專利名稱：與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一個與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其編碼基因與其在制備與有絲分裂原激活蛋白激酶p38信號通路相關(guān)疾病的治療性藥物中的應用。
背景技術(shù)：
研究表明細胞信號異常與人類疾病密切相關(guān)(Mora-Garcia P，Sakamoto KM.Cell signaling defects and human disease.Mol Genet Metab 1999；66(3)143-71.)。在信號轉(zhuǎn)導過程中起關(guān)鍵作用的蛋白激酶是目前最重要的疾病治療靶標之一(Cohen P.Protein kinases-the major drug targets of the twenty-firstcentury.Nature Reviews Drug Discovery.2002；1(4)309-15.)。真核細胞的有絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)超家族包括ERK1/2、JNK1/2/3、p38α/β/γ/δ、ERK4/5及ERK5/BMK1，它們負責將各種胞外刺激信號傳遞至胞核，從而調(diào)控基因表達(Johnson G L and Lapadat R.Mitogen-ActivatedProtein Kinase Pathways Mediated by ERK，JNK，and p38 Protein Kinases.Science.2002；298(5600)1911-2，Enslen H，Davi s RJ.Regulation of MAP kinases bydocking domains.Biol Cell.2001；93(1-2)5-14.)。其中，有絲分裂原激活蛋白激酶p38(p38 NAPK)參與炎癥、應急、發(fā)育、細胞生長與凋亡、細胞周期調(diào)控、缺血/再灌損傷及心肌肥厚等生理、病理過程中的信號傳導(Herlaar E，Brown Z.p38MAPK signalling cascades in inflammatory disease.Mol Med Today.1999；5(10)439-47，Ambrosino C，Nebreda AR.Cell cycle regulation by p38 MAP kinases.Biol Cell 2001；93(1-2)47-51，Takeda K，Ichijo H.Neuronal p38 signallingan emerging regulator of cell fate and function in the nervous system.GenesCells 2002；7(11)1099-111，Bulavin DV，Higashimoto Y，Popoff IJ，et al.Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38kinase.Nature.2001；411(6833)102-7)。抑制p38激酶活性，可有效阻斷其介導的病理信號轉(zhuǎn)導，從而減輕、甚至消除其病理現(xiàn)象(Lee JC，Kumar S，GriswoldDE.et al.Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy.Immunopharmacology.2000；47(2-3)185-201，Lee JC，Kassis S，Kumar S，et al.p38 mitogen-activated protein kinase inhibitors--mechanisms and therapeuticpotentials.Pharmacol Ther.1999；82(2-3)389-97)。例如p38激酶的抑制劑可減輕缺血性腦損傷(Barone FC，Irving EA，Ray AM，et al.SB 239063，asecond-generation p38 inhibitor.reduces brain injury and neurologicaldeficits in cerebral focal ischemia.J Pharmacol Exp Ther 2001；296(2)312-21)，阻止β-淀粉樣肽誘導肌動蛋白應急纖維的形成(Song C，Perides G，Wang D，etal.beta-Amyloid peptide induces formation of actin stress fibers through p38mitogen-activated protein kinase.J Neurochem.2002；83(4)828-36.)。因此，p38激酶是人們較為關(guān)注的藥物靶標(Lee JC，Kumar S，Griswold DE，et al.Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy.Immunopharmacology.2000；47(2-3)185-201，Lee JC，Kassis S，Kumar S，et al.p38 mitogen-activatedprotein kinase inhibitors--mechanisms and therapeutic potentials.PharmacolTher.1999；82(2-3)389-97，Adams JL，Badger AM，Kumar S，Lee JC.p38 MAPkinasemolecular target for the inhibition of pro-inflammatory cytokines.Prog Med Chem 2001；)。