專利名稱：檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片，特別是涉及一種檢測十字花科植物在病、蟲等生物及干旱、寒冷等非生物脅迫下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。
背景技術(shù)：
利用已知基因信息在待測樣品中特異地檢測目的基因的表達(dá)信息，是分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的檢測手段，如常用的Southern雜交、Northern雜交以及PCR技術(shù)。但是，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，這些技術(shù)不能在同一條件下對成千上萬個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行分析，因此具有一定的局限性。通過原位合成(in situ synthesis)探針或合成目的基因片段后采用交聯(lián)的方式，可以將成千上萬個(gè)基因固定在載體上，再利用雜交方式檢測基因表達(dá)信息的方法已成為一種趨勢。在應(yīng)用領(lǐng)域，生物芯片可廣泛地用于醫(yī)學(xué)臨床診斷、藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督以及司法鑒定等；在科研領(lǐng)域，生物芯片主要用于檢測生物體在不同發(fā)育階段、組織器官、及在各種生物及非生物脅迫下基因的表達(dá)情況，鑒定特異表達(dá)基因的信息，從而為研究提供信息和方向。
通過構(gòu)建cDNA文庫、測序獲取基因信息，是生物芯片制備過程中目的探針設(shè)計(jì)的主要來源。目前，在一些大型數(shù)據(jù)庫(如NCBI上的GenBank)中已經(jīng)有多種生物基因的EST(基因表達(dá)序列標(biāo)簽)、基因、甚至基因組序列信息，為一些模式生物芯片的制作提供了信息，大大方便了生物基因表達(dá)信息的獲取。探針制作完成后，通過將液相化學(xué)合成的大量探針，或?qū)CR擴(kuò)增的cDNA、基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過陣列點(diǎn)樣機(jī)(arrayer)及電腦控制的機(jī)器手，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或多聚賴氨酸包被的硅片等載體的相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。而常規(guī)的雜交檢測方法主要包括目的片段擴(kuò)增、直接點(diǎn)樣或電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上、紫外鉸鏈等步驟，因此，整體需要目的片段的量較大，且每次只能分析少數(shù)基因，具有一定的局限性。
待測的生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，直接用樣品本身進(jìn)行標(biāo)記雜交對樣品量的要求較高。因此，待測樣品DNA在雜交前一般都要通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增后的靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。芯片雜交可以根據(jù)實(shí)際情況在常規(guī)雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行掃描，圖像處理、數(shù)據(jù)提取、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終得到結(jié)果。這種處理和分析數(shù)據(jù)方式比常規(guī)雜交檢測的靈敏度高，尤其是對一些低豐度表達(dá)的基因，此外，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析可提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種檢測十字花科植物在病、蟲等生物及干旱、寒冷等非生物脅迫下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。
本發(fā)明所提供的檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片，探針序列來源主要包括序列表中SEQ ID №1-221 DNA序列以及具有下述GenBank登錄號的探針序列CA991436，CA991442，CA991443，CA991447-CA991450，CA991452-CA991458，CA991460，CA991462，CA991463，CA991465-CA991470，CA991473-CA991482，CA991484-CA991493，CA991495-CA991500，CA991502，CA991503，CA991505，CA991508，CA991510-CA991522，CA991524，CA991525，CA991527，CA991528，CA991530，CA991532，CA991534，CA991536-CA991540，CA991542，CA991544-CA991546，CA991548，CA991549，CA991551-CA991566，CA991568-CA991572，CA991574-CA991577，CA991579，CA991581，CA991582，CA991585-CA991603，CA991606-CA991610，CA991616-CA991654，CA991666-CA991668，CA991671，CA991673-CA991675，CA991678-CA991681，CA991686-CA991693，CA991698-CA991700，CA991705-CA991707，CA991710，CA991714，CA991715，CA991718-CA991720，CA991723，CA991725-CA991727，CA991729-CA991733，CA991735，CA991737-CA991763，CA991770-CA991773，CA991776-CA991778，CA991781，CA991784-CA991790，CA991792，CA991793，CA991795，CA991797-CA991804，CA991806-CA991808，CA991814，CA991817-CA991822，CA991826-CA991832，CA991834，CA991835，CA991839-CA991842，CA991848-CA991852，CA991854，CA991855，CA991857，CA991858-CA991860