專利名稱：巨大芽孢桿菌及其制備方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境和飼用生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種微生物菌種的篩選、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自三千年前至今利用乳酸菌及其發(fā)酵制品制成人和畜禽的保健品，直接飼喂動(dòng)物的微生物1974年首先被美國(guó)R.E.Parker稱之為Probiotas(益生菌)1989年Enller等重新定義為一種可以通過(guò)改善腸道菌群平衡而對(duì)動(dòng)物施加有影響的活微生物飼用添加劑。目前美國(guó)歐洲等地均在推廣使用，中國(guó)在八五期間，國(guó)家也列入重點(diǎn)攻關(guān)課題。根據(jù)目前的研究進(jìn)展仍然是乳酸菌屬的微生物為主體。1989年美國(guó)食品藥品管理局(FDA)公布的42種和中國(guó)農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告公布的允許使用的菌中為12種，其中美國(guó)乳酸菌屬占74％，中國(guó)占70％，而芽孢桿菌中美國(guó)有凝結(jié)芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌等五種，中國(guó)有枯草芽孢桿菌，納豆芽孢桿菌二種，由于芽孢桿菌不僅具有豐富的多功能酶活性和促長(zhǎng)、抗菌因素，抗逆性強(qiáng)，適宜加工耐貯藏等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)消除人畜禽糞便腐敗所產(chǎn)生的惡臭氣體，也有顯著的作用，因此是目前研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為環(huán)保和畜禽的飼用提供一種新的巨大芽孢桿菌。本發(fā)明菌種于2004年12月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記號(hào)為GMCC No1259，其基因的DNA序列為ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180
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存活的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)已于2004年12月6日于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是發(fā)明巨大芽孢桿菌的一種制備方法，其特征在于包括以下步驟1)取畜禽糞，采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行平板稀釋分離；2)挑取芽孢桿菌的單菌落；3)純化4)采用硫化氫和靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)方法，將分離出呈陰性的單菌落，即巨大芽孢桿菌。
上述步驟1)中，先將畜禽糞稀釋于1000倍～10000倍的無(wú)菌水中，經(jīng)80℃水浴15分鐘，再將稀釋后的畜禽糞平鋪在平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，置于34℃～35℃中培養(yǎng)3～4天。
本發(fā)明還可采用沙土管或凍干粉管對(duì)巨大芽孢桿菌進(jìn)行保藏。
本發(fā)明還可通過(guò)以下方法進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)將巨大芽孢桿菌移接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，制成第一代原種，再移至發(fā)酵罐，經(jīng)繁殖罐擴(kuò)大培養(yǎng)，形成芽孢后，經(jīng)離心濃縮，取固體物質(zhì)，噴霧干燥獲得粉狀巨大芽孢桿菌。
上述發(fā)酵罐中液體配方中，每1000ml水，以下各組分為糖類20～25g、豆粕10～15g、魚粉5g、硫酸氫二鉀2g、硫酸鎂1g、氯化鈉5g、硫酸鈣3g，PH為7.2。
于發(fā)酵罐中，在32±1℃培養(yǎng)溫度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48～52小時(shí)。
另外，本發(fā)明還提供了巨大芽孢桿菌的兩種用途一種是巨大芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物除臭劑。
另一種是巨大芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物調(diào)理劑。
具體實(shí)施例1、將10g畜禽糞稀釋于1000倍～10000倍的無(wú)菌水中，經(jīng)80℃水浴15分鐘，再將稀釋后的畜禽糞平鋪在平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，置于34℃～35℃中培養(yǎng)3～4天。
2、挑取芽孢桿菌的單菌落。
3、以常規(guī)方法進(jìn)行純化。
4、采用硫化氫和靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)方法，將分離出呈陰性的單菌落，即巨大芽孢桿菌將純化后的單菌落分別進(jìn)行硫化氫和靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)。進(jìn)行靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)時(shí)，生成玖瑰吲哚呈紫紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。進(jìn)行硫化氫生化動(dòng)力檢測(cè)時(shí)，生成黑色的硫酸亞鐵沉淀的為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。(由于另外一些細(xì)菌分解含硫氨基酸，生成硫化氫，或?qū)⒘蛩猁}還原為硫化氫，而硫化氫和亞鐵結(jié)合形成黑色的硫酸亞鐵沉淀。)留取上述反應(yīng)都呈陰性的單菌落。
為了獲得穩(wěn)定的單菌落，可根據(jù)此原理經(jīng)過(guò)反復(fù)的檢測(cè)，篩選得到生化動(dòng)力反應(yīng)為陰性的芽孢桿菌屬本發(fā)明的巨大芽孢桿菌。
5、采用沙土管或凍干粉管對(duì)巨大芽孢桿菌保藏。