蛋白質(zhì)之間的相互作用調(diào)控細胞信號傳導(Souroujon MC，Mochly-Rosen D.Peptide modulators of protein-protein interactions inintracellular signaling.Nat Biotechnol.1999；16(12)919-24)。干擾蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而抑制病理信號的轉(zhuǎn)導，已成為一種重要的疾病治療策略(Huang Z.Structural chemistry and therapeutic intervention ofprotein-protein interactions in immune response，human immunodeficiency virusentry，and apoptosis.Pharmacol Ther.2000；86(3)20l-15.)。
生物體內(nèi)正?；虻霓D(zhuǎn)錄產(chǎn)物因無互補序列不會形成雙鏈RNA，因此生物體內(nèi)出現(xiàn)了雙鏈RNA就會激發(fā)RNAi(RNA interference，RNA干擾)機制。RNA干擾技術(shù)是在雙鏈RNA(ds RNA)分子的介導下特異性降解靶基因的生物技術(shù)，能使基因表達沉默，達到拮抗靶基因和實現(xiàn)生物(基因)治療目的。將雙鏈RNA降解成長度為21-25nt的小干擾RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，這些小片段會進一步介導與其同源的單鏈RNA降解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白，名稱為NP60，來源于人屬人(Homo sapiens)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)
1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，并對其具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由553個氨基酸殘基組成，編碼與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白NP60的基因(NP60)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1662個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至1662位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增NP60中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
將編碼本發(fā)明蛋白NP60的基因NP60的干擾RNA的編碼基因?qū)胨拗?，使宿主細胞?nèi)NP60沉默，進而可抑制有絲分裂原激活蛋白激酶p38的活性。因此可以NP60干擾RNA的編碼基因作為活性成分制備成藥物，用于治療與有絲分裂原激活蛋白激酶p38信號通路相關(guān)的疾病，如炎癥、缺血/再灌損傷及心肌肥厚等。
所述NP60干擾RNA的編碼基因可通過含有所述NP60干擾RNA編碼基因的RNAi表達載體導入宿主；用于構(gòu)建所述RNAi表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可在人體中表達外源基因的真核表達載體，如pSuper、pSilencer 1.0-U6、pH1-siRNA siRNA、mU6pro等質(zhì)粒載體或在病毒載體基礎上構(gòu)建的載體，其中，mu6pro為優(yōu)選的出發(fā)載體。
以mU6pro為出發(fā)載體，構(gòu)建的RNAi表達載體為NP60-SiRNA。
本發(fā)明提供了一個與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白NP60及其編碼基因。實驗證明，該蛋白可與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，調(diào)節(jié)有絲分裂原激活蛋白激酶p38的活性，從而介導有絲分裂原激活蛋白激酶p38對炎癥、細胞滲透壓改變等多種細胞應急反應。因此，本發(fā)明的蛋白NP60可作為一個新的藥物靶分子，通過干預生物體內(nèi)有絲分裂原激活蛋白激酶p38的活性，從而達到治療和該信號通路相關(guān)的疾病，如炎癥、缺血/再灌損傷及心肌肥厚等。