專利名稱：一種鑒定pgc－1基因啟動(dòng)子－1998位snp分子標(biāo)記的引物、方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子序列中-1998位SNP分子標(biāo)記的引物、方法及試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性SNP，屬于第三代分子標(biāo)記，在人類基因組DNA序列測(cè)序和分析工作完成后，其能為系統(tǒng)的研究基因功能及相關(guān)遺傳疾病提供有力的應(yīng)用提供保障。由于其廣泛分布于人類基因組并且相對(duì)穩(wěn)定存在，因而在疾病相關(guān)基因定位及疾病的遺傳機(jī)理研究應(yīng)用中極具前景。通過發(fā)現(xiàn)特定群體中存在的SNP標(biāo)記，并設(shè)計(jì)不同方案將發(fā)現(xiàn)的SNP進(jìn)行人群規(guī)?；中秃Y查，將直接為遺傳性疾病的機(jī)理研究提供技術(shù)基礎(chǔ)和手段；同時(shí)，對(duì)人類遺傳性疾病的病因診斷、治療及防治產(chǎn)生重大影響。
研究發(fā)現(xiàn)，SNP在人類基因組中的平均密度估計(jì)為1/1000bp，在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè)，且密度高于第二代分子標(biāo)記STR。大多數(shù)SNP來源于物種形成之后，種群出現(xiàn)之前，由于每一代中核苷酸的變異頻率極低(約10-8)以及堿基變化的隨機(jī)性，使得單堿基等位基因十分穩(wěn)定，人類SNP中大部分(85％)是共有的(但在不同種群中發(fā)生的頻率不同)。發(fā)現(xiàn)特定群體中存在的SNP，并研究其分布規(guī)律將為相對(duì)透徹并全面的揭示人類基因組中疾病基因定位情況提供強(qiáng)有力的切入點(diǎn)。
雖然人類基因組DNA序列測(cè)序工作的完成對(duì)人類具有及其重大的實(shí)用意義，特別是在疾病遺傳病因?qū)W的尋找和群體遺傳學(xué)的領(lǐng)域中；但是，由于人類基因組計(jì)劃的完成是基于有限群體基礎(chǔ)之上，針對(duì)特定群體(如洲際、國(guó)家、地區(qū)等)研究時(shí)，則需要在借鑒和參考的前提下具體分析問題。簡(jiǎn)要的說，就是根據(jù)具體的研究應(yīng)用領(lǐng)域選取特定人類基因組區(qū)段在特定群體對(duì)象中結(jié)合人類基因組DNA序列結(jié)果進(jìn)行剖析，篩檢特定群體對(duì)象中其基因組區(qū)段中存在的具有生物學(xué)意義的結(jié)構(gòu)特征(即分子標(biāo)記)，并對(duì)特定群體中實(shí)際存在可研究的分子標(biāo)記進(jìn)行規(guī)?；⒏咄康姆中?，從而為后續(xù)的廣闊應(yīng)用領(lǐng)域奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
本發(fā)明中涉及過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1基因(peroxisomeproliferator-activated receptor-γcoactivator-1，PGC-1)啟動(dòng)子序列中SNP分子標(biāo)記在中國(guó)北方群體中的發(fā)現(xiàn)及規(guī)模化分型試劑盒的實(shí)例。PGC-1是一種多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能參與調(diào)節(jié)能量代謝的諸多方面，刺激線粒體生物合成及線粒體氧化代謝，以適應(yīng)不同的代謝需求。其表達(dá)受寒冷、饑餓、耐力運(yùn)動(dòng)、感染等刺激調(diào)控，以調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、肝糖異生等代謝穩(wěn)態(tài)，適應(yīng)機(jī)體需要。其能廣泛參與線粒體生物合成及能量代謝、肝糖代謝及脂肪酸β氧化等多條代謝通路的調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，預(yù)示了PGC-1基因在代謝綜合征的基礎(chǔ)研究及臨床干預(yù)中將可能極具應(yīng)用前景。
真核基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子通過與目標(biāo)靶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，改變生物學(xué)程序，最終影響生物體生命活動(dòng)。通過對(duì)目標(biāo)靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行篩查，一方面能發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子核苷酸序列中可能存在的特定人群中的SNP標(biāo)汜，間接通過連鎖分析和連鎖不平衡分析實(shí)現(xiàn)致病基因的定位研究；另一方面還可能直接發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子中的致病突變SNP，由于此SNP發(fā)生突變，改變了轉(zhuǎn)錄因子和位于啟動(dòng)子中的順式調(diào)控元件的結(jié)合狀態(tài)，從而影響目標(biāo)靶基因表達(dá)量改變，最終導(dǎo)致病理狀態(tài)的發(fā)生。可見，在疾病遺傳學(xué)的研究中，基因啟動(dòng)子區(qū)段的掃描是發(fā)現(xiàn)特定群體中SNP分布特點(diǎn)及規(guī)律的有力手段。
經(jīng)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，全世界未見任何關(guān)于人類PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域序列中第三代分子標(biāo)記SNP的識(shí)別及分型研究方法的報(bào)道，也未見任何人類PGC-1基因啟動(dòng)子中SNP和/或其參與構(gòu)建的單體型與代謝綜合征研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)現(xiàn)并鑒定中國(guó)北方人PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP標(biāo)記的特異性方法設(shè)計(jì)及PCR引物序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種使用方便、靈敏度高的包含上述引物的檢測(cè)試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子序列中SNP分子標(biāo)記的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，采用巢式PCR結(jié)合限制性位點(diǎn)引入PCR的方法，測(cè)定受試者的PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位SNP標(biāo)記的基因型；其中巢式PCR的外引物序列如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；內(nèi)引物即限制性位點(diǎn)引入PCR的引物序列如序列表SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第-1998位為C/G復(fù)等位基因的SNP標(biāo)記(SEQ ID NO.1序列中用 表示)。