專利名稱：腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與重組人Tum－5融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域的基因克隆、基因重組、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)、目的蛋白的純化、腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與重組人Tum-5融合蛋白的體外活性測定及理化性質(zhì)鑒定等技術(shù)，涉及一種抗腫瘤藥物及其制備方法，特別涉及能夠特異性結(jié)合于腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與重組人Tum-5融合蛋白(Tum-5-NGR)及其制備方法。
背景技術(shù)：
導(dǎo)向肽NGR的應(yīng)用已在專利“腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與人α干擾素融合蛋白及制備”(專利號ZL 02139537.3)中有比較詳盡的介紹，這里就不再贅述。下面主要介紹腫瘤新生血管形成及Tumstatin和Tum-5的研究進(jìn)展。
1.1腫瘤血管生成與其生長轉(zhuǎn)移及其治療的關(guān)系血管生成angiogenesis即新生的血管形成是腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要條件。血管生成包括1).內(nèi)皮細(xì)胞向鄰近組織基質(zhì)內(nèi)浸潤；2).遷移；3).伸展；4).增生；5).內(nèi)皮細(xì)胞之間的相聯(lián)；6).血管腔的形成。人體內(nèi)正常的血管生成包括胚胎發(fā)育、器官形成、黃體形成和傷口愈合等，而異常的血管生成則主要見于慢性炎癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡性腫瘤等。如血管生成過程中一個或數(shù)個環(huán)節(jié)被抑制，血管生成就會中斷。血管生成的病理生理過程受誘導(dǎo)劑和抑制劑的調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)劑主要為各種生長因子和炎性物質(zhì)等，它能夠刺激新的血管生成，而抑制劑指各種抗血管生成的物質(zhì)或制劑具有對抗血管生成的活性。20世紀(jì)70年代初，F(xiàn)olkman提出了“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”這一理論。腫瘤一旦發(fā)生瘤細(xì)胞數(shù)量的增加必須依賴腫瘤血管的形成隨后的研究支持該理論，自此抑制腫瘤血管生長就成為了一種新的腫瘤治療策略，而被廣泛重視。
1.1.1腫瘤血管的生成1.1.1.1腫瘤血管形成機(jī)制血管形成的多環(huán)節(jié)涉及內(nèi)皮細(xì)胞、外膜細(xì)胞、可溶性血管生長因子以及不溶性細(xì)胞外基質(zhì)成分等。腫瘤血管形成首先始于圍繞在已經(jīng)存在的毛細(xì)血管后靜脈周圍的基底膜溶解，這是腫瘤產(chǎn)生的膠原酶或其他金屬蛋白酶、血漿酶原激活物以及血管滲透因子作用的結(jié)果。腫瘤血管形成的第二階段是不處于有絲分裂期的內(nèi)皮細(xì)胞移出血管，向腫瘤遷移。盡管內(nèi)皮細(xì)胞沒有有絲分裂，但內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是新生血管形成的先決條件。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移可引起毛細(xì)血管伸長，伸長的內(nèi)皮細(xì)胞最終溝通成管形成新的血管腔這些未成熟的血管進(jìn)一步形成血管分支和血管網(wǎng)。當(dāng)管周基底膜成分的沉積和管周起支持作用的外膜細(xì)胞形成后，成熟的毛細(xì)血管網(wǎng)才真正形成?？扇苄约?xì)胞因子、內(nèi)皮細(xì)胞、活化基質(zhì)蛋白酶整和素在血管生成中都起到很重要的作用。
①.可溶性細(xì)胞因子常見的血管生長因子包括酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(a-FGF、b-FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)、血管調(diào)理素、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、血管滲透因子(VPF)、濾泡性星狀衍化因子(FSDGF)血管生成素、低分子非肽類血管生長因子等，這些血管生長因子在腫瘤血管形成的不同階段以不同的方式調(diào)節(jié)著血管形成。
②.內(nèi)皮細(xì)胞活化血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖逐漸形成管腔結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮功能。成年人，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖幾乎停止，僅在外傷或疾病如腫瘤時成為體內(nèi)許多因子和基質(zhì)成分作用的對象，增殖才相對活躍。抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖已經(jīng)成為抗腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的研究途徑之一。針對內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的研究較多而較為成功的是TNP-470，它是從煙曲霉菌中提取的一種化合物，有較強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用，通過與一些高親和性的分子相結(jié)合，阻止DNA合成，直接或間接導(dǎo)致增殖的上皮細(xì)胞停留在G0或G1期，使G2或M期細(xì)胞顯著減少。生長因子依賴細(xì)胞或含有生長因子受體的細(xì)胞對TNP-470較為敏感，小劑量出現(xiàn)細(xì)胞抑制，較大劑量時有細(xì)胞毒性作用。