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為ELISA法檢測NP60及其結(jié)構(gòu)域突變體和有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的結(jié)果圖2為Western blotting檢測NP60介導的上游激酶對有絲分裂原激活蛋白激酶p38激活作用的結(jié)果圖3為Western blotting檢測NP60介導細胞滲透壓改變對有絲分裂原激活蛋白激酶p38活性調(diào)節(jié)作用的結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實施例1、NP60的克隆采用酵母雙雜交的方法，以有絲分裂原激活蛋白激酶p38作為誘餌蛋白，在人源的胃腸道組織的cDNA文庫(Ge，B.，Gram，H.，Di Padova，F(xiàn).，Huang，B.，New，L.，Ulevitch，R.J.，Luo，Y.and Han，J.(2002).MAPKK-independent activation ofp38alpha mediated by TAB1-dependent autophosphorylation of p38alpha.Science295，1291-4)中進行篩選，具體方法如下用人源胃腸道組織得到的cDNA文庫進行酵母雙雜交，篩選與p38相合的蛋白。結(jié)果在1.5×107個克隆中篩選得到了四個編碼相同基因的克隆(Ge，B.，Gram，H.，DiPadova，F(xiàn).，Huang，B.，New，L.，Ulevitch，R.J.，Luo，Y.and Han，J.(2002).MAPKK-independent activation of p38alpha mediated by TAB1-dependentautophosphorylation of p38alpha.Science 295，1291-4)。將該基因命名為NP60，測序結(jié)果表明該基因具有具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQID №2由1662個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至1662位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
實施例2、ELISA法檢測NP60與有絲分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用一、NP60及其各結(jié)構(gòu)域缺失突變體、有絲分裂原激活蛋白激酶p38的原核表達1、構(gòu)建分別含有NP60、NP60各結(jié)構(gòu)域缺失突變體基因、有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表達載體將實施例1獲得的基因NP60用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的載體PGEX4T-1(Promega，Madison，WI)連接，得到NP60的原核表達載體，命名為GST-NP60-PGEX4T-1。NP60各結(jié)構(gòu)域缺失突變體的表達載體構(gòu)建以NP60全長序列表達載體GST-NP60-PGEX4T-1為模版，PCR得到NP60三個結(jié)構(gòu)域缺失突變體序列，將這三個結(jié)構(gòu)域缺失突變體分別命名為ΔPWWP-NP60(87-553aa)、ΔAT-NP60(185-553aa)、ΔNAD-NP60(1-353aa)。再用相同方法將PCR擴增的上述三種NP60結(jié)構(gòu)域缺失突變體序列分別克隆入載體PGEX4T-1中，得到三種NP60結(jié)構(gòu)域缺失突變體的原核表達載體。有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表達載體的構(gòu)建方法參見文獻(Jiang，Y.，Chen.C，Li，Z.et al.，Characterization of the structureand function of a new mitogen-activated protein kinase(p38beta)，J.Biol.Chem.，1996，271(30)17920-17926.)。
2、NP60及其各結(jié)構(gòu)域缺失突變體有絲分裂原激活蛋白激酶p38的原核表達將步驟1構(gòu)建的NP60的原核表達載體GST-NP60-PGEX4T-1及各結(jié)構(gòu)域缺失突變體的原核表達載體和有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表達載體分別用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)篩選，得到幾種重組菌的陽性克隆；將幾種重組子分別接種于100mL液體LB培養(yǎng)基中，在37℃下，培養(yǎng)至OD600nm＝0.6后加IPTG至終濃度1mM，于30℃誘導表達3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對表達產(chǎn)物進行12％ SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果經(jīng)表達獲得了分子量分別為86KD(GST-NP60蛋白)、77KD(GST-ΔPWWP-NP60蛋白)、66KD(GST-ΔAT-NP60蛋白)、64KD(GST-ΔNAD-NP60蛋白)和40KD(his-p38蛋白)的蛋白，與預期結(jié)果相符，然后對上述蛋白分別進行純化。