6、擴(kuò)增培養(yǎng)將巨大芽孢桿菌從沙土管或凍干粉管中移接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，制成第一代原種，再移至發(fā)酵罐，在發(fā)酵罐內(nèi)加入發(fā)酵液體，高壓滅菌，冷卻至32±1℃，然后在32±1℃培養(yǎng)溫度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48～52小時(shí)，在擴(kuò)大培養(yǎng)其間，向密封的發(fā)酵罐連續(xù)通入無(wú)菌空氣，無(wú)菌空氣與發(fā)酵液的比值為1立方米∶1噸，并連續(xù)攪拌。待芽孢形成后放罐，一般每毫升發(fā)酵液體中含芽孢50億以上，經(jīng)離心濃縮，取固體物質(zhì)，噴霧干燥獲得粉狀巨大芽孢桿菌，原粉中的活芽孢含量每克為500億以上。噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度為125℃，出風(fēng)溫度為60℃。
上述發(fā)酵罐中液體配方中，每1000ml水，以下各組分為糖類20～25g、豆粕10～15g、魚粉5g、硫酸氫二鉀2g、硫酸鎂1g、氯化鈉5g、硫酸鈣3g，PH為7.2，發(fā)酵罐在121±2℃中滅菌。
將獲得的巨大芽孢桿菌進(jìn)行基因測(cè)序，其基因的DNA序列為ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cctaagagaa aagcggattt ccacgtgtag 660cggtgaaatg cgtta。
應(yīng)用一、巨大芽孢桿菌原粉用于生物快速除臭劑。主要應(yīng)用于人畜禽糞便、生活垃圾污泥等除臭和腐解。
將豬糞雞糞牛糞等投入具有加溫?cái)嚢璧姆磻?yīng)槽中，用稻草粉或煤炭等干料，調(diào)節(jié)含水量60％左右，加巨大芽孢桿菌原粉2～5‰，攪拌均勻，12小時(shí)后，糞便自發(fā)溫度即可達(dá)40℃左右，24小時(shí)之內(nèi)消除惡臭，并迅速溫度發(fā)酵(50～60℃)約持續(xù)3～5天高溫發(fā)酵，有機(jī)氮提高25％左右，并已達(dá)到半腐熟狀態(tài)，間隙攪拌促使水分蒸發(fā)，在一周這內(nèi)可使畜禽糞便加工成無(wú)臭無(wú)害的半腐熟有機(jī)肥。
取1000g生活垃圾污泥和1g巨大芽孢桿菌原粉充分混和、堆置，經(jīng)60小時(shí)后，經(jīng)測(cè)定，無(wú)臭味。
二、巨大芽孢桿菌原粉用于生產(chǎn)生物除臭調(diào)理劑，主要應(yīng)用于畜禽飼用添加劑，可以過(guò)腹除臭，降低畜禽舍內(nèi)臭味，特別是氨的含量，同時(shí)可以促進(jìn)生長(zhǎng)與提高免疫功能。
對(duì)大白鼠、畢克犬、豬、雞等不同劑量的喂養(yǎng)均表現(xiàn)安全又無(wú)副作用，發(fā)現(xiàn)尿液澄清無(wú)臭感，糞便較干燥成形，無(wú)臭感，并有顯著促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。
以1～2‰巨大芽孢桿菌原粉混合入飼料，飼喂兩批黃羽雞，結(jié)果表明，消化道系統(tǒng)得到改善，食欲旺，消化吸收好，第一批黃羽雞比對(duì)照組增重8～12％，第二批雞增重6～8％，均達(dá)到顯著水平，并且肉質(zhì)香嫩，畢克犬飼喂不同劑量試驗(yàn)，每周稱重，86天后分別比對(duì)照組增重8％、10％、15％，并且毛色亮麗，體態(tài)健美，豬的增重也很顯著，比對(duì)照組增重10％以上。
權(quán)利要求
1.巨大芽孢桿菌，其特征在于該菌種在中國(guó)微生物菌種保藏登記號(hào)為GMCC No 1259，其基因的DNA序列為ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cctaagagaa aagcggattt ccacgtgtag 660cggtgaaatg cgtta。
2.巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)取畜禽糞，采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行平板稀釋分離；2)挑取芽孢桿菌的單菌落；3)純化；4)采用硫化氫和靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)方法，將分離出呈陰性的單菌落，即巨大芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于步驟1)中，先將畜禽糞稀釋于1000倍～10000倍的無(wú)菌水中，經(jīng)80℃水浴15分鐘，再將稀釋后的畜禽糞平鋪在平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，置于34℃～35℃中培養(yǎng)3～4天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于采用沙土管或凍干粉管對(duì)巨大芽孢桿菌保藏。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、或3或3所述巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于將巨大芽孢桿菌移接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，制成第一代原種，再移至發(fā)酵罐，經(jīng)繁殖罐擴(kuò)大培養(yǎng)，形成芽孢后，經(jīng)離心濃縮，取固體物質(zhì)，噴霧干燥獲得粉狀巨大芽孢桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于發(fā)酵罐中液體配方中，每1000ml水，以下各組分為糖類20～25g、豆粕10～15g、魚粉5g、硫酸氫二鉀2g、硫酸鎂1g、氯化鈉5g、硫酸鈣3g，PH為7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述巨大芽孢桿菌的制備方法，其特征在于在32±1℃培養(yǎng)溫度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48～52小時(shí)。
8.巨大芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物除臭劑。
9.巨大芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物調(diào)理劑。
全文摘要
巨大芽孢桿菌及其制備方法、用途，涉及環(huán)境和飼用生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種微生物菌種的篩選、制備方法及其應(yīng)用。包括以下步驟取畜禽糞，采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行平板稀釋分離、挑取芽孢桿菌的單菌落、純化，最后采用硫化氫和靛基質(zhì)生化動(dòng)力檢測(cè)方法，將分離出呈陰性的單菌落，即巨大芽孢桿菌，可用于生產(chǎn)生物除臭劑和生物調(diào)理劑。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1786151SQ20051009127
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者戴承鏞 申請(qǐng)人:戴承鏞