③.基質(zhì)蛋白酶的作用基質(zhì)在腫瘤血管形成過程中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞分泌許多基質(zhì)蛋白酶，內(nèi)皮細(xì)胞在血管生長因子刺激下，在增殖的同時，也分泌一些蛋白酶降解基底膜，以利于腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、浸潤和血管的形成?；|(zhì)蛋白酶大部分都含有一個金屬離子結(jié)合區(qū)又稱金屬蛋白酶(MMP)，以無活性的形式存在于組織中，在腫瘤浸潤和血管形成時可被激活，基質(zhì)降解產(chǎn)物如層粘蛋白也可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
④.整合素的作用整合素家族成員為一類跨膜異源二聚體糖蛋白受體，電鏡下呈位于細(xì)胞膜表面的球莖形結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附及相互作用。在血管發(fā)生過程中，整和素表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與多種ECM分子如纖粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、層粘連蛋白、血纖維蛋白、膠原蛋白I型和IV型、降解的膠原、von Willebrand因子間的粘附反應(yīng)，每種粘附反應(yīng)又可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移增殖和分化。另外組織間粘附分子組成的差異，決定了血管發(fā)生的組織差異。αvβ3整和素是一種可以識別含RGD三肽序列的ECM分子，但αvβ3也可以以非RGD依賴的形式結(jié)合于金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)，并將活性狀態(tài)的MMP-2定位于新發(fā)生的血管細(xì)胞表面，這就使得新發(fā)生的血管的內(nèi)皮細(xì)胞在伸展過程中能夠降解、改建ECM。天然狀態(tài)的含RGD的膠原不能與αvβ3連接，只有當(dāng)MMP對膠原進(jìn)行酶解后，這些RGD位點才能與αvβ3連接。
1.1.1.2腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療失敗的主要原因，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一復(fù)雜的多階段過程，可以概括為原發(fā)瘤增殖、腫瘤新生血管生長；瘤細(xì)胞侵襲基底膜；穿入血管或淋巴管；在循環(huán)系統(tǒng)中存活，形成瘤栓并轉(zhuǎn)運到遠(yuǎn)隔靶器官；滯留于靶器官的微小血管中；穿出血管并形成微小轉(zhuǎn)移灶；腫瘤血管形成，轉(zhuǎn)移癌灶增殖?？梢娫谀[瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的多步驟過程中，無論腫瘤轉(zhuǎn)移的起始或終末階段，血管生成均發(fā)揮著重要作用。
1.1.1.3腫瘤治療與血管生成腫瘤的生長依賴于血管的新生，因此，抑制腫瘤血管的生成已經(jīng)成為一種腫瘤治療的策略。傳統(tǒng)治療腫瘤的方法主要是針對腫瘤細(xì)胞的治療，如手術(shù)切除腫瘤、化療、放療及免疫生物治療等。但是在臨床上療效卻不能完全令人滿意如穿透腫瘤能力的有限性、靶細(xì)胞種類的局限性、引起副作用的毒性等；而且由于腫瘤細(xì)胞種類繁多，易發(fā)生變異和突變。所以，針對腫瘤細(xì)胞的治療方法所面臨的最主要的問題就是，大多數(shù)腫瘤經(jīng)過一段時間的化療或放療后都將產(chǎn)生不同程度的耐藥性。腫瘤產(chǎn)生耐藥性是目前所用的放射免疫以及化學(xué)療法面臨的嚴(yán)重問題，抗藥性的出現(xiàn)部分原因是遺傳不穩(wěn)定性、異性生殖和腫瘤細(xì)胞的高突變率。相比較而言，內(nèi)皮細(xì)胞遺傳穩(wěn)定、同源突變率低，抗血管生成療法直接針對腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞對這種療法的抗藥性很小甚至沒有抗藥性。無論何種腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移均呈嚴(yán)格的血管形成依賴性，即需要血管新生以輸送營養(yǎng)及生長因子。血管生成抑制劑直接作用于運動的及增殖的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，故特異的血管生成抑制劑不太可能造成骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)或脫發(fā)等傳統(tǒng)化療藥物造成的毒副反應(yīng)。因此，針對血管內(nèi)皮細(xì)胞來治療腫瘤效果穩(wěn)定，對多種腫瘤都有抑瘤作用。
1.1.1.4腫瘤血管生成抑制劑的研究策略以血管生成的各個環(huán)節(jié)及其發(fā)生過程中的系列化改變?yōu)榘悬c，研制血管生成抑制劑，控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，將成為腫瘤防治的一個重要途徑。血管生成抑制劑的研究主要有幾種策略1).內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑CAI；2).內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制劑TNP470、煙曲霉素(fumagillin)、酞胺哌啶酮(thalidomide)、白介素12(IL12)；3).基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)；4).膠原酶抑制劑(Col-3)；5).促血管生成因子抑制劑VEGF抗體、bFGF抗體PF-4；6).αvβ3整和素抑制劑抗αvβ3的單克隆抗體LM609(vitaxin)；7).內(nèi)源性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子Angiostatin、Endostatin、Tumstatin、Canstatin。
1.2Tumstatin和Tum-5Tumstatin是2000年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子，與較早發(fā)現(xiàn)的Endostatin相類似。Tumstatin也來源于膠原，但具有比Endostatin更強(qiáng)的抗血管生成作用，并且用量也明顯減低。另外，它還具有其他內(nèi)源性抑制因子所沒有的，直接作用于腫瘤細(xì)胞引起腫瘤細(xì)胞凋亡的特性。因此，它將成為一種潛在的治療腫瘤和其他血管異常增生性疾病的藥物。