，CA991866，CA991869，CA991872-CA991875，CA991877，CA991879-CA991882，CA991887，CA991892，CA991895-CA991898，CA991900，CA991901，CA991903-CA991905，CA991907，CA991909，CA991911，CA991912，CA991915-CA991927，CA991930，CA991934，CA991936-CA991944，CA991946-CA991954，CA991960，CA991961，CA991964，CA991966，CA991968-CA991973，CA991976-CA991984，CA991987，CA991989，CA991991-CA991995，CA992000-CA992002，CA992005，CA992007，CA992008，CA992010-CA992012，CA992015，CA992017-CA992025，CA992028，CA992032，CA992033，CA992037，CA992041-CA992045，CA992053-CA992057，CA992061，CA992062，CA992065-CA992069，CA992072-CA992076，CA992080，CA992083，CA992086，CA992088-CA992091，CA992093-CA992097，CA992101，CA992105，CA992114，CA992118，CA992120-CA992122，CA992125，CA992127，CA992130，CA992132，CA992138-CA992146，CA992148，CA992150，CA992155，CA992159，CA992161，CA992163，CA992169-CA992172，CA992175-CA992178，CA992182-CA992192，CA992195，CA992198，CA992202，CA992203，CA992206-CA992208，CA992212，CA992214，CA992215，CA992218，CA992219，CA992221，CA992223-CA992225，CA992227，CA992229，CA992232-CA992234，CA992237，CA992241，CA992247-CA992249，CA992253，CA992254，CA992259-CA992267，CA992272，CA992273，CA992277-CA992283，CA992287-CA992289，CA992292-CA992296，CA992299，CA992303-CA992305，CA992308，CA992310，CA992315，CA992319，CA992324-CA992333，CA992336，CA992338-CA992350，CA992355，CA992356，CA992359-CA992366，CA992373，CA992376，CA992378，CA992380，CA992385-CA992388，CA992391，CA992392，CA992394，CA992396，CA992400，CA992401，CA992406-CA992418，CA992421-CA992424，CA992428，CA992431，CA992432，CA992434，CA992436，CA992439-CA992442，CA992445-CA992448，CA992450，CA992451，CA992458-CA992461，CA992464-CA992473，CA992476-CA992481，CA992484，CA992487，CA992488，CA992492，CA992496，CA992498-CA992504，CA992507，CA992508，CA992510-CA992513，CA992516-CA992524，CA992530-CA992538，CA992540，CA992542-CA992546，CA992553-CA992569，CA992573-CA992579，CA992583-CA992585，DN191370，DN191373-DN191379，DN191385，DN191388-DN191391，DN191394-DN191397，DN191399-DN191401，DN191403，DN191406-DN191413，DN191417，DN191419，DN191422，DN191424，DN191429，DN191430，DN191433-DN191435，DN191438-DN191443，DN191445，DN191450，DN191453，DN191456，DN191458-DN191462，DN191464，DN191467，DN191468，DN191471，DN191473，DN191474，DN191476，DN191479，DN191483，DN191485-DN191488，DN191491，DN191492，DN191497，DN191498，DN191502，DN191503，DN191506，DN191507，DN191510-DN191526，DN191530-DN191532，DN191534-DN191536，DN191538，DN191543，DN191544，DN191546，DN191548-DN191554，DN191556，DN191559-DN191561，DN191563，DN191564，DN191570，DN191572，DN191573，DN191575-DN191577，DN191579，DN191582-DN191586，DN191588-DN191590，DN191594，DN191597，DN191599，DN191603-DN191607，DN191609-DN191618，DN191620-DN191626，DN191629，DN191631-DN191634，DN191636-DN191638，DN191642-DN191644，DN191647，DN191649，DN191651，DN191653-DN191655，DN191659，DN191662，DN191665，DN191666，DN191670，DN191671，DN191673-DN191677，DN191679-DN191682，DN191685-DN191689，DN191693-DN191696，DN191698，DN191702，DN191703，DN191705-DN191712，DN191714-DN191722，DN191724，DN191726，DN191728-DN191730，DN191733，DN191737-DN191739，DN191741，DN191743-DN191745，DN191747-DN191749，DN191751，DN191753，DN191754，DN191757-DN191760，DN191763，DN191765，DN191766，DN191769，DN191771-DN191773，DN191775，DN191777-DN191782，DN191784，DN191787-DN191791，DN191793-DN191795，DN191797-DN191806，DN191808，DN191809，DN191811，DN191813，DN191814，DN191816-DN191822，DN191826，DN191828，DN191832-DN191846，DN191848，DN191850-DN191853，DN191856-DN191863，DN191866，DN191868，DN191869，DN191871，DN191872，DN191875，DN191877-DN191890，DN191891-DN191895，DN191898-DN191900，DN191903-DN191910，DN191914-DN191919，DN191921-DN191926，DN191930-DN191933，DN191937-DN191948，DN191950，DN191953，DN191955-DN191960，DN191962，DN191967，DN191970-DN191972，DN191979，DN191984，DN191986-DN191989，DN191992-DN191994，DN191997，DN192001-DN192005，DN192010，DN192012，DN192017，DN192019-DN192024，DN192026，DN192027，DN192036，DN192037，DN192039-DN192042，DN192044，DN192046，DN192047，DN192049，DN192051，DN192052，DN192054-DN192062，DN192064-DN192067，DN192069--DN192074，DN192076-DN192081，DN192084，DN192085，DN192087，DN192088，DN192090-DN192092，DN192094，DN192095，DN192098-DN192100，DN192103-DN192107，DN192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本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述用于檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片的制備方法。
本發(fā)明所提供的cDNA芯片的制備方法，包括以下步驟1)構(gòu)建受軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)感染大白菜的抑制消減cDNA文庫以及大白菜蓮座期和結(jié)球期幼嫩葉片cDNA文庫；2)自步驟1)中構(gòu)建的cDNA文庫中選取非冗余序列用于制作探針，所述探針序列包括列表中SEQ ID №1-221的DNA序列，以及3885條具有下述GenBank登錄號的DNA序列
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ID №222和SEQ ID №223；4)將步驟3)純化后的探針干燥后溶于50％DMSO中，探針濃度至少為100ng/μl；5)點(diǎn)樣將步驟4)的探針溶液點(diǎn)在載玻片上，點(diǎn)制在載玻片上的樣品還包括若干個(gè)與已知基因沒有相似性的基因間序列作為外標(biāo)，干燥后得到用于檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。
上述制備方法中，可用Assembly的方法對步驟1)獲得的EST進(jìn)行分析，去除冗余序列。步驟3)制備的探針還包括若干個(gè)軟腐歐文氏細(xì)菌的致病基因片段作為陰性對照，所述軟腐歐文氏細(xì)菌的致病基因片段優(yōu)選為具有下述GenBank登錄號的DNA片段AF022772、M36651.1、AF025769.2、L78834.1。步驟5)中每個(gè)探針設(shè)3個(gè)重復(fù)，便于進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；所用載片優(yōu)選為經(jīng)過氨基化學(xué)修飾的載玻片，更優(yōu)選為多聚賴氨酸載玻片。
本發(fā)明提供了一種用于檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。該基因芯片以逆境下和特殊發(fā)育時(shí)期大白菜基因的非冗余cDNA片段作為探針，包含有221個(gè)序列表中的cDNA序列以及3885個(gè)已經(jīng)具有GenBank登錄號的序列和4個(gè)軟腐歐文氏細(xì)菌致病基因探針及陰性對照，且每個(gè)探針設(shè)置了3個(gè)重復(fù)，便于對雜交結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
應(yīng)用該芯片對苗期大白菜對軟腐病細(xì)菌防御反應(yīng)基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲取了3152個(gè)差異表達(dá)基因，重復(fù)性高，并構(gòu)建出了不同基因表達(dá)時(shí)間和空間上的表達(dá)譜。本發(fā)明不僅可用于批量檢測十字花科植物在生物或非生物脅迫下的基因表達(dá)信息、篩選差異基因，還可用于構(gòu)建十字花科植物不同生長發(fā)育階段、不同組織器官乃至特異細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。應(yīng)用該芯片可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的高通量檢測，且操作方便、安全，檢測結(jié)果可靠、有效，可節(jié)省大量時(shí)間、人力、物力和財(cái)力，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為蕪菁花葉病毒侵染一周的大白菜材料與對照樣品雜交結(jié)果的偽色圖的部分圖片圖2為高抗大白菜接種蕪菁花葉病毒后第一周、兩周、三周差異表達(dá)基因數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物及探針序列均由上海生物工程公司合成。
實(shí)施例1、用于檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片的制備該cDNA芯片的制備方法，包括以下步驟1、受軟腐病歐文氏病原菌感染大白菜的抑制消減文庫以及蓮座期和結(jié)球期大白菜的cDNA文庫的構(gòu)建首先用PCR-SlectTM cDNA Subtraction kit(Clontech，CA，USA)并參照試劑盒說明書構(gòu)建受軟腐病歐文氏病原菌感染大白菜葉片的抑制消減文庫，用SuperscriptTM Lambda System(GibcoBRL)并參照試劑盒說明書構(gòu)建蓮座期和結(jié)球期大白菜的cDNA文庫；然后分別從這兩個(gè)文庫中隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行測序。