命名方法為將PGC-1基因翻譯起始密碼子ATG中，腺嘌呤A定義為1號(hào)位時(shí)，其下游序列中胸腺嘧啶T、鳥嘌呤G分別為2、3號(hào)位同理，其上游序列依次為0、-1、-2……位，在中國(guó)北方人群中，第-1998位為C/G多態(tài)性標(biāo)記。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列為部分PGC-1基因啟動(dòng)子序列。此基因組序列可從Genbank中獲得，原始基因組完整序列在Genbank中的編號(hào)為(AC092834)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員都清楚，有很多分析方法可以用于檢測(cè)PGC-1基因啟動(dòng)子序列中是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測(cè)序、雜交測(cè)序、DNA芯片、PCR-RFLP、PCR-SSCP、酶促錯(cuò)配切割、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜(DHPLC)等。
首次通過直接測(cè)序法，在中國(guó)北方人群中30名2型糖尿病患者與10名年齡、性別匹配正常對(duì)照群體間發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方人群中PGC-1啟動(dòng)子區(qū)域-1998位存在C/G多態(tài)性SNP標(biāo)記位點(diǎn)。用于本發(fā)明方法或檢測(cè)試劑盒基于特異設(shè)計(jì)的引物，采用兩步法巢式PCR(nested-PCR)配合限制性位點(diǎn)生成PCR法(Restriction sitegeneration-PCR，RG-PCR)實(shí)現(xiàn)PGC-1啟動(dòng)子區(qū)域-1998位C/G多態(tài)性SNP標(biāo)記位點(diǎn)基因型分型。進(jìn)行巢式第一步PCR反應(yīng)擴(kuò)增后得到SEQ ID NO.2所示序列片段，所使用的引物具有如下序列(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)SEQ ID NO.4 5’-GGG CAG GTT AGA ATA TCA A-3’；SEQ ID NO.5 5’-GGC TAA TGC AGG TAG GTG-3’。
結(jié)合限制性位點(diǎn)生成PCR法所設(shè)計(jì)的引物，被用于進(jìn)行巢式第二步PCR反應(yīng)使用，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)后能夠特異性鑒定此SNP標(biāo)記，擴(kuò)增后得到SEQ IDNO.3所示序列片段，所使用的引物具有如下序列(SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7)SEQ ID NO.6 5’-CAG TAG TAT TTC ACA GTG GAT C-3’；SEQ ID NO.7 5’-AAT AAC AGG AAA ATA CAA CCT C-3’。
一種使用方便、靈敏度高的包含上述引物的檢測(cè)試劑盒，它含有所述的PCR特異擴(kuò)增引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7)和用于PCR擴(kuò)增檢測(cè)的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測(cè)方法。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)第-1998位SNP相互對(duì)比是否存在變異時(shí)，所需的化學(xué)試劑還包括特異性的限制性內(nèi)切酶等。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下本發(fā)明試劑盒供10人份檢測(cè)應(yīng)用，其組分、含量和來源包括50μL 10×PCR緩沖液(Pharmacia)，50μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶(TAKARA)，各5μL(10pmol/μL)SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7引物，1ml純水，20μL 10×K限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液(TAKARA)，5μL(10u/μL)限制性內(nèi)切酶BamH I(TAKARA)。
使用方法1)通過PCR擴(kuò)增PGC-1基因部分啟動(dòng)子片段，簡(jiǎn)言之，制備混合液，加入基因組DNA溶液20ng、2μL 10×PCR緩沖液、0.4μL 10mM dNTP、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.3μL正義引物(SEQ ID NO.4，10pmol/μL)、0.3μL反義引物(SEQ ID NO.5，10pmol/μL)，15.5μL純水，使總體積為20μL。PCR反應(yīng)條件為95℃5min預(yù)變性，94℃45s、57℃45s、72℃60s、25個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，將3μL PCR反應(yīng)液在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增為出1055bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