1.2.1Tumstatin的發(fā)現(xiàn)1994年，Monboisse等發(fā)現(xiàn)牛晶狀體來源的膠原IVα3鏈的非膠原區(qū)域1[α3(IV)NC1]185-203氨基酸功能肽，能夠抑制多型核白血病細(xì)胞活化，從而阻斷I型膠原誘導(dǎo)的多形核白血病的發(fā)生。1997年，Han進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該肽能夠提高黑素瘤細(xì)胞的黏附能力并抑制其增殖。2000年，Petitelerc等用重組的α3(IV)NC1進(jìn)行體內(nèi)體外實驗，證明了該蛋白質(zhì)能抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管形成，進(jìn)而抑制腫瘤生長，因此，將此蛋白命名為Tumstatin。
1.2.2Tumstatin的結(jié)構(gòu)及分布血管基底膜是一薄層細(xì)胞外基質(zhì)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞生長的支持物。IV型膠原是組成血管基底膜的主要大分子物質(zhì)，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生中起重要作用。IV型膠原是由6條α鏈(α1-α6)形成的三聚體，并近一步形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而為其他基底膜大分子物質(zhì)提供蛋白質(zhì)支架。IV型膠原的α鏈由三個結(jié)構(gòu)域組成N末端的7S結(jié)構(gòu)域；三螺旋體結(jié)構(gòu)域；C末端的非膠原結(jié)構(gòu)域1(NC1)。IV型膠原蛋白α鏈的6種同工體的非膠原區(qū)域均普遍存在不同程度的抑制腫瘤血管生成的作用，其中以α3(IV)NC1的作用最強(qiáng)。
Tumstatin是由IV型膠原α3鏈中間的三螺旋體結(jié)構(gòu)域C端的12個氨基酸和非膠原結(jié)構(gòu)域1(NC1)非膠原蛋白1功能區(qū)共244個氨基酸組成，相對分子量28kD，編碼核苷酸序列為738bp。Tumstatin的分布具有組織和器官特異性。它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在胚胎存在于腎臟和肺，在成人見于腎臟、骨骼肌纖維和肺；少量見于晶狀體囊、耳蝸、卵巢、睪丸的基底膜，主動脈血管基底膜內(nèi)含量很少，成人的腦、心臟和肝臟中均不存在。
1.2.3Tumstatin的生物學(xué)活性
1.2.3.1抑制血管生成Tumstatin抑制內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤血管的生成受到抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。其分子機(jī)制為Tumstatin可以經(jīng)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的αvβ3整合素結(jié)合，進(jìn)而抑制FAK、PI3K、PKB/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，降低了mTOR活性，進(jìn)而降低了真核起始因子4E的磷酸化，使在翻譯過程中真核起始因子蛋白4E無法與4E結(jié)合蛋白解離，導(dǎo)致帽依賴性翻譯受到抑制，最終內(nèi)皮細(xì)胞蛋白合成受到抑制，抑制血管的新生。Tumstatin的這種抑制血管生成的作用只存在于病理的過程，而對于生理過程的血管新生，并沒有抑制作用。
1.2.3.2抗腫瘤特性Tumstatin直接抑制腫瘤細(xì)胞增生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能位點是靠近C端的185-203位氨基酸組成的19肽，此19肽可直接抑制黑色素瘤細(xì)胞和其他上皮腫瘤細(xì)胞以及多形核白細(xì)胞的生長，它與整合素αvβ3/CD47復(fù)合體結(jié)合后，引起不同細(xì)胞粘附、趨化以及增生的抑制。但這19肽與細(xì)胞之間的作用不依賴于CD47。在CD47不存在的情況下，也可直接激活FAK、PI3K來抑制黑色素瘤細(xì)胞和纖維瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。有研究認(rèn)為，抑制黑色素瘤細(xì)胞的作用可能與位于序列中189-191的-SNS-有關(guān)，此序列的空間結(jié)構(gòu)是位于兩個β片層之間的轉(zhuǎn)角，是黑色素瘤細(xì)胞粘附和增生所必需的。在保持-SNS-的空間結(jié)構(gòu)不變的條件下，縮簡19肽的長度，其抗黑色素瘤細(xì)胞生長的活性不發(fā)生改變。
1.2.4Tumstatin的作用機(jī)制Tumstatin并不改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平，而在整體水平上抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，該作用是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)Tumstatin蛋白的54-132位氨基酸能夠以非RGD依賴方式結(jié)合αvβ3整和素。當(dāng)使用αvβ3整和素抗體時能阻斷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與Tumstatin附著91％以上，因此，Tumstatin是以非RGD序列結(jié)合αvβ3整和素，再通過抑制FAK活性途徑、通過抑制PI3激酶活性途徑、以及通過抑制PKB/Akt激酶活性和mTOR活性途徑，最終通過阻斷真核翻譯起始因子(elF4E)和它的結(jié)合蛋白的解離來介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的mRNA帽子依賴性的蛋白質(zhì)合成(cap-dependent translation)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤的血管新生進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