2、挑選非冗余序列用于制作探針對步驟1獲得的EST進(jìn)行Assembly分析，去除冗余序列，獲取4106條EST序列可用于制作探針，將探針序列在蛋白及基因(BLASTx)水平上與NCBI(2005年6月)站點(diǎn)上的非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，結(jié)果與已知防衛(wèi)病、蟲等生物脅迫及干旱、寒冷等非生物脅迫相關(guān)基因500多個(gè)、還含有大量與已知擬境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、以及在能量代謝、基礎(chǔ)代謝中起作用的關(guān)鍵基因。最后選取221條具有序列表中SEQ ID №1-221 DNA的序列以及3885條下述GenBank登錄號對應(yīng)的DNA序列用作芯片探針
CA991436，CA991442，CA991443，CA991447-CA991450，CA991452-CA991458，CA991460，CA991462，CA991463，CA991465-CA991470，CA991473-CA991482，CA991484-CA991493，CA991495-CA991500，CA991502，CA991503，CA991505，CA991508，CA991510-CA991522，CA991524，CA991525，CA991527，CA991528，CA991530，CA991532，CA991534，CA991536-CA991540，CA991542，CA991544-CA991546，CA991548，CA991549，CA991551-CA991566，CA991568-CA991572，CA991574-CA991577，CA991579，CA991581，CA991582，CA991585-CA991603，CA991606-CA991610，CA991616-CA991654，CA991666-CA991668，CA991671，CA991673-CA991675，CA991678-CA991681，CA991686-CA991693，CA991698-CA991700，CA991705-CA991707，CA991710，CA991714，CA991715，CA991718-CA991720，CA991723，CA991725-CA991727，CA991729-CA991733，CA991735，CA991737-CA991763，CA991770-CA991773，CA991776-CA991778，CA991781，CA991784-CA991790，CA991792，CA991793，CA991795，CA991797-CA991804，CA991806-CA991808，CA991814，CA991817-CA991822，CA991826-CA991832，CA991834，CA991835，CA991839-CA991842，CA991848-CA991852，CA991854，CA991855，CA991857，CA991858-CA991860，CA991866，CA991869，CA991872-CA991875，CA991877，CA991879-CA991882，CA991887，CA991892，CA991895-CA991898，CA991900，CA991901，CA991903-CA991905，CA991907，CA991909，CA991911，CA991912，CA991915-CA991927，CA991930，CA991934，CA991936-CA991944，CA991946-CA991954，CA991960，CA991961，CA991964，CA991966，CA991968-CA991973，CA991976-CA991984，CA991987，CA991989，CA991991-CA991995，CA992000-CA992002，CA992005，CA992007，CA992008，CA992010-CA992012，CA992015，CA992017-CA992025，CA992028，CA992032，CA992033，CA992037，CA992041-CA992045，CA992053-CA992057，CA992061，CA992062，CA992065-CA992069，CA992072-CA992076，CA992080，CA992083，CA992086，CA992088-CA992091，CA992093-CA992097，CA992101，CA992105，CA992114，CA992118，CA992120-CA992122，CA992125，CA992127，CA992130，CA992132，CA992138-CA992146，CA992148，CA992150，CA992155，CA992159，CA992161，CA992163，CA992169-CA992172，CA992175-CA992178，CA992182-CA992192，CA992195，CA992198，CA992202，CA992203，CA992206-CA992208，CA992212，CA992214，CA992215，CA992218，CA992219，CA992221，CA992223-CA992225，CA992227，CA992229，CA992232-CA992234，CA992237，CA992241，CA992247-CA992249，CA992253，CA992254，CA992259-CA992267，CA992272，CA992273，CA992277-CA992283，CA992287-CA992289，CA992292-CA992296，CA992299，CA992303-CA992305，CA992308，CA992310，CA992315，CA992319，CA992324-CA992333，CA992336，CA992338-CA992350，CA992355，CA992356，CA992359-CA992366，CA992373，CA992376，CA992378，CA992380，CA992385-CA992388，CA992391，CA992392，CA992394，CA992396，CA992400，CA992401，CA992406-CA992418，CA992421-CA992424，CA992428，CA992431，CA992432，CA992434，CA992436，CA992439-CA992442，CA992445-CA992448，CA992450，CA992451，CA992458-CA992461，CA992464-CA992473，CA992476