專利名稱：用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法涉及的是一種關(guān)于應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)制備成纖維細(xì)胞的方法，產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞可用于細(xì)胞移植。屬于生物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分。成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維以及基質(zhì)的糖胺多糖和糖蛋白。在創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)，成纖維細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)。雖然成纖維細(xì)胞是已分化的細(xì)胞，但也具有可塑性，它能改變其形態(tài)和功能特征，以適應(yīng)其所在微環(huán)境的特殊需要。在創(chuàng)傷愈合時(shí)，局部成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞兩者結(jié)構(gòu)特征的細(xì)胞，即既具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，又含有很多肌動(dòng)蛋白微絲和肌球蛋白，而稱為肌成纖維細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)變是可逆性的。肌成纖維細(xì)胞有收縮能力。
成人結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞很少進(jìn)行分裂，在結(jié)締組織受到損傷時(shí)由結(jié)締組織中的成纖維前體細(xì)胞分裂增殖。在不同器官的結(jié)締組織內(nèi)，成纖維前體細(xì)胞的形態(tài)雖然相同，但由于所在環(huán)境不同而各有其特殊性。成纖維前體細(xì)胞在組織培養(yǎng)中可表現(xiàn)不同的性質(zhì)，皮膚的成纖維前體細(xì)胞繁殖較慢，其細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)。
壓力性尿失禁就是人體在腹壓增加的情況下尿液不自主流出。壓力性尿失禁是中老年女性常見病，發(fā)病率15-60％。近年來(lái)認(rèn)為尿道粘膜下層的平滑肌和膠原纖維的數(shù)量、功能狀態(tài)對(duì)正常的尿道關(guān)閉起重要作用。研究表明壓力性尿失禁主要原因是尿道粘膜閉合機(jī)制和尿道近端2/3括約肌障礙。傳統(tǒng)治療壓力性尿失禁方法主要是針對(duì)后尿道解剖異常的各種膀胱頸懸吊術(shù)、膀胱頸注射化學(xué)充添劑、注射異種膠原或自體脂肪以增加膀胱頸阻力。但上述治療方法有遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率較高，有一定副作用和不符合人體生理等缺點(diǎn)。
隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚真皮層內(nèi)的成纖維細(xì)胞、膠原蛋白、彈性蛋白的數(shù)量逐漸減少，皮膚開始松弛，在人的面部出現(xiàn)許多的皺紋。另外，因各種原因造成的皮下組織或真皮缺損，可以在人的體表形成凹陷性的瘢痕。這些都會(huì)影響人的外觀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)上述不足之處提供一種用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法。這種應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法所產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞可用于細(xì)胞移植。
本發(fā)明是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法從9mm3-21mm3小塊皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，純化后培養(yǎng)成纖維前體細(xì)胞使其分化為成纖維細(xì)胞、并增殖到4×107-8×107個(gè)，所制備的細(xì)胞為傳代次數(shù)不超過(guò)5次，處于功能活躍期的成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞的方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌條件下，獲取受術(shù)者9mm3-21mm3小塊皮膚組織；(2)采用機(jī)械解離細(xì)胞法從皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行植塊培養(yǎng)，步驟如下1)首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放人小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至似糊狀；2)加入3ml培養(yǎng)液到燒杯中，反復(fù)輕輕吹打片刻，離心800～1200r/min，3～5min，去上清，剩下的組織小塊用于培養(yǎng)；3)用濕潤(rùn)的吸管小心吸取組織小塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；4)用玻棒將植塊排列好；5)加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以不使植塊浮出為準(zhǔn)；6)送入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置；7)在2～4天內(nèi)加入足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)采用差速脫壁處理方法純化成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，步驟如下1)吸去舊培養(yǎng)液；2)用PBS溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物2～4次，盡量洗去殘余血清，棄PBS溶液；3)給培養(yǎng)器皿內(nèi)加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃條件下消化3～5min；4)以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入培養(yǎng)液終止消化；5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；6)離心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液；7)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1-2×103個(gè)/ml；8)接種在1-2個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；9)送人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(4)使用特制的培養(yǎng)液促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；