1.2.5Tum-5的結(jié)構(gòu)與功能1.2.5.1Tum-5的結(jié)構(gòu)Tum-5由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸組成的，該區(qū)域是Tumstatin的抗血管生成活性區(qū)域。研究證實Tum-5與全長的Tumstatin具有同等的抗血管生成效能。Tum-5的序列中含有5個半胱氨基酸，但Tum-5的活性依賴于其一級結(jié)構(gòu)，改變Tum-5的二級結(jié)構(gòu)或者對其進(jìn)行烷基化均不影響其抗血管生成活性。
1.2.5.2Tum-5的功能Tum-5可以特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤血管的生成受到抑制，抑制腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。Tum-5的抗腫瘤血管生成作用要比先前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮抑素Endostatin強(qiáng)10倍，并呈劑量依賴關(guān)系?？梢种企w外培養(yǎng)的牛肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(C-PAE)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的形成。當(dāng)Tum-5劑量為1μg/ml時，內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成幾乎完全被抑制，同時還可有效的引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。另外，Tumstatin為肺-腎出血綜合征(Goodpasture)的自身抗原，可能對腎、肺和機(jī)體的其他器官造成一定的損害。Tumstatin的抗原表位位于N端的1-40個氨基酸，而這段序列沒有抗腫瘤作用。Tum-5去除了這段序列，這樣可降低其引起肺-腎出血綜合征的副作用，卻不影響Tum-5本身的抗腫瘤活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種能夠特異性結(jié)合于腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與重組人Tum-5融合蛋白(Tum-5-NGR)及其制備方法。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提高重組人Tum-5的抗腫瘤活性，同時降低毒副作用，減少用藥量。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種Tum-5融合蛋白，其特征在于，依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到Tum-5融合蛋白。
一種腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白，其特征在于，選擇腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因，構(gòu)建腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因的融合基因，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到Tum-5-NGR融合蛋白。
本發(fā)明還涉及上述腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明的Tum-5融合蛋白、Tum-5-NGR融合蛋白分別能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高效表達(dá)的氨肽酶N(CD13)結(jié)合。其在大腸桿菌中獲得表達(dá)量可占菌體總蛋白的40％，在此基礎(chǔ)上，利用Ni-NAT resin柱親和層析成功純化Tum-5-NGR，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純化后融合蛋白的純度達(dá)90％以上。體外EVC304細(xì)胞殺傷實驗證實Tum-NGR能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性。小管形成抑制實驗中Tum-5-NGR也顯示出明確的抑制作用。在昆明種小鼠體內(nèi)接種瘤細(xì)胞S180，建立腫瘤模型，結(jié)果表明當(dāng)劑量為1mg/kg時，Tum-5-NGR的抑瘤效果優(yōu)于Tum-5，抑瘤率分別為37.78％和26.83％，與對照組相比，均有明顯差異(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，與Tum-5相比，Tum-5-NGR能更好的在腫瘤新生血管處富集。


圖1是pQE-T的測序結(jié)果圖；圖2是pQE-TN的測序結(jié)果圖；圖3是pQE-T、pQE-TN的誘導(dǎo)表達(dá)圖；其中標(biāo)號表示1.分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(從上至下分子量依次為94000/66000Da；43000Da；31000Da，21000Da，14400Da)；2.pQE-TN誘導(dǎo)表達(dá)前；3.pQE-TN誘導(dǎo)表達(dá)后；4.pQE-T誘導(dǎo)表達(dá)前；5.pQE-T誘導(dǎo)表達(dá)后。
圖4是Tum-5的純化效果圖；其中標(biāo)號表示1、低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2、Tum-5 25mmol/L咪唑洗脫；3、Tum-5 100mmol/L咪唑洗脫；4、Tum-5 250mmol/L咪唑洗脫；圖5是um-5-NGR的純化效果圖；1.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2.Tum-5-NGR 25mmol/L咪唑洗脫；3.Tum-5-NGR 100mmol/L咪唑洗脫；4.Tum-5-NGR 250mmol/L咪唑洗脫。