-CA992481，CA992484，CA992487，CA992488，CA992492，CA992496，CA992498-CA992504，CA992507，CA992508，CA992510-CA992513，CA992516-CA992524，CA992530-CA992538，CA992540，CA992542-CA992546，CA992553-CA992569，CA992573-CA992579，CA992583-CA992585，DN191370，DN191373-DN191379，DN191385，DN191388-DN191391，DN191394-DN191397，DN191399-DN191401，DN191403，DN191406-DN191413，DN191417，DN191419，DN191422，DN191424，DN191429，DN191430，DN191433-DN191435，DN191438-DN191443，DN191445，DN191450，DN191453，DN191456，DN191458-DN191462，DN191464，DN191467，DN191468，DN191471，DN191473，DN191474，DN191476，DN191479，DN191483，DN191485-DN191488，DN191491，DN191492，DN191497，DN191498，DN191502，DN191503，DN191506，DN191507，DN191510-DN191526，DN191530-DN191532，DN191534-DN191536，DN191538，DN191543，DN191544，DN191546，DN191548-DN191554，DN191556，DN191559-DN191561，DN191563，DN191564，DN191570，DN191572，DN191573，DN191575-DN191577，DN191579，DN191582-DN191586，DN191588-DN191590，DN191594，DN191597，DN191599，DN191603-DN191607，DN191609-DN191618，DN191620-DN191626，DN191629，DN191631-DN191634，DN191636-DN191638，DN191642-DN191644，DN191647，DN191649，DN191651，DN191653-DN191655，DN191659，DN191662，DN191665，DN191666，DN191670，DN191671，DN191673-DN191677，DN191679-DN191682，DN191685-DN191689，DN191693-DN191696，DN191698，DN191702，DN191703，DN191705-DN191712，DN191714-DN191722，DN191724，DN191726，DN191728-DN191730，DN191733，DN191737-DN191739，DN191741，DN191743-DN191745，DN191747-DN191749，DN191751，DN191753，DN191754，DN191757-DN191760，DN191763，DN191765，DN191766，DN191769，DN191771-DN191773，DN191775，DN191777-DN191782，DN191784，DN191787-DN191791，DN191793-DN191795，DN191797-DN191806，DN191808，DN191809，DN191811，DN191813，DN191814，DN191816-DN191822，DN191826，DN191828，DN191832-DN191846，DN191848，DN191850-DN191853，DN191856-DN191863，DN191866，DN191868，DN191869，DN191871，DN191872，DN191875，DN191877-DN191890，DN191891-DN191895，DN191898-DN191900，DN191903-DN191910，DN191914-DN191919，DN191921-DN191926，DN191930-DN191933，DN191937-DN191948，DN191950，DN191953，DN191955-DN191960，DN191962，DN191967，DN191970-DN191972，DN191979，DN191984，DN191986-DN191989，DN191992-DN191994，DN191997，DN192001-DN192005，DN192010，DN192012，DN192017，DN192019-DN192024，DN192026，DN192027，DN192036，DN192037，DN192039-DN192042，DN192044，DN192046，DN192047，DN192049，DN192051，DN192052，DN192054-DN192062，DN192064-DN192067，DN192069--DN192074，DN192076-DN192081，DN192084，DN192085，DN192087，DN192088，DN192090-DN192092，DN192094，DN192095，DN192098-DN192100，DN192103-DN192107，DN192110，DN192112，DN192116，DN19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DN964886，DN964888，DN964889，DN964896，DN964901，DN964903，DN964910-DN964912，DN964916，DN964919，DN964921，DN964926，DN964927，DN964930，DN964932，DN964936，DN964938，DN964939，DN964943，DN964944，DN964947，DN964948，DN964950，DN964953，DN964954，DN964957，DN964959，DN964962，DN964967，DN964972，DN964973，DN964975，DN964979，DN964984，DN964985，DN964994，DN964996，DN965001，DN965004，DN965009，DN965013，DN965017，DN965018-DN965021，DN965029，DN965031，DN965043，DN965055，DN965056，DN965061，DN965063，DN965065-DN965070，DN965080，DN965092，DN965096-DN965099，DN965102，DN965105，DN965108，DN965111，DN965113，DN965119，DN965121，DN965126-DN965128，DN965131