(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在成熟的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃條件下消化3～5min，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁，離心800～1000r/min，3～5min，除去上清含酶溶液，加入生理鹽水5ml，離心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，再加入生理鹽水5ml，離心800～1200r/min，3～5min，，除去上清液，將細(xì)胞沉淀用生理鹽水懸浮，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，即制成自體成纖維細(xì)胞懸浮液。
所述的9mm3-21mm3小塊皮膚組織取自受術(shù)者的自體的健康皮膚，不限定部位。
所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10～15％胎牛血清。
所述的促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖的特制的培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15～30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰島素。
所述的收集的成纖維細(xì)胞是傳代次數(shù)為2～5次、處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是提供一種能應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)從成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，這種用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞可以供治療女性尿失禁和消除皺紋及凹陷性疤痕的細(xì)胞移植之用。本發(fā)明用最少量的組織即成纖維前體細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，制備成自體成纖維細(xì)胞，來(lái)修復(fù)大塊的組織缺損，達(dá)到無(wú)損傷修復(fù)創(chuàng)傷和真正意義上的功能重建。
應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞注射到尿道周圍組織，增殖的成纖維細(xì)胞分泌膠原纖維和彈性纖維使尿道壁增厚、彈性增加；具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞的形成，可以使括約肌功能恢復(fù)，尿道粘膜閉合機(jī)制恢復(fù)，從而使尿失禁癥狀消失。
將應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞所制備的自體成纖維細(xì)胞，注射到皺紋或疤痕處的皮膚真皮層內(nèi)，成纖維細(xì)胞在母體的環(huán)境中能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，源源不斷地產(chǎn)生自體膠原蛋白和彈性蛋白，膠原蛋白和彈性蛋白再組成膠原纖維和彈性纖維，就會(huì)使皮膚真皮層的厚度和密度增加，填平皺紋或疤痕，恢復(fù)皮膚彈性和光澤。
由于這項(xiàng)技術(shù)制備的是自體細(xì)胞，移植到尿道周圍組織、皺紋和疤痕處的皮膚真皮層內(nèi)后，在人體內(nèi)是一種自然生理性的修復(fù)(分泌自體膠原蛋白和彈性蛋白)，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥等副作用。移植細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活，源源不斷產(chǎn)生膠原蛋白和彈性蛋白，使得效果長(zhǎng)久。
由于成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維以及基質(zhì)的糖胺多糖和糖蛋白。應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞，有廣泛的用途。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞的方法從9mm3小塊皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，純化后培養(yǎng)成纖維前體細(xì)胞使其分化為成纖維細(xì)胞、并增殖到4×107個(gè)，所制備的細(xì)胞為傳代次數(shù)不超過(guò)5次，處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞的方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌條件下，獲取受術(shù)者9mm3小塊皮膚組織；(2)采用機(jī)械解離細(xì)胞法從皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行植塊培養(yǎng)，步驟如下1)首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放人小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至似糊狀；2)加入3ml培養(yǎng)液到燒杯中，反復(fù)輕輕吹打片刻，離心800r/min，5min，去上清，剩下的組織小塊用于培養(yǎng)；3)用濕潤(rùn)的吸管小心吸取組織小塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；4)用玻棒將植塊排列好；5)加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以不使植塊浮出為準(zhǔn)；6)送入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置；7)在2天內(nèi)加入足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)采用差速脫壁處理方法純化成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，步驟如下1)吸去舊培養(yǎng)液；2)用PBS溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物2次，盡量洗去殘余血清，棄PBS溶液；3)給培養(yǎng)器皿內(nèi)加入3ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35℃條件下消化5min；4)以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；6)離心800r/min，5min，除去上清含酶溶液；7)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1-2×103個(gè)/ml；8)接種在1個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；9)送人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(4)使用特制的培養(yǎng)液促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在成熟的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35℃條件下消化6min，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底壁，離心800r/min，5min，除去上清含酶溶液，加入生理鹽水5ml，離心800r/min，5min，除去上清液，再加入生理鹽水5ml，離心800r/min，5min，除去上清液，將細(xì)胞沉淀用生理鹽水懸浮，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，即制成自體成纖維細(xì)胞懸浮液。
9mm3小塊皮膚組織取自受術(shù)者的自體的健康皮膚，不限定部位。