圖6是Tum-5和Tum-5-NGR內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制實驗直方圖；圖7是Tum-5和Tum-5-NGR對內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的影響，其中A陰性對照，B、C、DTum-5組，20μg/ml(B)、5μg/ml(C)、1μg/ml(D)，E、F、GTum-5-NGR組，20μg/ml(E)、5μg/ml(F)、1μg/ml(G)；圖8是Tum-5和Tum-5-NGR對小鼠移植瘤S180的抑制率直方圖；圖9是Tum-5和Tum-5-NGR體內(nèi)分布結(jié)果。其中圖A、D、G、J分別是陰性對照組的肝、脾、腎和腫瘤組織切片；圖B、E、H、K分別是Tum-5-NGR組的肝、脾、腎和腫瘤組織切片；圖C、F、I、L分別是Tum-5組的肝、脾、腎和腫瘤組織切片。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
具體實施例方式
1.Tum-5和Tum-5-NGR His融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建1.1Tum-5His融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子(有利于目的蛋白在大腸桿菌的高效表達(dá))，交由上海博亞生物技術(shù)有限公司全基因合成，上游引入SphI酶切位點，下游引入HindIII酶切位點，并將目的基因克隆入載體pMD-18T中，命名為pMD-18T-Tum-5。
將pMD-18T-Tum-5用SphI和HindIII雙酶切后，回收小片段；將質(zhì)粒pQE30(Qiagen公司產(chǎn)品)用SphI和BamH1雙酶切后，回收大片段。以上兩個片段用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，應(yīng)用藍(lán)白斑篩選方法，挑取白色克隆，培養(yǎng)過夜，經(jīng)酶切鑒定，證實獲得插入片段大小正確的表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列測定，證實其序列與理論值相符。將測序正確的質(zhì)粒命名為pQE30-Tum-5，簡稱pQE-TN。
1.2Tum-5-NGR His融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子(有利于目的蛋白在大腸桿菌的高效表達(dá))；同時設(shè)計編碼NGR多肽的寡核苷酸序列，并將該序列連于Tum-5基因的3’端，為方便克隆，兩者之間加入BamHI的酶切位點(ggatcc)。將該序列交由上海博亞生物技術(shù)有限公司全基因合成，并上游引入SphI酶切位點，下游引入HindIII酶切位點，然后將目的基因克隆入載體pMD-18T中，命名為pMD-18T-Tum-5-NGR。將pMD-18T-Tum-5-NGR用SphI和HindIII雙酶切后，回收小片段；將質(zhì)粒pQE30-30用SphI和HindIII雙酶切后，回收大片段。以上兩個片段用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，應(yīng)用藍(lán)白斑篩選方法，挑取白色克隆，培養(yǎng)過夜，經(jīng)酶切鑒定，證實獲得插入片段大小正確的表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列測定，證實其序列與理論值相符。將測序正確的質(zhì)粒命名為pQE30-Tum-5-NGR，簡稱pQE-TN。
1.3pQE30-Tum-5和pQE30-Tum-5-NGR的誘導(dǎo)表達(dá)正確重組的pQE30-Tum-5/DH5α工程菌和pQE30-Tum-5-NGR/DH5α工程菌，37℃活化振搖培養(yǎng)過夜，次日晨以1∶100比例接種LB(含100μg/ml氨芐)培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入IPTG(1mmol/L)，誘導(dǎo)4h。3000rpm離心15min收菌。
1.4Tricine-SDS-PAGE各取500μL的pQE-T/DH5α和pQE-TN/DH5α誘導(dǎo)或未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心取沉淀，加入30μL水及30μL 2×載樣緩沖液混勻，沸水中煮5min，12000prm離心5min，取10μL上清加樣于15％分離膠6％濃縮膠，上樣后電壓為55V約1h，樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至70V約4h，用0.5％考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2-3h，脫色直至背景清晰后制備干膠保存。
1.5免疫印跡反應(yīng)Tricine-SDS-PAGE結(jié)束后，凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維膜(NC膜)靠近陽極一側(cè)，轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol/L Tris、192mmol/L Glycine、20％甲醇)，100V恒壓1h，將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，用洗滌液TBST(含0.02mol/L pH7.4TBS、0.4％ Tween20)室溫洗3次，浸入封閉液(含2％BSA的TBST)中37℃ 2h，洗滌液(TBST)室溫洗3次，加鼠抗His單抗，37℃孵育1h，TBST室溫洗膜3次，加入兔抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h，TBST室溫洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸鎦水沖洗終止反應(yīng)。
1.6.表達(dá)產(chǎn)物的純化按1克菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌。12000rpm，離心15m，棄上清，1克沉淀加10ml A液[8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(PH8.0)]。4℃攪拌1h，12000rpm，離心15min，收集上清，將其上于用A液充分平衡的Ni柱，然后先用含25mmol咪唑的A液洗脫雜蛋白，再用含250mmol咪唑的A液洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，部分純化產(chǎn)物透析至B液[2.5M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(PH8.0)]復(fù)性，終濃度1mg/ml，進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實驗。部分純化產(chǎn)物透析至純水中，凍干后進(jìn)行體外活性測定。
