專利名稱：一個(gè)可用作控制甘藍(lán)黑腐病的靶標(biāo)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病原細(xì)菌的新的致病相關(guān)基因，尤其是甘藍(lán)黑腐病菌的致病相關(guān)基因。
背景技術(shù)：
植物病害一直是農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)降低的主要因子之一。隨著病原菌對(duì)藥物抗性的增強(qiáng)，農(nóng)藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環(huán)境污染、藥物殘留，也大大提高了農(nóng)業(yè)成本，因此，亟待研發(fā)新的防病治病策略和新型的無公害藥物。甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌，也稱為甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris，簡(jiǎn)稱Xcc)，是一種能在全球范圍內(nèi)引起所有十字花科植物黑腐病的革蘭氏陰性細(xì)菌。該菌能在寄主的任何生長(zhǎng)期通過水孔、氣孔或傷口侵入植物體內(nèi)，引起病害，寄主包括甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、蘿卜、油菜等。典型的黑腐病癥狀是在葉緣上形成V字形病斑，隨著病斑的擴(kuò)大，葉脈變黑，因而被稱為黑腐病。黑腐病被認(rèn)為是對(duì)十字花科植物危害最為嚴(yán)重的病害，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫度和濕度都適宜于該菌的生長(zhǎng)繁殖，因此發(fā)病更加嚴(yán)重。由于遺傳穩(wěn)定性和遺傳可操作性，甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌一直被用作研究微生物與植物相互作用分子機(jī)理的模式細(xì)菌。因此，鑒定與黃單胞菌致病相關(guān)的新基因，對(duì)防治植物病害具有顯著的意義。
弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機(jī)制是開發(fā)新型藥物和防病策略的關(guān)鍵，基因組學(xué)研究為人們從分子水平上全面、系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)植物-微生物的互作關(guān)系提供了有效的方法和手段。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因組學(xué)研究已由以序列測(cè)定為主的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)階段全面進(jìn)入了以開放閱讀框(Open ReadingFrame，ORF)功能解析、基因功能開發(fā)為主的功能基因組學(xué)時(shí)期。高通量、大規(guī)模的基因功能的研究為新興的生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)奠定了基礎(chǔ)。已發(fā)現(xiàn)的與致病相關(guān)的基因主要包括以下幾個(gè)類型過敏性與致病性基因(hrp)(He 1998)；無毒基因(avr)(Bonas 1999)；致病性因子調(diào)節(jié)基因(rpf)(Barber 1997)；胞外酶類基因；胞外多糖合成基因(Tang et al 1991；Dow et al 2000a)，脂多糖合成基因(Dow et al 2000b)等。目前，已完成了甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌ATCC33913菌株的全基因組序列的測(cè)定，全基因組序列在美國(guó)國(guó)家生物信息研究所管理的網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公眾開放。該菌株4182個(gè)編碼蛋白的基因，僅有2300個(gè)基因的功能是已知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過建立甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的突變體，鑒定與致病相關(guān)的基因，提供用于防治植物病害的藥物靶標(biāo)。
本發(fā)明所提供的脂多糖O-抗原合成相關(guān)的激酶基因wxcB，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
該基因序列保存在NCBI基因序列庫中，序號(hào)為NP 635994。
序列表中序列1的DNA是甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌ATCC33913菌株的DNA，由2689個(gè)堿基組成，含完整的wxcB激酶基因，自5’端的第197-2488位核苷酸為該基因的開放閱讀框，自5’端的第197-199位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第2489-2491位核苷酸為終止密碼子TAA。