基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15％胎牛血清。
促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖的特制的培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰島素。
實(shí)施例2用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞的方法從15mm3小塊皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，純化后培養(yǎng)成纖維前體細(xì)胞使其分化為成纖維細(xì)胞、并增殖到6×107個(gè)，所制備的細(xì)胞為傳代次數(shù)不超過(guò)4次，處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞的方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌條件下，獲取受術(shù)者18mm3小塊皮膚組織；(2)采用機(jī)械解離細(xì)胞法從皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行植塊培養(yǎng)，步驟如下1)首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放人小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至似糊狀；2)加入3ml培養(yǎng)液到燒杯中，反復(fù)輕輕吹打片刻，離心1000r/min，4min，去上清，剩下的組織小塊用于培養(yǎng)；3)用濕潤(rùn)的吸管小心吸取組織小塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；4)用玻棒將植塊排列好；5)加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以不使植塊浮出為準(zhǔn)；6)送入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置；7)在3天內(nèi)加入足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)采用差速脫壁處理方法純化成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，步驟如下1)吸去舊培養(yǎng)液；2)用PBS溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物3次，盡量洗去殘余血清，棄PBS溶液；3)給培養(yǎng)器皿內(nèi)加入4ml的0.25％胰蛋白酶溶液于37℃條件下消化4min；4)以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；6)離心1000r/min，4min，除去上清含酶溶液；7)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1-2×103個(gè)/ml；8)接種在2個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；9)送人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(4)使用特制的培養(yǎng)液促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在成熟的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入4ml的0.25％胰蛋白酶溶液于37℃條件下消化5min，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底壁，離心1000r/min，4min，除去上清含酶溶液，加入生理鹽水5ml，離心1000r/min，4min，除去上清液，再加入生理鹽水5ml，離心1000r/min，4min，除去上清液，將細(xì)胞沉淀用生理鹽水懸浮，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，即制成自體成纖維細(xì)胞懸浮液。
18mm3小塊皮膚組織取自受術(shù)者的自體的健康皮膚，不限定部位。
基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10％胎牛血清。
促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖的特制的培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰島素。
實(shí)施例3用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞的方法從21mm3小塊皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，純化后培養(yǎng)成纖維前體細(xì)胞使其分化為成纖維細(xì)胞、并增殖到8×107個(gè)，所制備的細(xì)胞為傳代次數(shù)不超過(guò)3次，處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞的方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌條件下，獲取受術(shù)者21mm3小塊皮膚組織；(2)采用機(jī)械解離細(xì)胞法從皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行植塊培養(yǎng)，步驟如下1)首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放人小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至似糊狀；2)加入3ml培養(yǎng)液到燒杯中，反復(fù)輕輕吹打片刻，離心1200r/min，3min，去上清，剩下的組織小塊用于培養(yǎng)；3)用濕潤(rùn)的吸管小心吸取組織小塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；4)用玻棒將植塊排列好；5)加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以不使植塊浮出為準(zhǔn)；6)送入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置；7)在2天內(nèi)加入足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)采用差速脫壁處理方法純化成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，步驟如下1)吸去舊培養(yǎng)液；2)用PBS溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物4次，盡量洗去殘余血清，棄PBS溶液；3)給培養(yǎng)器皿內(nèi)加入5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于38℃條件下消化3min；4)以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；6)離心1200r/min，3min，除去上清含酶溶液；7)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1-2×103個(gè)/ml；8)接種在2個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；9)送人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(4)使用特制的培養(yǎng)液促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在成熟的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于38℃條件下消化3min，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底壁，離心1200r/min，3min，除去上清含酶溶液，加入生理鹽水5ml，離心1200r/min，3min，除去上清液，再加入生理鹽水5ml，離心1200r/min，3min，除去上清液，將細(xì)胞沉淀用生理鹽水懸浮，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，即制成自體成纖維細(xì)胞懸浮液。