二、ELISA法檢測NP60及其結(jié)構(gòu)域缺失突變體與有絲分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用用ELISA的方法檢測步驟一中經(jīng)純化的蛋白NP60及其結(jié)構(gòu)域缺失突變體與有絲分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用，具體方法為取1ug純化的GST，GST-NP60，GST-ΔPWWP-NP60，GST-ΔAT-NP60，GST-ΔNAD-NP60及GST-ATF2(重組蛋白經(jīng)AmershamBiosciences公司的Glutathione Sepherose4B親和柱純化，純化方法詳見使用說明)分別包被于96孔酶標板，然后加入含3％脫脂奶粉的PBST(含1‰Tween20的磷酸鹽緩沖液，pH7.6)于37℃封閉1h。另取0.1ug his-p38溶于含3％脫脂奶粉的PBST，37℃結(jié)合1h，用PBST液洗滌3次，然后依次加入鼠抗-p38單克隆抗體以及辣根過氧化物酶耦連的羊抗鼠抗體(均購自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(1∶1000)依次37℃結(jié)合1h，PBST洗滌3次后加入100ul TMB室溫反應15min，然后加50ul H2SO4終止反應，于450nm檢測吸光值。檢測結(jié)果如圖1所示(GST、GST-NP60、ΔPWWP-NP60、ΔAT-NP60、ΔNAD-NP60、GST-ATF2代表GST蛋白以及與GST融合的NP60以及其三個結(jié)構(gòu)域分別缺失的突變體以及ATF2蛋白；“+”分別表示該樣品中參入指定量的該蛋白，“-”表示未參入)，結(jié)果與陰性對照GST蛋白相比，GST-NP60、GST-ΔPWWP-NP60、GST-ΔNAD-NP60均能與p38結(jié)合，而GST-ΔAT-NP60突變體則與p38無結(jié)合活性。表明NP60可以與有絲分裂原激活蛋白激酶p38發(fā)生相互作用，且結(jié)合的關(guān)鍵序列可能位于AT-hook結(jié)構(gòu)域(序列表中SEQ ID №1的自N端第88到184位氨基酸殘基)。
實施例三、檢測293T及293GP細胞中NP60介導的上游激酶對有絲分裂原激活蛋白激酶p38的激活一、NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38的真核表達1、NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表達載體的構(gòu)建以293T細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，在正向引物5’-CATATGGCGGCTGTGAGTCTG-3’和反向引物5’-CTCGAGATGTATGTAGGCTCGGTA-3’的引導下，PCR擴增NP60基因，將1668bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I及Xho I酶切后克隆入經(jīng)相同酶酶切的載體pcDNA6Myc/His A(Invitrogen，Rockyille，MA)中。有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因和MKK6b基因的真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法參見文獻(Han J，Lee JD，Jiang Y，Li Z，F(xiàn)eng L，Ulevitch RJ.Characterization of thestructure and function of a novel MAP kinase kinase(MKK6)J Biol Chem.1996Feb 9；271(6)2886-91.)。將構(gòu)建的NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表達載體，分別命名為myc-NP60，flag-p38以及HA-MKK6b。
2、NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38的真核表達將步驟1構(gòu)建的NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表達載體myc-NP60，flag-p38以及HA-MKK6b分別用磷酸鈣法法轉(zhuǎn)染真核細胞293T，瞬時過表達。
二、Western blotting檢測NP60介導的上游激酶對有絲分裂原激活蛋白激酶p38的激活作用提取步驟一的經(jīng)培養(yǎng)后陽性轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白，用有絲分裂原激活蛋白激酶p38磷酸化的蛋白為抗體(New England BioLabs，Beverley，MA)，用Western blotting法檢測有絲分裂原激活蛋白激酶p38是否磷酸化。檢測結(jié)果如圖2所示(p38a、myc-NP60、MKK6b分別表示過表達NP60、有絲分裂原激活蛋白激酶p38基因及MKK6b基因于293T細胞，“+、-”的含義分別代表轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染，*P-p38a表示用磷酸化p38的抗體檢測得到的Western blot結(jié)果)，表明過表達NP60可以增強p38的磷酸化水平，表明NP60可協(xié)助有絲分裂原激活蛋白激酶p38的激活。