2. 體外活性測定2.1內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制實驗于96孔培養(yǎng)板中每孔加100μl含500個EVC304細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液(含5％FCS)，置于37℃，5ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl含不同濃度Tum-5和Tum-5-NGR的DMEM培養(yǎng)液(含20％FCS)，然后在37℃，5ml/L CO2條件下，孵育36-48h。在培養(yǎng)板中加入20μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h。棄上清，每孔加入100μl DMSO至完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定波長490nm的A值，并計算抑制率。
抑制率(％)＝[(A空白對照-A實驗組)/A空白對照]×100％2.2對內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的影響用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel(1∶1)，將Matrigel液鋪于96孔板中，每孔100ul，待聚合后，加入含不同濃度Tum-5和Tum-5-NGR的細(xì)胞懸液(5×105/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)8h，觀察兩種蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞小管形態(tài)狀態(tài)的影響，并照相。
3.體內(nèi)抑瘤實驗3.1材料動物昆明種小鼠，體重18-22g，雌性，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。
藥品Tum-5和Tum-5-NGR為受試藥物，受試藥用2.5mol/L尿素溶液稀釋。陽性對照組為注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品)，陰性對照組為注射用生理鹽水。
實驗瘤株小鼠S180腫瘤細(xì)胞株，蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。
3.2接種昆明小鼠，腹腔接種S180腫瘤細(xì)胞后7天時，無菌條件下，用5ml的7號針頭注射器抽取腹水，加入10ml離心管內(nèi)，加適量的生理鹽水(NS)，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，傾出上清，按一定比例加入NS制成瘤細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2.5×106/ml)，接種于昆明種小鼠右前腋窩皮下，每只小鼠注射0.2ml，即5×105細(xì)胞/鼠。
3.3分組實驗第1天，動物接種腫瘤細(xì)胞。第2天，動物稱重，隨機(jī)分為四組，即導(dǎo)向性Tum-5(Tum-5-NGR)實驗組、Tum-5實驗組、環(huán)磷酰胺(CTX)20mg/kg陽性對照組和生理鹽水組。除生理鹽水組為每組20只小鼠外，其他各組均為12只。
3.4給藥分組當(dāng)天開始給藥。CTX隔日一次腹腔注射，受試藥物每日2次腹腔注射，間隔8h。共給藥9天。末次給藥后1h時摘眼球取血，離心，取血清，-30℃保存。剝?nèi)∑は铝鰤K、肝、腎和脾臟，稱瘤重，計算受試組的抑瘤率(IR)。然后，立即將瘤塊和組織切為兩塊，一塊置-30℃保存?zhèn)溆?；一塊置4％甲醛溶液中固定，石蠟包埋后，制備病理切片，以備免疫組化檢測。
3.5實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)以x±s表示，顯著性采用雙側(cè)Student’s t檢驗。
3.6體內(nèi)分布實驗3.6.1材料處理荷瘤小鼠靜脈注射Tum-5或Tum-5-NGR各1mg/kg，給藥后30min時眼眶靜脈放血處死后，立即取0.3cm厚的瘤組織塊，在固定液(10％中性福爾馬林，50mmol/L PBS，pH7.2)中4℃固定3~6h，置于溶液(5％蔗糖，50mmol/L PBS，pH7.2)中4℃過夜，冷50％丙酮脫水，置于純丙酮脫水2次，二甲苯透明，浸蠟，石蠟(54-56℃)包埋，切片，37℃烤箱烤干，進(jìn)行鼠抗His單克隆抗體的免疫組化染色。從取材到包埋時間＜36h。
3.6.2免疫組化染色按SP試劑盒所示步驟并加以改進(jìn)進(jìn)行免疫組化染色腫瘤組織切片脫蠟至水，經(jīng)10ml/L H2O2封閉內(nèi)源酶，室溫30min，pH7.2；3M尿素消化暴露抗原部位，室溫30min；PBS振洗3次，每次5min；98℃微波爐修復(fù)抗原10min冷卻至室溫，修復(fù)液為0.01M的檸檬酸緩沖液(pH6.0)；PBS振洗3次，每次5min；滴加10％非免疫動物血清，室溫下孵育5min，吸掉；滴加鼠抗His單克隆抗體后4℃冰箱放置過夜；37℃孵育60min；0.01M的PBS振洗3次，每次5min；滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；DAB-H2O2顯色5min，蘇木精襯染，脫水透明，中性樹膠封固。
本發(fā)明的技術(shù)效果是1)構(gòu)建了重組人Tum-5的原核融合表達(dá)載體pQE-T，DNA序列測定證實完全正確(參見圖1)。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，其表達(dá)產(chǎn)物可占總蛋白的40％以上(參見圖3)。
2)通過分步克隆法，將人工合成的編碼NGR的寡核苷酸片段與重組人Tum-5的3’端連接，構(gòu)建了Tum-5-NGR融合基因的原核融合表達(dá)載體pQE-TN，DNA序列測定證實完全正確(參見圖2)。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其表達(dá)產(chǎn)物可占總蛋白的40％以上(參見圖3)。
3)純化了Tum-5和Tum-5-NGR融合蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳和HPLC檢測均證實，兩種蛋白的純度均大于90％(參見圖4和圖5)。