2)通過錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)后，在第一次PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)之上，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增PGC-1基因部分啟動(dòng)子片段。將聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的第一次PCR產(chǎn)物2μL加入18μL純水中，混勻后從中取出1μL，加入2μL 10×PCR緩沖液、0.4μL 10mM dNTP、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.3μL正義引物(SEQ ID NO.6，10pmol/μL)、0.3μL反義引物(SEQ ID NO.7，10pmol/μL)，15.5μL純水，使總體積為20μL。PCR反應(yīng)條件為95℃3min預(yù)變性，94℃45s、58℃45s、72℃45s、30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，將3μL PCR反應(yīng)液在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增為出193bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
3)通過用限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP多態(tài)性。從聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的第二次PCR產(chǎn)物中吸取3μL，加入1μL10×K限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、0.3μL限制性內(nèi)切酶BamH I(10u/μL)、純水5.7μL，混勻后在37℃水浴中消化4h。之后，在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。
4)多態(tài)性定型用限制性內(nèi)切酶BamH I處理片段，在PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP堿基是C等位基因時(shí)，出現(xiàn)175bp和18bp的條帶。如為G等位基因時(shí)，僅出現(xiàn)193bp一個(gè)條帶。
本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。
從基因組DNA中，可擴(kuò)增含PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位突變點(diǎn)的核酸片段，以獲得測(cè)定的大量樣本。這種通過兩步法巢式PCR配合限制性位點(diǎn)生成PCR方法設(shè)計(jì)得到含PGC-1基因突變點(diǎn)的DNA片段獲得的樣品，適于用作測(cè)定材料，進(jìn)行后續(xù)SNP的識(shí)別和分型。
對(duì)此設(shè)計(jì)無限制，只要用酶切割DNA區(qū)獲得的片段長(zhǎng)度在突變基因和野生型基因的兩種情形中不同。因此，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增的所需DNA片段，通過上述合理選擇的限制性內(nèi)切酶得以設(shè)計(jì)。酶切產(chǎn)生的片段通過電泳證實(shí)，它們顯示特定的條帶。根據(jù)在上述方法中獲得的帶型，可測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP的多態(tài)性。
在利用本發(fā)明進(jìn)行等位基因分型時(shí)，優(yōu)選使用于測(cè)定根據(jù)PGC-1基因的突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對(duì)應(yīng)于用于測(cè)定PGC-1基因突變類型的方法。特定的試劑按采用的測(cè)定方法來適當(dāng)?shù)剡x擇。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了中國(guó)北方人群中PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位存在SNP分子標(biāo)記(C/G)，并詳細(xì)提供了一種使用方便、靈敏度高的包含上述引物的檢測(cè)試劑盒方法，該方法可用于PGC-1啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP的識(shí)別及鑒定，繼而可用于包括中國(guó)北方群體中代謝綜合征等疾病的早期輔助診斷和篩查。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以使公眾對(duì)本發(fā)明內(nèi)容有更詳盡的了解，并非對(duì)本發(fā)明的限定，凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對(duì)本發(fā)明的侵犯。


圖1為PCR-直接測(cè)序法所得的多核苷酸序列結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)后識(shí)別PGC-1基因啟動(dòng)子-1998(C/G)SNP標(biāo)記。
圖2為BamH I酶切電泳圖譜。其中，1、5、6、7、8、11、12泳道為G/G基因型；2、3、4、9泳道為C/G基因型，10泳道為C/C基因型，13泳道為空白對(duì)照，14泳道為分子量標(biāo)志物(鼎國(guó)公司SD011)。
圖3為BamH I試劑盒酶切電泳分型方法結(jié)果由DNA測(cè)序驗(yàn)證圖。PGC-1啟動(dòng)子-1998(C/G)SNP使用本專利試劑盒基因型分型結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果一致。
具體實(shí)施例方式
用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下。
EDTA乙二胺四乙酸二鈉SDS十二烷基硫酸鈉TE10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)
10×PCR緩沖液100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化鎂(MgCl2)0.01％(W/V)白明膠dNTP脫氧核苷三磷酸APS過硫酸銨→10×TBETris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于純水中，總體積為1升。