實施例四、檢測細胞滲透壓改變時NP60對有絲分裂原激活蛋白激酶p38活性的調(diào)節(jié)作用一、細胞內(nèi)源NP60的沉默以293GP細胞為例，檢測細胞滲透壓改變時NP60對有絲分裂原激活蛋白激酶p38活性的調(diào)節(jié)作用。首先利用RNA干擾技術(shù)，將293GP細胞內(nèi)源的NP60沉默，具體方法如下1、NP60的RNAi干擾載體的構(gòu)建干涉靶序列編碼基因的正義序列為5’-gctgtggatgctgttgaag-3’(19bp)，反義序列為5’-cttcaacagcatccacagc-3’(19bp)，以TTCG為Loop，連入干涉載體mU6pro(Yu，J.Y.，DeRuiter，S.L.and Turner，D.L.(2002).RNA interference byexpression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.ProcNatl Acad Sci USA 99，6047-52)，將構(gòu)建的NP60的RNAi干擾載體命名為NP60-SiRNA。
2、細胞內(nèi)源NP60的沉默及檢測將步驟1構(gòu)建的NP60的RNAi干擾載體NP60-SiRNA用磷酸鈣法法轉(zhuǎn)染293GP細胞，再用PCR的方法對陽性轉(zhuǎn)染細胞做進一步檢測，檢測方法為提取細胞總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，在正向引物5’-gagtctagtaccgtgaaggg-3’和反向引物5’-gatcccttgcagcacaccac-3’的引導下，PCR檢測NP60基因，以actin基因為對照，擴增actin基因片段的引物為5’-caccaactgggacgacat3’(正向引物)和5’-catactcctgcttgctgatc3’(反向引物)，檢測結(jié)果表明獲得了NP60沉默的293GP細胞。
二、檢測細胞滲透壓改變時NP60對有絲分裂原激活蛋白激酶p38活性的調(diào)節(jié)作用用0.3M山梨糖醇(sorbitol)刺激步驟一獲得的NP60沉默的293GP細胞30分鐘。然后，收集細胞，提取細胞的總蛋白。用與實施例3相同的方法檢測有絲分裂原激活蛋白激酶p38是否磷酸化，檢測結(jié)果如圖3所示(mu6、NP60-SiRNA分別表示轉(zhuǎn)染有mU6pro和NP60-SiRNA干涉質(zhì)粒的293GP細胞，0.3M Sorbitol表示給予上述轉(zhuǎn)染細胞0.3M山梨醇的刺激，“+、-”分別表示轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染、以及刺激或未刺激；*P-p38、*P-JNK1/2、*P-ERK1/2、p38、分別表示用磷酸化p38、磷酸化JNK1/2、磷酸化ERK1/2的抗體(均購自New England BioLabs，Beverley，MA)以及p38蛋白的抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)檢測的western blot結(jié)果)，表明NP60沉默的293GP細胞中，Sorbitol刺激引起的p38的磷酸化水平與對照組相比有減弱，而另兩種MAPKsJNK1/2以及ERK1/2的磷酸化水平則無變化，表明NP60選擇性地調(diào)節(jié)Sorbitol引起的p38的磷酸化水平。在內(nèi)源NP60沉默的293GP細胞內(nèi)，山梨糖醇激活有絲分裂原激活蛋白激酶p38的活性喪失，表明NP60可介導細胞滲透壓改變對有絲分裂原激活蛋白激酶p38活性的調(diào)節(jié)。
序列表<160>2<210>1<211>553<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Ala Val Ser Leu Arg Leu Gly Asp Leu Val Trp Gly Lys Leu1 5 10 15Gly Arg Tyr Pro Pro Trp Pro Gly Lys Ile Val Asn Pro Pro Lys Asp20 25 30Leu Lys Lys Pro Arg Gly Lys Lys Cys Phe Phe Val Lys Phe Phe Gly35 40 45Thr Glu Asp His Ala Trp Ile Lys Val Glu Gln Leu Lys Pro Tyr His50 55 60Ala His Lys Glu Glu Met Ile Lys Ile Asn Lys Gly Lys Arg Phe Gln65 70 75 80Gln Ala Val Asp Ala Val Glu Glu Phe Leu Arg Arg Ala Lys Gly Lys85 90 95Asp Gln Thr Ser Ser His Asn Ser Ser Asp Asp Lys Asn Arg Arg Asn100 105 110Ser Ser Glu Glu Arg Ser Arg Pro Asn Ser Gly Asp Glu Lys Arg Lys115 120 125Leu Ser Leu Ser Glu Gly Lys Val Lys Lys Asn Met Gly Glu Gly Lys130 135 140Lys Arg Val Ser Ser Gly Ser Ser Glu Arg Gly Ser Lys Ser Pro Leu145 150 155 160Lys Arg Ala Gln Glu Gln Ser Pro Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Lys165 170 175