21mm3小塊皮膚組織取自受術(shù)者的自體的健康皮膚，不限定部位。
基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10％胎牛血清。
促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖的特制的培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰島素。
細(xì)胞移植將上述制成的自體成纖維細(xì)胞懸浮液移植到尿道周圍組織、皺紋和疤痕處的皮膚真皮層內(nèi)后，在人體內(nèi)是一種自然生理性的修復(fù)(分泌自體膠原蛋白和彈性蛋白)，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥等副作用。移植細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活，源源不斷產(chǎn)生膠原蛋白和彈性蛋白，使得效果長(zhǎng)久。
權(quán)利要求
1.一種用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法從9mm3-21mm3小塊皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，純化后培養(yǎng)成纖維前體細(xì)胞使其分化為成纖維細(xì)胞、并增殖到4×107-8×107個(gè)，所制備的細(xì)胞為傳代次數(shù)不超過(guò)5次，處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞，制備細(xì)胞的方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌條件下，獲取受術(shù)者9mm3-21mm3小塊皮膚組織；(2)采用機(jī)械解離細(xì)胞法從皮膚組織中分離出成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行植塊培養(yǎng)，步驟如下1)首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放人小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至似糊狀；2)加入3ml培養(yǎng)液到燒杯中，反復(fù)輕輕吹打片刻，離心800～1200r/min，3～5min，去上清，剩下的組織小塊用于培養(yǎng)；3)用濕潤(rùn)的吸管小心吸取組織小塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；4)用玻棒將植塊排列好；5)加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以不使植塊浮出為準(zhǔn)；6)送入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置；7)在2～4天內(nèi)加入足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)采用差速脫壁處理方法純化成纖維前體細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，步驟如下1)吸去舊培養(yǎng)液；2)用PBS溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物2～4次，盡量洗去殘余血清，棄PBS溶液；3)給培養(yǎng)器皿內(nèi)加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃條件下消化3～5min；4)以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；6)離心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液；7)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1-2×103個(gè)/ml；8)接種在1-2個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；9)送人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(4)使用特制的培養(yǎng)液促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在成熟的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃條件下消化3～6min，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底壁，離心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液，加入生理鹽水5ml，離心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，再加入生理鹽水5ml，離心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，將細(xì)胞沉淀用生理鹽水懸浮，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，即制成自體成纖維細(xì)胞懸浮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于9mm3-21mm3小塊皮膚組織取自受術(shù)者的自體的健康皮膚，不限定部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10～15％胎牛血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于促使成纖維前體細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖的特制的培養(yǎng)液組成是在不可高壓滅菌MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15～30％胎牛血清、3.5g/L葡萄糖、50mg/L人胰島素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于收集的成纖維細(xì)胞是傳代次數(shù)為2～5次、處于功能活躍期的成熟成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明用皮膚成纖維前體細(xì)胞制備自體成纖維細(xì)胞的方法涉及的是一種關(guān)于應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)制備成纖維細(xì)胞的一種方法，產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞可用于細(xì)胞移植。屬于生物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。用細(xì)胞工程技術(shù)分離和純化皮膚成纖維前體細(xì)胞，制備自體成纖維細(xì)胞的方法從9mm
文檔編號(hào)C12N5/08GK1793341SQ200510095218
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者毛曦 申請(qǐng)人:毛曦