依照本發(fā)明提供的wxcB激酶基因編碼的脂多糖O-抗原合成激酶產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2，該蛋白質(zhì)由764個(gè)氨基酸組成，該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量為84924.85道爾頓，等電點(diǎn)為5.35。
本發(fā)明提供了控制黑腐病新的藥物靶標(biāo)，用于防治黑腐病藥物篩選和生產(chǎn)。


圖1為wxcB基因的克隆酶切電泳圖譜。
1λ/Hind III標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；2克隆載體pLAFR3作為對(duì)照；3基因克隆pLWXCB/BamHI/EcoRI。
圖2為wxcB基因單點(diǎn)整合突變體的PCR驗(yàn)證凝膠圖。
1100bp標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2野生型ATCC33913菌株；3-5wxcB基因單點(diǎn)整合突變體。
圖3為wxcB基因突變體在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。
上排為野生型ATCC33913菌株；下排為wxcB基因單點(diǎn)整合突變體。
圖4為wxcB基因單點(diǎn)整合突變體的致病性試驗(yàn)。
A為ATCC33913野生型菌株；B為wxcB基因單點(diǎn)整合突變體；C為清水(空白對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系JM109，載體pGEM-3Zf(+)購(gòu)自Promega公司；自殺質(zhì)粒pK18mob與穿梭pLAFR3為本研究室(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子遺傳研究所植物病原微生物功能基因組實(shí)驗(yàn)室)保存；限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購(gòu)自Promega、Stratagene、TAKARA、QIAGEN等公司；抗生素(利福平、卡那霉素)和培養(yǎng)基原料(蛋白胨、酵母提取粉、甘油)購(gòu)于上海生物工程公司。
實(shí)施例1、wxcB基因(脂多糖O-抗原合成激酶基因)的克隆根據(jù)wxcB的基因序列，設(shè)計(jì)引物正向引物WF1，5′-TACGAATTCATCTCGCTCGGCATCTCCAG-3′，反向引物WR1，5′-AACGGATCCCACCGATAAGGCAGCTGTAC-3′。
以甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)序列，并將其克隆至pLAFR3中，構(gòu)建基因克隆pLWXCB并酶切驗(yàn)證(見圖1)。序列被亞克隆于pGEM-3Zf(+)中，并進(jìn)行了末端測(cè)序。
實(shí)施例2、wxcB基因單點(diǎn)整合突變體的構(gòu)建根據(jù)Windgassen et al.(2000)提供的研究方法，對(duì)wxcB基因進(jìn)行突變。
按照wxcB基因的內(nèi)部序列，設(shè)計(jì)引物正向引物WF2，5′-ATCGGATCCGTCACTGAATATAGGGG-3′，反向引物WR2，5′-ATCAAGCTTGCGCAAAAATGCATAAC-3′。
PCR擴(kuò)增wxcB基因ORF內(nèi)一段562bp的同源DNA片段，將其定向克隆到自殺質(zhì)粒pK18mob上(BamHI、HindIII雙酶切)，將得到的重組質(zhì)粒通過三親接合導(dǎo)入甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野生型ATCC33913菌株，抗生素(利福平50微克/毫升、卡那霉素25微克/毫升)篩選發(fā)生wxcB基因非極性整合突變的突變體。隨機(jī)選擇3株突變體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR驗(yàn)證(見圖2)。
實(shí)施例3、wxcB基因突變體在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況在固體培養(yǎng)基(每升含蛋白胨5.0g，酵母提取粉3g，甘油20g，pH7.0)平板上，用牙簽點(diǎn)接野生型黃單胞菌、wxcB基因單點(diǎn)整合突變菌株，28℃培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果表明，wxcB基因的突變體三個(gè)重復(fù)菌落均表現(xiàn)為邊緣不整齊、表面粗糙，而野生型菌株則生長(zhǎng)正常，胞外多糖較多(見圖3)。