4)體外EVC304細(xì)胞殺傷實驗證實Tum-5和Tum-NGR-C均能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性；而且，各劑量組的Tum-5抑制效果優(yōu)于Tum-5-NGR。(參見圖6)。
5)小管形成抑制實驗中，不同濃度的Tum-5和Tum-5-NGR均能明顯地抑制EVC304細(xì)胞在Matrigel上形成三維的管狀結(jié)構(gòu)(參見圖7)。
6)對移植瘤治療作用研究的結(jié)果表明，在昆明種小鼠體內(nèi)接種瘤細(xì)胞S180，建立腫瘤模型，當(dāng)藥物劑量為1mg/kg時，Tum-5-NGR的抑瘤效果優(yōu)于Tum-5，抑瘤率分別為37.78％和26.83％，與對照組相比，均有明顯差異(P＜0.01＝(參見表1和圖8)。
7)對荷瘤小鼠腫瘤血管靶向性研究的結(jié)果中，免疫組化結(jié)果顯示，注射藥物30min后，與陰性對照組相比，Tum-5除了脾臟外，在肝、腎和腫瘤組織中有少量分布；而Tum-5-NGR在腫瘤組織中大量富集，陽性免疫產(chǎn)物主要聚集在血管及其周圍組織(參見圖9)。
表1Tum-5和Tum-5-NGR對小鼠移植瘤S180的抑制作用

*代表P＜0.05，**代表P＜0.01注T為Tum-5，N為Tum-5-NGR。
Tum-5融合蛋白核苷酸序列和它對應(yīng)的氨基酸序列g(shù)gt ttt tct ttt ctg ttt gta caa ggt aac cag cgt gct cac ggt cag 48Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln1 5 10 15gac ctg ggt act ctg ggc agc tgc ctg cag cgt ttt acc act atg ccg 96Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro20 25 30ttc ctg ttc tgc aac gtt aac gat gta tgc aac ttt gca tct cgt aac 144Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn35 40 45gat tac tct tac tgg ctg tct act ccg gct ctg atg ccg atg aac atg 192Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met50 55 60gct ccg att act ggc aga gct ctg gag ccg tac atc agc aga tgc act 240Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr65 70 75 80gtt tgc gaa ggt ccg gcg atc gct 264Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala85
Tum-5-NGR融合蛋白核苷酸序列和它對應(yīng)的氨基酸序列g(shù)gt ttt tct ttt ctg ttt gta caa ggt aac cag cgt gct cac ggt cag 48Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln1 5 10 15gac ctg ggt act ctg ggc agc tgc ctg cag cgt ttt acc act atg ccg 96Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro20 25 30ttc ctg ttc tgc aac gtt aac gat gta tgc aac ttt gca tct cgt aac 144Phe Leu Phe Cys Ash Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn35 40 45gat tac tct tac tgg ctg tct act ccg gct ctg atg ccg atg aac atg 192Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met50 55 60gct ccg att act ggc aga gct ctg gag ccg tac atc agc aga tgc act 240Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr65 70 75 80gtt tgc gaa ggt ccg gcg atc gct gga tcc tgc aac ggt cgt tgc gtg 288Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala Gly Ser Cys Asn Gly Arg Cys Val85 90 95agc ggt tgc gcg ggt cgt tgc 309Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys100
權(quán)利要求
1.一種Tum-5融合蛋白，其特征在于，依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到Tum-5融合蛋白。
2.一種腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白，其特征在于，選擇腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因，構(gòu)建腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因的融合基因，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到Tum-5-NGR融合蛋白。