，DN965133-DN965135，DN965137，DN965140，DN965142，DN965144，DN965147-DN965152，DN965154，DN965157，DN965158，DN965160，DN965165，DN965168，DN965175，DN965182，DN965183，DN965185，DN965194，DN965197，DN965198，DN965207，DN965212，DN965213，DN965220，DN965224，DN965236，DN965244，DN965245，DN965258，DN965267，DN965269-DN965272，DN965275-DN965278，DN965280，DN965282，DN965284，DN965290，DN965291，DN965293，DN965294，DN965298，DN965301，DN965307，DN965308，DN965313，DN965315，DN965321，DN965323，DN965327，DN965331，DN965335，DN965337，DN965339-DN965343，DN965348，DN965352，DN965353，DN965357-DN965359，DN965368，DN965371，DN965373-DN965377，DN965382，DN965388，DN965390，DN965392，DN965394-DN965396，DN965398，DN965400，DN965402，DN965404，DN965405，DN965410-DN965412，DN965414，DN965421，DN965423-DN965425，DN965428，DN965431-DN965433，DN965435，DN965436，DN965439-DN965445，DN965447，DN965448，DN965450-DN965452，DN965454-DN965456，DN965459，DN965461，DN965463，DN965465，DN965468-DN965470，DN965473，DN965476-DN965485，DN965487-DN965495，DN965497，DN965498，DN965500，DN965503，DN965506，DN965511，DN965513，DN965515，DN965517-DN965519，DN965522，DN965523，DN965525，DN965528，DN965530，DN965532，DN965535，DN965538-DN965540，DN965542，DN965546-DN965551，DN965558，DN965559，DN965561，DN965563，DN965564，DN965568，DN965572，DN965578，DN965579，DN965581-DN965583，DN965595，DN965596，DN965598，DN965600，DN965601，DN965603，DN965604，DN965606，DN965608，DN965609，DN965611，DN965613，DN965621，DN965623，DN965627，DN965632，DN965633，DN965637，DN965647，DN965654，DN965658，DN965660，DN965661，DN965663，DN965665，DN965674，DN965676，DN965679，DN965681，DN965684，DN965686，DN965690，DN965691，DN965694，DN965695，DN965697，DN965699，DN965702，DN965704，DN965706，DN965707，DN965709，DN965719，DN965721，DN965735，DN965736，DN965737，DN965742，DN965743，DN965749-DN965751，DN965760，DN965767，DN965769，DN965774，DN965776，DN965777，DN965786，DN965790，DN965791，DN965793，DN965796，DN965801，DN965804，DN965807-DN965812，DN965815，DN965821，DN965831，DN965833，DN965835，DN965837，DN965838，DN965847，DN965848，DN965850，DN965853，DN965855，DN965858，DN965860，DN965864，DN965866，DN965867，DN965871，DN965873，DN965875，DN965879，DN965882，DN965883，DN965886，DN965889，DN965895-DN965897，DN965900，DN965901，DN965903，DN965905，DN965908，DN965909，DN965914，DN965915，DN965918，DN965919-DN965925，DN965934-DN965938，DN965942，DN965946，DN965959，DN965962，DN965964，DN965966，DN965970，DN965971，DN965975-DN965977，DN965979，DN965980，DN965984，DN965985，DN965987，DN965988，DN965997-DN965999，DN966006，DN966010，DN966013，DN966017，DN966019，DN966021，DN966023，DN966025，DN966031，DN966033，DN966035，DN966041，DN966050，DN966052，DN966054，DN966057，DN966058，DN966064，DN966066，DN966072，DN966073，DN966075，DN966088，DN966089，DN966102，DN966112，DN966116，DN966121，DN966122，DN966127，DN966133，DN966135，DN966140，DN966142，DN966147，DN966157，DN966159，DN966160，DN966161，DN966164，DN966166，DN966170，DN966177，DN966179，DN966180，DN966184，DN966186，DN966191，DN966196，DN966201，DN966203，DN966206，DN966208，DN966211，DN966213，DN966214，DN966216，DN966217，DN966221，DN966223，DN966228，DN966231，DN966233，DN966241，DN966244，DN966250，DN966251，DN966257，DN966259，DN966260，DN966268，DN966272，DN966286，DN966289，DN966291，DN966293，DN966295，DN966297，DN966300，DN966301，DN966309，DN966315，DN966325，DN966330，DN966331-DN966356，DN966358，DN966364，DN966365，DN966367，DN966370，DN966380，DN966383，DN966395，DN966400，DN966405，DN966406，DN966410，DN966414-DN966417，DN966424，DN966427，DN966436，DN966438，DN966451，DN966453，DN966464，DN966467，DN966468，DN966470，DN966472，DN966475，DN966491，DN966496，DN966498，DN966501，DN966504，DN966505，DN966512，DN966513，DN966524，DN966528，DN966530，DN966537，DN966538，DN966540，DN966543，DN966550，DN966552，DN966553，DN966555，DN966556，DN966558，DN966562，DN966566-DN966568，DN966573-DN966576，DN966579，DN966587，DN966591，DN966593，DN966596，DN966599。
3、制備探針、設(shè)置重復(fù)和對照在探針的制作過程中，對特異性擴(kuò)增產(chǎn)物施行特異性和量度檢測，并避免交叉污染。具體方法為首先按與步驟1相同的方法以大白菜受軟腐病歐文氏病原菌侵染的葉片為材料構(gòu)建抑制扣除雜交(SSH)cDNA文庫和大白菜蓮座期及結(jié)球期幼嫩葉片為材料構(gòu)建cDNA文庫。挑出步驟2確定的非冗余序列所對應(yīng)的克隆，以通用引物p-48(序列表中的序列222)和p-47(序列表中的序列223)為引物，使用rTaq DNA聚合酶(5U/μl，TaKaRa公司)擴(kuò)增目的片段，對擴(kuò)增的目的片段產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性；純化回收后在相同條件下再次進(jìn)行電泳檢測，并對信號較弱的探針進(jìn)行定量，使其濃度大于100ng/μl。每張芯片上每個(gè)探針設(shè)置三個(gè)重復(fù)，并設(shè)四個(gè)軟腐病菌致病因子相關(guān)基因(GenBank登錄號AF022772、M36651.1、AF025769.2、L78834.1)用作陰性對照。
4、點(diǎn)樣將純化后的探針轉(zhuǎn)入384孔板中，使其干燥后溶于50％DMSO中。使用GenomicInstrumentation Services公司的芯片點(diǎn)樣儀(GeneMachines)點(diǎn)制在一張75×25mm、經(jīng)過多聚賴氨酸修飾的載玻片上。步驟3的軟腐歐文氏細(xì)菌的四個(gè)致病基因片段作為陰性對照。每個(gè)基因重復(fù)三個(gè)點(diǎn)。點(diǎn)樣后每張芯片可以完成一對樣品的檢測，保存在無菌干燥處。
經(jīng)檢測該芯片上的探針量足夠，點(diǎn)直徑的CV值小于10％，點(diǎn)樣數(shù)量為3×4128。
實(shí)施例2、用本發(fā)明的cDNA芯片檢測高抗和高感蕪菁花葉病毒大白菜自交系(均為F6代)對蕪菁花葉病毒反應(yīng)的差異用本發(fā)明的cDNA芯片檢測高抗和高感蕪菁花葉病毒大白菜自交系(均為F6代)對蕪菁花葉病毒反應(yīng)的差異，具體實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果如下1、取材待高抗和高感蕪菁花葉病毒大白菜自交系(均為F6代)植株長到4-5片真葉期時(shí)，將保存在-20℃的TuMV病毒感染的葉片用pH7.0、濃度為0.1M的磷酸緩沖液以1∶5(wt/vol)磨碎后，取上清液體接種。在健康的高抗和高感植株新展開的葉片上接種蕪菁花葉病毒(TuMV)，于接種后第一周、兩周、三周等時(shí)間點(diǎn)取材。
2、RNA的提取及純化提取步驟1不同時(shí)間點(diǎn)取材的受蕪菁花葉病毒感染的高抗和高感大白菜葉片材料的總RNA；然后采用RNeasy mini spin column試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)對提取的總RNA過柱進(jìn)行純化；再將純化的總RNA用分光光度計(jì)定量，1.5％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，檢測結(jié)果表明獲得的總RNA未降解，符合實(shí)驗(yàn)要求。
3、樣品雙鏈cDNA的及純化取步驟2獲得的不同時(shí)間點(diǎn)取材的受蕪菁花葉病毒感染的高抗和高感大白菜葉片的總RNA各10g并以此為模板，以T7-Oligo(dT)15，(5’-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’，V可以是G、C或A，上海博亞生物技術(shù)有限公司)為引物，用cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa公司)并參照試劑盒說明書進(jìn)行操作合成雙鏈cDNA。雙鏈合成后，用QIAquick PCRPurification試劑盒(Qiagen公司)對合成的目的產(chǎn)物進(jìn)行純化。
4、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA及純化用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)并參照說明書進(jìn)行操作以步驟3合成的雙鏈cDNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA。然后用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司)對體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA進(jìn)行純化。
5、隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄取2g步驟4獲得的cRNA為模板，用200u/μl SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)，在9mer的隨機(jī)引物(9mer Random Primer，上海博亞生物技術(shù)有限公司)的引導(dǎo)下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification試劑盒(Qiagen公司)進(jìn)行純化。
