有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在,其分子量與其實(shí)際需要的膜的孔徑不成完全相關(guān)性,因此分子截留技術(shù)不能完全適用于質(zhì)粒DNA的純化。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種價(jià)格適宜的質(zhì)粒DNA的大規(guī)模純化方法。
本發(fā)明的DNA純化方法包括使用了十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、3M醋酸鉀和TrionX-114。
具體而言,本發(fā)明所述的純化方法包括下列步驟
第一步基因工程重組菌的發(fā)酵從種子庫(kù)中取出一支重組菌種,在抗性平板上劃線長(zhǎng)成單菌落后,于含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并以10%的比例接種到10L發(fā)酵礶中,在30%溶解氧,pH為7.0的條件下發(fā)酵含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌,在發(fā)酵過程中,以O(shè)D600來監(jiān)測(cè)重組菌的生長(zhǎng)狀態(tài),當(dāng)細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)停止發(fā)酵,離心收集重組菌菌體;第二步按照每克濕菌重加入5ml溶液I(25mM/L Tris-Cl,10mM/L EDTA,50mM/L葡萄糖)的量加入溶液I將重組菌體進(jìn)行懸浮,然后按照1∶2∶1.5的比例加入溶液II(0.2M NaOH,1%SDS)和溶液III(5mM/L乙酸鉀,冰乙酸11.5ml,H2O 28.5ml)進(jìn)行變性和復(fù)性,以6000g離心10分鐘并收集上清,取一小份加入0.7倍體積的異丙醇或者兩倍體積無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA,沉淀的質(zhì)粒DNA用TE溶解后,以1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合λHind III Marker,用凝膠分析軟件分析定量,并計(jì)算出所收集上清中含有的質(zhì)粒DNA總量;第三步根據(jù)質(zhì)粒DNA總量,加入5%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌均勻后,于20℃以8000g離心15min收集沉淀,棄上清,沉淀用3M醋酸鉀溶液溶解后,在4℃以10000g離心15min,棄沉淀,保留上清;第四步在上清中加入0.7倍體積的異丙醇或者2倍體積的無水乙醇,在4℃以10000g離心15min,保留沉淀,棄上清,最后將質(zhì)粒DNA用75%酒精洗滌兩次,并溶解在不含內(nèi)毒素的雙蒸水中;第五步在質(zhì)粒溶解液中加入一定量的TritonX-114,劇烈振蕩后置于冰上孵育10分鐘,然后將含有TritonX-114的溶液加熱到38~58℃(在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該溫度為50℃),10分鐘后以10000g離心10分鐘,所獲得的上清即為已純化的質(zhì)粒DNA溶液。
雖然在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)使用過了十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和3M醋酸鉀,但是這兩種試劑在本發(fā)明純化工藝中的工作原理和發(fā)揮的作用完全不同。
CTAB是一種無毒、無害的陽離子去污劑。專利ZL01114195.6中使用高濃度的CTAB作為海帶基因組的提取試劑,不僅與本發(fā)明的原理及作用對(duì)象完全不同,而且其中使用了苯酚、氯仿等輔助溶劑,而本發(fā)明則利用CTAB在低濃度下可以選擇性沉淀質(zhì)粒DNA分子的特性,從含有宿主基因組DNA、RNA、雜蛋白和內(nèi)毒素的溶液中選擇性地沉淀質(zhì)粒DNA,同時(shí)CTAB還可以作為一種陽離子包裹劑,部分起到免疫增強(qiáng)和DNA包裹作用。
《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版,科學(xué)出版社,2003年1月)第32-34頁方案3描述了SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的主要步驟,其中用到了3M醋酸鉀,主要作用是利用其鉀離子置換鈉離子,并形成不可溶性的染色體DNA、高分子量RNA以及鉀離子/SDS/蛋白質(zhì)/細(xì)胞壁復(fù)合物,而本發(fā)明則是利用3M醋酸鉀可特異性地溶解CTAB和DNA不溶性膠體復(fù)合物的特性,從而特異性地從之前加入的CTAB和DNA不溶性膠體復(fù)合物中釋放出質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明使用TrionX-114則是利用了其可以特異性地結(jié)合細(xì)菌內(nèi)毒素而不損失質(zhì)粒DNA的特性,從所純化的質(zhì)粒DNA中有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素。