3.一種腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白的制備方法，其特征在于，按以下步驟制備1)Tum-5和Tum-5-NGR的His融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建①依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子，上游引入SphI酶切位點，下游引入HindIII酶切位點，并將目的基因克隆入載體pMD-18T中，命名為pMD-18T-Tum-5；將pMD-18T-Tum-5用SphI和HindIII雙酶切后，回收小片段；將質(zhì)粒pQE-30用SphI和BamH1雙酶切后，回收大片段；以上兩個片段用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，應(yīng)用藍(lán)白斑篩選方法，挑取白色克隆，培養(yǎng)過夜，經(jīng)酶切鑒定，證實獲得插入片段大小正確的表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列測定證實其序列，并將測序正確的質(zhì)粒命名為pQE-30-Tum-5；②依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，將編碼Tum-5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子；同時設(shè)計編碼NGR多肽的寡核苷酸序列，并將該序列連于Tum-5基因的3’端，兩者之間加入BamHI的酶切位點ggatcc，進(jìn)行全基因合成，并在上游引入SphI酶切位點，下游引入HindIII酶切位點，然后將目的基因克隆入載體pMD-18T中，命名為pMD-18T-Tum-5-NGR；將pMD-18T-Tum-5-NGR用SphI和HindIII雙酶切后，回收小片段；將質(zhì)粒pQE-30用SphI和HindIII雙酶切后，回收大片段；以上兩個片段用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，應(yīng)用藍(lán)白斑篩選方法，挑取白色克隆，培養(yǎng)過夜，經(jīng)酶切鑒定，證實獲得插入片段大小正確的表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列測定證實其序列；并將測序正確的質(zhì)粒命名為pQE-30-Tum-5-NGR；2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pQE-30-Tum-5和pQE-30-Tum-5-NGR轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，隨機(jī)挑選單克隆菌，于LB中37℃活化振搖培養(yǎng)過夜，次日晨以1∶100比例接種LB培養(yǎng)基，其中LB培養(yǎng)基含Amp 100μg/ml，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至0D650nm＝0.6時，加入終濃度為0.1mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，3000rpm離心15min收集菌體，行SDS-PAGE及Western Blot，對SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)行用薄層掃描以測定目的蛋白的表達(dá)量；3)重組蛋白的純化按1克菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌；12000rpm，離心15min，棄上清，1克沉淀加10ml A液，其配方為8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris；PH 8.0，4℃攪拌1h，12000rpm，離心15min，收集上清，將其上于用A液充分平衡的Ni柱，然后先用含25mmol咪唑的A液洗脫雜蛋白，再用含250mmol咪唑的A液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，部分純化產(chǎn)物透析至B液中復(fù)性，B液為2.5M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris組成，PH值為8.0，調(diào)整復(fù)性蛋白的終濃度為1mg/ml，部分純化產(chǎn)物透析至純水中，即可得到腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述DH5α細(xì)胞含有編碼腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白的基因的原核表達(dá)載體pQE-TN。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核表達(dá)載體pQE-TN中含有編碼腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白的基因，該載體經(jīng)37℃振蕩培養(yǎng)過夜、活化后，經(jīng)0.1mMIPTG誘導(dǎo)，可高效表達(dá)腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與重組人Tum-5融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與人Tum－5的融合蛋白及制備方法，腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽－CNGRCVSGCAGRC－分別能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高效表達(dá)的氨肽酶N(CD13)結(jié)合。本發(fā)明采用分步克隆，構(gòu)建腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽與Tum－5的融合基因，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)。通過多肽與其新生血管處的受體結(jié)合，使Tum－5在腫瘤組織的新生血管處富集，發(fā)揮抗腫瘤和抑制腫瘤血管形成的作用。同時，本發(fā)明還公開了人Tum－5的制備方法，Tum－5是由Tumstatin接近N端的54－132位氨基酸組成的，它是Tumstatin抗血管形成的功能結(jié)構(gòu)域。采用采用GenBank中公布的人Tum－5基因序列，將編碼Tum－5氨基酸的密碼子替換為大腸桿菌慣用的密碼子，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng)純化后得到Tum－5融合蛋白。
文檔編號C12N15/09GK1800218SQ200510096389
公開日2006年7月12日 申請日期2005年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月21日
發(fā)明者孟潔如, 馬楠, 顏真, 張英起 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)