Asp Glu Lys Asp Leu Thr Ile Pro Glu Ser Ser Thr Val Lys Gly Met180 185 190Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Phe Lys Trp Gln Pro Thr Ala Ser Glu195 200 205Pro Val Lys Asp Ala Asp Pro His Phe His His Phe Leu Leu Ser Gln210 215 220Thr Glu Lys Pro Ala Val Cys Tyr Gln Ala Ile Thr Lys Lys Leu Lys225 230 235 240Ile Cys Glu Glu Glu Thr Gly Ser Thr Ser Ile Gln Ala Ala Asp Ser245 250 255Thr Ala Val Asn Gly Ser Ile Thr Pro Thr Asp Lys Lys Ile Gly Phe260 265 270Leu Gly Leu Gly Leu Met Gly Ser Gly Ile Val Ser Asn Leu Leu Lys275 280 285Met Gly His Thr Val Thr Val Trp Asn Arg Thr Ala Glu Lys Cys Asp290 295 300Leu Phe Ile Gln Glu Gly Ala Arg Leu Gly Arg Thr Pro Ala Glu Val305 310 315 320Val Ser Thr Cys Asp Ile Thr Phe Ala Cys Val Ser Asp Pro Lys Ala325 330 335Ala Lys Asp Leu Val Leu Gly Pro Ser Gly Val Leu Gln Gly Ile Arg340 345 350Pro Gly Lys Cys Tyr Val Asp Met Ser Thr Val Asp Ala Asp Thr Val355 360 365Thr Glu Leu Ala Gln Val Ile Val Ser Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu370 375 380Ala Pro Val Ser Gly Asn Gln Gln Leu Ser Asn Asp Gly Met Leu Val385 390 395 400Ile Leu Ala Ala Gly Asp Arg Gly Leu Tyr Glu Asp Cys Ser Ser Cys405 410 415Phe Gln Ala Met Gly Lys Thr Ser Phe Phe Leu Gly Glu Val Gly Asn420 425 430
Ala Ala Lys Met Met Leu Ile Val Asn Met Val Gln Gly Ser Phe Met435 440 445Ala Thr Ile Ala Glu Gly Leu Thr Leu Ala Gln Val Thr Gly Gln Ser450 455 460Gln Gln Thr Leu Leu Asp Ile Leu Asn Gln Gly Gln Leu Ala Ser Ile465 470 475 480Phe Leu Asp Gln Lys Cys Gln Asn Ile Leu Gln Gly Asn Phe Lys Pro485 490 495Asp Phe Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Lys Asp Leu Arg Leu Ala Ile Ala500 505 510Leu Gly Asp Ala Val Asn His Pro Thr Pro Met Ala Ala Ala Ala Asn515 520 525Glu Val Tyr Lys Arg Ala Lys Ala Leu Asp Gln Ser Asp Asn Asp Met530 535 540Ser Ala Val Tyr Arg Ala Tyr Ile His545 550<210>2<211>1662<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2ATGGCGGCTG TGAGTCTGCG GCTCGGCGAC TTGGTGTGGG GGAAACTCGG CCGATATCCT 60CCTTGGCCAG GAAAGATTGT TAATCCACCA AAGGACTTGA AGAAACCTCG CGGAAAGAAA120TGCTTCTTTG TGAAATTTTT TGGAACAGAA GATCATGCCT GGATCAAAGT GGAACAGCTG180AAGCCATATC ATGCTCATAA AGAGGAAATG ATAAAAATTA ACAAGGGTAA ACGATTCCAG240CAAGCGGTAG ATGCTGTCGA AGAGTTCCTC AGGAGAGCCA AAGGGAAAGA CCAGACGTCA300TCCCACAATT CTTCTGATGA CAAGAATCGA CGTAATTCCA GTGAGGAGAG AAGTAGGCCA360AACTCAGGTG ATGAGAAGCG CAAACTTAGC CTGTCTGAAG GGAAGGTGAA GAAGAACATG420GGAGAAGGAA AGAAGAGGGT GTCTTCAGGC TCTTCAGAGA GAGGCTCCAA ATCCCCTCTG480AAAAGAGCCC AAGAGCAAAG TCCCCGGAAG CGGGGTCGGC CCCCAAAGGA TGAGAAGGAT540