本發(fā)明所描述的純化工藝可以代替各種層析純化法,并且純化成本明顯降低,所純化的質(zhì)粒DNAOD260/OD280在1.75-1.85之間,內(nèi)毒素含量小于0.05EU/μg質(zhì)粒DNA,不會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生毒副作用。
本發(fā)明所描述的純化工藝適合于各種質(zhì)粒載體,所純化的質(zhì)粒DNA不僅適合于實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和DNA疫苗免疫試驗(yàn),更適合于進(jìn)行動(dòng)物免疫預(yù)防所需的DNA疫苗的大規(guī)模制備,為DNA疫苗在動(dòng)物上的應(yīng)用提供了很好的平臺(tái)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明所描述的質(zhì)粒DNA純化方法不使用動(dòng)物源性的RNase A和蛋白酶K以及對(duì)人體和動(dòng)物有毒副作用的苯酚、氯仿,另外,最大限度降低了易燃性有機(jī)溶劑無水乙醇和異丙醇的使用。
2、按本發(fā)明所純化的質(zhì)粒DNA的各項(xiàng)指標(biāo)均能達(dá)到或接近相關(guān)領(lǐng)域如美國(guó)食物和藥品管理局(FDA)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
圖1圖示的是含有重組質(zhì)粒pcDNAKCpG基因工程菌的生長(zhǎng)曲線。
圖2圖示的是重組菌體與溶液I之間的混合比例。
圖3圖示的是CTAB對(duì)質(zhì)粒DNA的選擇性沉淀曲線。
圖4圖示的是純化質(zhì)粒pcDNAKCpG的RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
圖5圖示的是純化質(zhì)粒中雜蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果(二辛可寧酸法)。
圖6圖示的是用于制備探針的基因組DNA片段的電泳結(jié)果。
圖7圖示的是純化質(zhì)粒DNA中殘留的基因組DNA Southern印跡檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pcDNAKCpG的提取和純化1、含重組質(zhì)粒pcDNAKCpG(在購(gòu)自Invitrogen公司質(zhì)粒pcDNA3.0中插入CpG寡核苷酸得到的,詳細(xì)描述參見CN1554751A)基因工程重組菌(宿主菌DH5α購(gòu)自Invitrogen公司)的發(fā)酵從種子庫(kù)中取出一支菌種,在抗性平板上劃線長(zhǎng)成單菌落后,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并以10%的比例接種到10L發(fā)酵礶中,以30%溶解氧,pH為7.0的條件來發(fā)酵含有重組質(zhì)粒pcDNAKCpG的重組大腸桿菌,待OD600達(dá)到30時(shí)停止發(fā)酵(圖1),離心收集重組菌體,稱取400克濕菌。
2、按照每克濕菌重加入5ml溶液I(25mM/L Tris-Cl,10mM/L EDTA,50mM/L葡萄糖)的量加入2000ml溶液I將重組菌體懸浮(圖2),然后按照1∶2∶1.5的比例加入4000ml溶液II(0.2M NaOH,1%SDS)和3000ml溶液III(5mM/L乙酸鉀,冰乙酸11.5ml,H2O 28.5ml)進(jìn)行變性和復(fù)性,詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版,科學(xué)出版社,2003年1月)p1579-1560。以6000g離心10分鐘后收集上清,取1ml上清加入兩倍體積無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA,沉淀的質(zhì)粒DNA用100μl TE溶解后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)合λHind III Marker,用凝膠分析軟件分析定量,計(jì)算出上清中所含有的質(zhì)粒DNA總量為300mg。
3、根據(jù)質(zhì)粒DNA的總量,加入150ml 5%CTAB(購(gòu)自Amersco公司)(圖3),以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌均勻后,于20℃以8000g離心15min收集沉淀,棄上清。沉淀用150ml 3M醋酸鉀溶液溶解后,在4℃以10000g離心15min,棄沉淀,保留上清。
4、在100ml上清中加入70ml異丙醇或者140ml無水乙醇,在4℃以10000g離心15min,保留沉淀,棄上清。最后,將質(zhì)粒DNA用75%酒精洗滌兩次,并溶解在30ml不含內(nèi)毒素的雙蒸水中。