實(shí)施例4、wxcB基因突變體的致病性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用寄主植物為蘿卜苗(種名為Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.)，所用的接種方法為剪葉法。wxcB基因單點(diǎn)整合突變體和野生型菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，28℃，15-18個(gè)小時(shí)。用NYGB稀釋到OD600＝0.2，用滅過菌的剪刀在菌液浸泡5秒鐘后，在健康葉片距葉尖1-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，25-30℃培養(yǎng)，一周后觀察結(jié)果，正對(duì)照選用甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野生型33913菌株，負(fù)對(duì)照用清水。致病試驗(yàn)表明，wxcB基因的單點(diǎn)整合突變體的致病性顯著降低。證實(shí)wxcB基因與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的致病性有關(guān)。
wxcB基因序列表序列1DNA序列ATCTCGCTCGGCATCTCCAGCGGCGATCCGCTGGTGGAATTGACACCGCTGGATCGGCGCTACGATGCCATCGTGCTGAACGTGGCCCGAGGCATGCAGTTCTGGGGGATGATGGATCTGAAGGCCGATTTCGAAATCGTGGAGGCCTTGTCATGAAGGCGCCAGCAATTCACCTCAACGCAGAGAGCGAACAGCCATGATCGAGTCACTGAATATAGGGGCGCTTGTGGCAGCCCTGCCAGAGAAGTACCAGCCGATCTTTGCGCATCCGGAGCTGTCCGACGGCAGCTCGCGTGGGTGCGAGGACAGGCTTGTGCTGATCCGCCAATGCGCGCAGCGCCTGCAGCATGCGCTTGGCCGCCCGCTGCGTGTGCTCGACCTTGGCTGTGCCCAGGGGTTTTTCTCTCTGAACCTTGCAGCCGATGGTCACACGGTACACGGCGTGGATTTTCTCGATCTCAACGTCAATGTGTGCAAGGCGCTGGCTGCCGAGAACCCTGCATGTGCAGCTACCTTTGAGCACGGCACGGTGGAAGATGTGATAGATCGCCTTGAGCACGATGAGTGCGACCTGGTCCTCGGCCTGAGCGTCTTCCATCATCTAATTCACGACAAAGGCATCCTGAAGGTATCCGCGCTGTGTCGGAAGCTTTCAGAAACGACCAGCGCGGGCATTTATGAGCTCGCCCTGCGTGAGGAGCCGCTCTACTGGGCGCCATCGTTGTCGCAGGACCCGGCCGAGTTGCTATCCAGTTATGCATTTTTGCGCCTGCTTTCACAGCAGCAGACACATCTTTCGGCGGTTTCAAGGCCACTATATTTTGCCAGTAGCCGTTTCTGGTACGTGGATGGAGCCATTGGTAATTTTACGTCTTGGTCATCCGAGTCACATGCGCATGGCCGCGGCACGCATCTGCAATCGCGCCGTTATTATTTCAGCGAACAGTCGTTCGTAAAGAAAATGACGCTGGGCGTGGGAGATCGCGCAGAGATCAATTTGCAGGAGTTCGTCAATGAGGTGGAGTTTCTGGGCAATCCACCGGAGAGCTACCCGGCACCGCGCCTGATCGCATCGCTGAACGATTCCAGGGATCTGTTCATTGCAAGGTCCATGATGAATGGACGGCTTCTCTCCCAGGCGATCGATGATGGGGCCGCTTATGATGCTGATGAAATAATTGCACAGATTCTTGCGCAACTTGTTTTGCTTGAGCGTGCTGGTCTGTACCACAACGACGTGCGCTGCTGGAATATCCTTATCGCGCCTGAAGGGCGTGCTGTATTGATCGACTATGGCGCAATATCGGCCAATCCATTCGATTGCTCATGGCTCGACGATCTTCTGCTTTCCTTCCTGATCACGGTCAAGGAGATTCTTGAGCGCAAGGTTGTTCCCTCCAGTCCGAGCCGGGAGCCCGCTCTGGATTTCATGACGCTGCCCGCGCGTTATCGCAATGCGTTCATCGGGTTTTTTGGTCAGAATCGGTCCCCGTTGACATTCGCCTTGCTGCAACAGTGTCTTCAGCAGGCAGATGCGACCCCTCACTCTGCCCCCGAGTGGGTGACCATCTATCAGCGCCTGCAGAAAGCACTGCTCGGCTATAATGCGCGGCTTAGTGCTGTGCATATTGAGACAGAGCATCATCGGGTGGAGCTTGCCGCGCGCGGGGCGGCAATTGAGCATCTTCGCGATAGTACATTGCAAGACCAAGAGCGCACTCAGGCGTTTGAGCAGGGGGTTGCCGCTGCCGAGGAAAGGTACAAGCGCCTCGAGGAGGAGAGCGAGAAGCTGGCGGCGTGGGCGAAAGGACTTGAAGCTCAGACTATCGAGTCCAACCGTGACAAAGAAGCGCTTGCCGCGCTCAATGCAGAACTGGAATCAGACAAAGCTGCGCTCGCGACGCGAATTGCGTCACTTGGCCAGGAGCTGGAAGAGCGTCAGCGTGCGCGTGAGTTGGCCGAGTTGCTGGCTGCCGACGTGGGACGGCTGACCGAGGAGCGTGACGCTGCCAGGTCCGATCTCCTCGACACCCAAAGCGTCGTTGAGCAGCACCAGGCGACGATTACAGCGCTGGAGGCGCGTGTCGCCGTTCAGCAGCAAC