實(shí)施例1 血液樣本收集和基因組DNA的提取按WHO(1999)標(biāo)準(zhǔn)明確診斷入選病例，須經(jīng)空腹8-12小時(shí)口服溶入300ml溫水中的75g無水葡萄糖，2小時(shí)后檢測(cè)其血漿葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前經(jīng)由縣市以上級(jí)別醫(yī)院明確診斷的糖尿病患者，共計(jì)收集來自黑龍江和北京的無親緣關(guān)系T2DM患者396例，平均年齡50.0歲±12.7歲，其中男性191例，同地區(qū)的健康對(duì)照志愿者319例，平均年齡45.2歲±5.7歲，其中男性181例。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2％NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37℃過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進(jìn)行離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸光度。DNA工作液濃度校正至50ng/u1，置-20℃冰箱保存。
實(shí)施例2 SNP的識(shí)別確定本發(fā)明采用兩步法巢式PCR、錯(cuò)配堿基引入限制性位點(diǎn)方法對(duì)PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行SNP標(biāo)記篩查并進(jìn)行分型鑒定。
1)特異性引物如下SEQ ID NO.4 5’-GGG CAG GTT AGA ATA TCA A-3’；SEQ ID N0.5 5’-GGC TAA TGC AGG TAG GTG-3’。
SEQ ID NO.6 5’-CAG TAG TAT TTC ACA GTG GAT C-3’；SEQ ID NO.7 5’-AAT AAC AGG AAA ATA CAA CCT C-3’2)PCR擴(kuò)增PGC-1基因部分啟動(dòng)子片段反應(yīng)容器中加入實(shí)施例1制備的基因組DNA溶液20ng、2μL 10×PCR緩沖液、0.4μL 10mM dNTP、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.3μL正義引物(SEQ ID NO.4，10pmol/μL)、0.3μL反義引物(SEQ ID NO.5，10pmol/μL)，15.5μL純水，使總體積為20μL。PCR反應(yīng)條件為95℃5min預(yù)變性，94℃45s、57℃45s、72℃60s、25個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，將3μL PCR反應(yīng)液在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc2000檢測(cè)，如擴(kuò)增為出1055bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
3)擴(kuò)增所得1055bp的片段，純化后直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。委托華大中生科技發(fā)展有限公司進(jìn)行序列測(cè)定工作。本工作在中國(guó)北方人群中30名2型糖尿病患者與10名年齡、性別匹配正常對(duì)照群體中進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果經(jīng)GENESTAR工具生物信息學(xué)多序列比對(duì)后(見圖1)，發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方群體中PGC-1啟動(dòng)子區(qū)域-1998位存在C/G多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)。
4)錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)內(nèi)引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增生物信息學(xué)設(shè)計(jì)含錯(cuò)配堿基引物SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7后，在第一次PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)之上，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增PGC-1基因部分啟動(dòng)子片段。將聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的第一次PCR產(chǎn)物2μL加入18μL純水中，混勻后從中取出1μL，加入2μL 10×PCR緩沖液、0.4μL 10mMdNTP、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.3μL正義引物(SEQ ID NO.6，10pmol/μL)、0.3μL反義引物(SEQ ID NO.7，10pmol/μL)，15.5μL純水，使總體積為20μL。PCR反應(yīng)條件為95℃3min預(yù)變性，94℃45s、58℃45s、72℃45s、30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，將3μL PCR反應(yīng)液在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc2000檢測(cè)，如擴(kuò)增為193bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
5)通過用限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子區(qū)域-1998位SNP多態(tài)性。從聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的第二次PCR產(chǎn)物中吸取3μL，加入1μL10×K限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、0.3μL限制性內(nèi)切酶BamH I，純水5.7μL，混勻后在37℃水浴中消化4h。之后，在8.0％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc2000檢測(cè)，如PGC-1啟動(dòng)子-1998位為C等位基因時(shí)出現(xiàn)175bp和18bp的條帶。如為T等位基因時(shí)，僅出現(xiàn)193bp一個(gè)條帶，見圖2所示。