CTCACCATCC CGGAGTCTAG TACCGTGAAG GGGATGATGG CCGGACCGAT GGCCGCGTTT 600AAATGGCAGC CAACCGCAAG CGAGCCTGTT AAAGATGCAG ATCCTCATTT CCATCATTTC 660CTGCTAAGCC AAACAGAGAA GCCAGCTGTC TGTTACCAGG CAATCACGAA GAAGTTGAAA 720ATATGTGAAG AGGAAACTGG CTCCACCTCC ATCCAGGCAG CTGACAGCAC AGCCGTGAAT 780GGCAGCATCA CACCCACAGA CAAAAAGATA GGATTTTTGG GCCTTGGTCT CATGGGAAGT 840GGAATCGTCT CCAACTTGCT AAAAATGGGT CACACAGTGA CTGTCTGGAA CCGCACTGCA 900GAGAAATGTG ATTTGTTCAT CCAGGAGGGG GCCCGTCTGG GAAGAACCCC CGCTGAAGTC 960GTCTCAACCT GCGACATCAC TTTCGCCTGC GTGTCGGATC CCAAGGCGGC CAAGGACCTG1020GTGCTGGGCC CCAGTGGTGT GCTGCAAGGG ATCCGCCCTG GGAAGTGCTA CGTGGACATG1080TCAACAGTGG ACGCTGACAC CGTCACTGAG CTGGCCCAGG TGATTGTGTC CAGGGGGGGG1140CGCTTTCTGG AAGCCCCCGT CTCAGGGAAT CAGCAGCTGT CTAATGACGG GATGTTGGTG1200ATCTTAGCGG CTGGAGACAG GGGCTTATAT GAGGACTGCA GCAGCTGCTT CCAGGCGATG1260GGGAAGACCT CCTTCTTCCT AGGTGAAGTG GGCAATGCAG CCAAGATGAT GCTGATCGTG1320AACATGGTCC AAGGGAGCTT CATGGCCACT ATTGCCGAGG GGCTGACCCT GGCCCAGGTG1380ACAGGCCAGT CCCAGCAGAC ACTCTTGGAC ATCCTCAATC AGGGACAGTT GGCCAGCATC1440TTCCTGGACC AGAAGTGCCA AAATATCCTG CAAGGAAACT TTAAGCCTGA TTTCTACCTG1500AAATACATTC AGAAGGATCT CCGCTTAGCC ATTGCGCTGG GTGATGCGGT CAACCATCCG1560ACTCCCATGG CAGCTGCAGC AAATGAGGTG TACAAAAGAG CCAAGGCGCT GGACCAGTCC1620GACAACGATA TGTCCGCCGT GTACCGAGCC TACATACATT AA 166權(quán)利要求
1.與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，并對其具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用蛋白的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達載體。
6.含有權(quán)利要求3所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
7.含有權(quán)利要求3所述基因的宿主菌。
8.權(quán)利要求3所述基因的干擾RNA的編碼基因在制備與有絲分裂原激活蛋白激酶p38信號通路相關(guān)疾病的治療性藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其編碼基因與應用。其目的是提供一個與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其編碼基因與其在制備與有絲分裂原激活蛋白激酶p38信號通路相關(guān)疾病的治療性藥物中的應用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與有絲分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，并對其具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK1948340SQ200510108340
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者顧軍, 傅璟, 楊自強 申請人:北京大學