AGATCAGTGGCCTTGAGAGTTCGCGCGATCAGGAAAGAAATAGGTTGAGGGAGTTGCAGGTGGATCTCTCGCGTAGCATGGACGGTACTGCAAGTGCGCGTGAGTACATTCGTGAGCTTGAGATGGCGGTGGATGCTCTGGAGGGACAGATCAACAGCCTCCACGGAAGTCGGTCCTGGCGCGTTACGGCACCTCTGCGTCTGTTCACCACACGGGTACTGAAGCGTGGCAATGCTGACGCTGCGACCATCCGCAAGGTTTCAGACGCGCGCCTTGAAAGTCCTGTCCATACGGATGGTGTGACACCTACACCGGCAGAGGCTGCGATGGACGAACGCTTAGCTGCAGTCGATCAATTGGGTAGCCGGATTCGTAAGTCGCTTAAATAATCCGGGTAGAGGGAATCGTTGTGGTAAGGACATCATGCAAGAGGTTGTGGCCGTGAAGAGAGTCATTGTTCTGGGTGCGCAGGTACCGTTTGTCAGAGGAGGAGCAGAGTTCCTGAATGAAGAACTTGTCCGCCAGATCAATCTGTGGGGAAAAAAACGCCAGGTTGTCGCGGAATTGGTACAGCTGCCTTATCGGTG
序列2蛋白質(zhì)序列MIESLNIGALVAALPEKYQPIFAHPELSDGSSRGCEDRLVLIRQCAQRLQHALGRPLRVLDLGCAQGFFSLNLAADGHTVHGVDFLDLNVNVCKALAAENPACAATFEHGTVEDVIDRLEHDECDLVLGLSVFHHLIHDKGILKVSALCRKLSETTSAGIYELALREEPLYWAPSLSQDPAELLSSYAFLRLLSQQQTHLSAVSRPLYFASSRFWYVDGAIGNFTSWSSESHAHGRGTHLQSRRYYFSEQSFVKKMTLGVGDRAEINLQEFVNEVEFLGNPPESYPAPRLIASLNDSRDLFIARSMMNGRLLSQAIDDGAAYDADEIIAQILAQLVLLERAGLYHNDVRCWNILIAPEGRAVLIDYGAISANPFDCSWLDDLLLSFLITVKEILERKVVPSSPSREPALDFMTLPARYRNAFIGFFGQNRSPLTFALLQQCLQQADATPHSAPEWVTIYQRLQKALLGYNARLSAVHIETEHHRVELAARGAAIEHLRDSTLQDQERTQAFEQGVAAAEERYKRLEEESEKLAAWAKGLEAQTIESNRDKEALAALNAELESDKAALATRIASLGQELEERQRARELAELLAADVGRLTEERDAARSDLLDTQSVVEQHQATITALEARVAVQQQQISGLESSRDQERNRLRELQVDLSRSMDGTASAREYIRELEMAVDALEGQINSLHGSRSWRVTAPLRLFTTRVLKRGNADAATIRKVSDARLESPVHTDGVTPTPAEAAMDERLAAVDQLGSRIRKSLK*
權(quán)利要求
1.一種編碼脂多糖O-抗原合成激酶的基因(wxcB)，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于自5’端的第197-2488位核苷酸為開放閱讀框。
3.權(quán)利要求1所述的基因在植物病害防治中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了來自甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌中的一個(gè)與致病相關(guān)的基因—脂多糖O－抗原合成激酶基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA的自5’端的第197－2488位核苷酸為開放閱讀框。由2292個(gè)核苷酸組成，自5’端的第197－199位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第2489－2491位核苷酸為該基因的終止密碼子TAA。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1952154SQ200510109170
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者何永強(qiáng), 姜伯樂, 姚子穎, 危廣寧, 唐東階, 馮家勛, 唐紀(jì)良 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)