實(shí)施例3 檢測(cè)試劑盒1)制備檢測(cè)PGC-1啟動(dòng)子區(qū)域-1998(C/G)SNP標(biāo)記的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出含有1998(C/G)SNP標(biāo)記的PGC-1基因部分啟動(dòng)子序列的四條引物，及其PCR-RFLP相應(yīng)試劑，成分和含量如下(10人份)，于-20℃保存50μL 10×PCR緩沖液(Pharmacia)，50μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶(TAKARA)，各5μL(10pmol/μL)SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7引物，1ml純水，20μL 10×K限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液(TAKARA)，5μL(10u/μL)限制性內(nèi)切酶BamH I(TAKARA)。
2)按照本發(fā)明中PGC-1基因啟動(dòng)子序列中-1998(C/G)分型方案設(shè)計(jì)，使用本實(shí)施例中的檢測(cè)盒對(duì)中國(guó)北方人群共396例T2DM患者進(jìn)行規(guī)?；中蛯?shí)驗(yàn)。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)分型結(jié)果，每種基因型個(gè)體中各抽樣5例個(gè)體，取其巢式PCR第一步PCR(使用引物SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)后產(chǎn)物20μL，經(jīng)脫鹽純化后，由北京華大中生科技發(fā)展有限公司測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控結(jié)果顯示，所有樣本的PGC-1啟動(dòng)子序列-1998(C/G)SNP標(biāo)記位點(diǎn)，經(jīng)試劑盒基因基因型分型結(jié)果與核酸序列測(cè)定結(jié)果一致(見圖3所示)，表明此試劑盒可信度較高，可以用于推廣并規(guī)?；瘧?yīng)用。
本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1)本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了一種存在于中國(guó)北方人群PGC-1基因啟動(dòng)子中-1998位(C/G)SNP分子標(biāo)記，并設(shè)計(jì)提供了對(duì)此SNP分子標(biāo)記檢測(cè)和特異分型的方法。PGC-1基因位于人常染色體4p15.1，此新識(shí)別的SNP位于PGC-1基因啟動(dòng)子序列中第-1998位，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)有在C/G兩種復(fù)等位基因，可直接應(yīng)用于或構(gòu)建單體型后應(yīng)用于中國(guó)北方人群中開展代謝綜合征的致病基因定位篩選，并可能運(yùn)用于代謝綜合征的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)，以利于開展代謝綜合征的早期干預(yù)和治療。
2)利用本發(fā)明闡述的PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位堿基變異，作為分子標(biāo)記運(yùn)用于DNA芯片產(chǎn)品，合并其他PGC-1基因區(qū)域存在的SNP分子標(biāo)記，快速檢出PGC-1基因區(qū)域多SNP標(biāo)記突變情況，綜合全效評(píng)價(jià)PGC-1基因在特定人群中可能存在的代謝綜合征病因?qū)W意義。
3)利用本發(fā)明闡述的PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位堿基變異，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)PGC-1表達(dá)的活性分子，促進(jìn)代謝綜合征新藥開發(fā)。
4)本發(fā)明建立的檢測(cè)PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位SNP多態(tài)性的核酸序列和特異性的引物設(shè)計(jì)，可高靈敏度，特異性地應(yīng)用于PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位SNP標(biāo)記分型試劑盒。
本發(fā)明敘述了中國(guó)北方人群中存在的PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位C/G的新SNP標(biāo)記，并提供了一種測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位C/G的新SNP標(biāo)記多態(tài)性的方法。而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位C/G SNP標(biāo)記的多態(tài)性。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種測(cè)定PGC-1基因啟動(dòng)子序列-1998位C/G的新SNP標(biāo)記的方法。
序列表<110>衛(wèi)生部北京醫(yī)院<120>一種鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位SNP分子標(biāo)記的引物、方法及試劑盒<130>
<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>229<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1aaacacaaat aaaggtatca gtgaatatca caatggaaga atcacatgat aataattaat 60aaacattgac tcttcttggc caggtgacca atattatttc acagttgatc ttgagggca120gagccaatga cctttgtcct gaattttaat aatttactga agttttacat taaatcagaa180tataattggg aagaaaatta gtgtttcttt gtggggagtg cagagtaat229<210>2<211>1090<212>DNA