5、在質(zhì)粒溶解液中加入0.33ml TritonX-114(購(gòu)自Sigma公司)使其終濃度為1%,劇烈振蕩混勻后置于冰上孵育10分鐘,然后將含有1%TritonX-114的質(zhì)粒溶液加熱到50℃,10分鐘后以10000g離心10分鐘,于無菌臺(tái)中小心吸取上清于另一無內(nèi)毒素的容器中。
所純化質(zhì)粒的效果按本發(fā)明所純化的質(zhì)粒DNA在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)不到RNA(圖2);超螺旋質(zhì)粒占總質(zhì)粒DNA的88%(圖2);用BCA(二辛可寧酸)法檢測(cè)不到宿主菌雜蛋白(圖3);宿主菌基因組DNA控制在1%以下(圖4);用鱟試劑(購(gòu)自廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)檢測(cè),純化后質(zhì)粒中內(nèi)毒素的含量為50EU/mg質(zhì)粒DNA。
單獨(dú)使用CTAB純化質(zhì)粒DNA的效果單獨(dú)使用CTAB所純化的質(zhì)粒DNA雖然在1%瓊脂糖也檢測(cè)不到RNA,但由于未使用3M醋酸鉀,質(zhì)粒DNA難以從CTAB和DNA不溶性膠體復(fù)合物中釋放出來,因此,質(zhì)粒的回收率只有20%。另外,單獨(dú)使用CTAB所純化的質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素的含量大于10000EU/mg質(zhì)粒DNA,明顯不符合醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒DNA的純化方法,該方法包括下列步驟第一步基因工程重組菌的發(fā)酵從種子庫(kù)中取出一支重組菌種,在抗性平板上劃線長(zhǎng)成單菌落后,于含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并以10%的比例接種到10L發(fā)酵礶中,在30%溶解氧,pH為7.0的條件下發(fā)酵含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌,在發(fā)酵過程中,以O(shè)D600來監(jiān)測(cè)重組菌的生長(zhǎng)狀態(tài),當(dāng)細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)停止發(fā)酵,離心收集重組菌菌體;第二步按照每克濕菌重加入5ml溶液I的量加入溶液I將重組菌體進(jìn)行懸浮,然后按照1∶2∶1.5的比例加入溶液II和溶液III進(jìn)行變性和復(fù)性,以6000g離心10分鐘并收集上清,取一小份加入0.7倍體積的異丙醇或者兩倍體積無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA,沉淀的質(zhì)粒DNA用TE溶解后,以1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合λHind III Marker,用凝膠分析軟件分析定量,并計(jì)算出所收集上清中含有的質(zhì)粒DNA總量;第三步根據(jù)質(zhì)粒DNA總量,加入5%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌均勻后,于20℃以8000g離心15min收集沉淀,棄上清,沉淀用3M醋酸鉀溶液溶解后,在4℃以10000g離心15min,棄沉淀,保留上清;第四步在上清中加入0.7倍體積的異丙醇或者2倍體積的無水乙醇,在4℃以10000g離心15min,保留沉淀,棄上清,最后將質(zhì)粒DNA用75%酒精洗滌兩次,并溶解在不含內(nèi)毒素的雙蒸水中;第五步在質(zhì)粒溶解液中加入一定量的TritonX-114,劇烈振蕩后置于冰上孵育10分鐘,然后將含有TritonX-114的溶液加熱到38~58℃,10分鐘后以10000g離心10分鐘,所獲得的上清即為已純化的質(zhì)粒DNA溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA純化方法,其中所述已純化的質(zhì)粒DNA中超螺旋質(zhì)粒占總質(zhì)粒DNA總重量的80-90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒DNA的純化工藝,為包括使用3M醋酸鉀、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和TritonX-114來純化質(zhì)粒DNA,能夠很好地去除宿主RNA、宿主雜蛋白、宿主內(nèi)毒素和宿主的基因組DNA,所純化的質(zhì)粒DNA OD
文檔編號(hào)C12N1/21GK1737137SQ20051009072
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者朱鴻飛, 孫懷昌, 張泉 申請(qǐng)人:朱鴻飛