<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>2gggcaggtta gaatatcaaa aattataacg agcctgttct aatgtaaaga acatctctaa60aagatgtgaa taggttttaa aaatatgatg aatatctagc attggataaa cacaaataaa120ggtatcagtg aatatcacaa tggaagaatc acatgataat aattaataaa cattgactct180tcttggccag gtgaccaata ttatttcaca gttgatcctt gagggcagag ccaatgacct240ttgtcctgaa ttttaataat ttactgaagt tttacattaa atcagaatat aattgggaag300aaaattagtg tttctttgtg gggagtgcag agtaatgcca ctaattgctt gtataaaagc360attcccgagg ttgtattttc ctgttctttc attagaaaat taaaactaca gtaattttct420gctgtttata aaagggaaaa tgtgctggtg aactgtattc agcaaactta aaatgtcaaa480gctcttggcc acctttttat gcccagtaat gataaactgt caacttcctt acattatttg540ggaatttact agcaacttgt tgcagctctc acagcacaca aatctcttat aatatgtatg600gtctgaaaga agcagcagtc tgctggtatt ttgtttcttt tgttctttct ttcactttaa660tatttgagca atttaatatt taaaatatgt gttagggcaa ataaccatgt ttttctgttt720aaggagatgg acaatgaaga acagtgtaaa ttaacctcag tagaataatg ctttacaaat780tatatttagg taactggggg attgttttca ggtaaattat tatcaagtaa aagaattgag840
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<400>4gggcaggtta gaatatcaa 19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5ggctaatgca ggtaggtg18<210>6<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>6cagtagtatt tcacagtgga tc 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>7aataacagga aaatacaacc tc 2權(quán)利要求
1.一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第-1998位為C/G復(fù)等位基因的SNP標(biāo)記(SEQ ID NO.1序列中用 表示)。
2.一組鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子序列中SNP分子標(biāo)記的引物，其特征在于具有SEQ ID No.4-SEQ ID No.7所示的堿基序列。
3.一種鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子序列中SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，采用巢式PCR結(jié)合限制性位點(diǎn)引入PCR的方法，測(cè)定受試者的PGC-1基因啟動(dòng)子-1998位SNP標(biāo)記的基因型；其中巢式PCR的引物序列如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5限制性位點(diǎn)引入PCR的引物序列如序列表SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
4.一種鑒定PGC-1基因啟動(dòng)子序列中SNP分子標(biāo)記的方法試劑盒，其特征在于由以下試劑組成，保存溫度為-20℃，包括50μL 10×PCR緩沖液，50μL 10mM dNTP混合液，10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶，各5μL(10pmol/μL)SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7引物，1ml純水，20μL 10×K限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，5μL(10u/μL)限制性內(nèi)切酶BamH I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在中國(guó)北方人群中發(fā)現(xiàn)并分型PGC－1基因啟動(dòng)子－1998位SNP分子標(biāo)記的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，根據(jù)本發(fā)明中特異性設(shè)計(jì)引物，采用巢式PCR結(jié)合限制性位點(diǎn)引入PCR的方法，測(cè)定受試者的PGC－1基因啟動(dòng)子－1998位SNP標(biāo)記的基因型，結(jié)合其他PGC－1序列中存在的SNP標(biāo)記以預(yù)測(cè)受試者對(duì)代謝綜合征的易感程度。此方法與核苷酸測(cè)序質(zhì)控方法分型結(jié)果一致，分型結(jié)果可靠。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)首次發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方人群中存在PGC－1基因啟動(dòng)子－1998位C/G的SNP標(biāo)記，提供了一種篩選分型此SNP標(biāo)記的方法和特異性引物，直接應(yīng)用于或構(gòu)建單體型后應(yīng)用于中國(guó)北方人群中開展代謝綜合征的致病基因定位篩選，能運(yùn)用于評(píng)價(jià)代謝綜合征的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)，以利于開展代謝綜合征的早期干預(yù)和治療。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1766127SQ20051010905
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者楊澤, 孫亮, 屈彥純 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院