6、用KLENOW酶對cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記取1g步驟5獲得的cDNA為模板，以9mer的隨機(jī)引物為引物，采用TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling試劑盒并參照說明書進(jìn)行操作進(jìn)行KLENOW酶的標(biāo)記，再將標(biāo)記產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification試劑盒(Qiagen公司)進(jìn)行純化，純化后抽干。標(biāo)記過程中，dATP、dGTP和dTTP的使用濃度為120M，dCTP的使用濃度為60M，Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的使用濃度為40gM(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ，USA)。
7、雜交與清洗將步驟6經(jīng)KLENOW酶標(biāo)記的DNA溶于30μl雜交液(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)中，于42℃雜交12小時(shí)。雜交結(jié)束后，先在42℃、含0.2％SDS，2×SSC的溶液中洗5min，然后用0.2×SSC溶液，在室溫下洗5min。將玻片甩干后即可用于掃描。
8、芯片掃描將芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀(Packard Bioscience公司)進(jìn)行掃描，蕪菁花葉病毒侵染一周的大白菜材料與對照樣品雜交結(jié)果的偽色圖的部分圖片如圖1所示(紅色為上調(diào)表達(dá)基因；綠色為下調(diào)表達(dá)基因；黃色基因表達(dá)變化相當(dāng))9、芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析采用GenePix Pro 4.0生物芯片圖像分析軟件(Axon Instruments公司)對掃描的芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，然后對芯片上的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行下述分析1)用線性方法進(jìn)行歸一化用lowess方法校正由于熒光Cy3和Cy5的標(biāo)記效率和理化性質(zhì)的不同及其它系統(tǒng)誤差所造成的兩種熒光信號強(qiáng)度的差異。
2)對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選去除實(shí)驗(yàn)中人為加入的外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)、陰性對照以及所有空白及不可靠的點(diǎn)。
3)挑選差異表達(dá)基因用T-test統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)合2倍差異確定差異表達(dá)基因。挑選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為(1)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義對3個(gè)有效數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在95％顯著性水準(zhǔn)上為顯著差異；(2)生物學(xué)意義Ratio平均值≥2為上調(diào)表達(dá)，Ratio平均值≤0.5為下調(diào)表達(dá)。Ratio值為抗病和感病自交系的結(jié)果。高抗、高感大白菜接種蕪菁花葉病毒后第一周、兩周、三周差異表達(dá)基因數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，在第一周有51個(gè)下調(diào)、266個(gè)上調(diào)；第二周有17個(gè)下調(diào)、239個(gè)上調(diào)，第三周有7個(gè)下調(diào)、1812個(gè)上調(diào)。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少有1792個(gè)基因差異表達(dá)，其中功能未知基因36％、逆境防衛(wèi)基因9％、次生代謝途徑基因5％、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因5％、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑占5％。以上結(jié)果與檢測軟腐病基因表達(dá)譜結(jié)果均表明本發(fā)明的芯片具有足夠量的探針，可檢測到大量差異表達(dá)基因，靈敏度較高，可用于快速、批量檢測十字花科植物在特殊發(fā)育階段、生物或非生物脅迫下基因的表達(dá)信息。
序列表<160>223<210>1<211>232<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ctggcatatt gggacatcta gcggtttcag acagtggagt tgtgagtgat cgaatcatat 60caccacctgc tgcacctgaa tgtaataaca aagagccttc tcatgattta gaatcagaaa120aggaagaagt tgatgtggag gaggtttcag tgagttcagc tgtgagatct acacgccaaa180ccgaaaggaa agctaggagg gcaaaagggc tagagaaaac tgcatcatgt at232<210>2<211>236<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagaggacag cactgcactg tgccatgatc tttgatgctc tcgtgatggc gtttgtcatg 60taaaaattct cgaccactgg tttgaacggc gttgtgctca ttgtctcctt gcactcaggc 120ttcaacgatg gcccaaaagc agctggctct cgttcatctg tgtggactag atttggtgcg 180acgctcttga tcctcgatct aacaccttct attgagttgt atggaagatt cacacc 236<210>3<211>234<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3acaaaaccag agcaaagcta agcagttttc aagcaaagca taacatagat tgtttcctaa 60taataaaaaa gcagacatct tcaaaagaat tttgaatgta taaaagaaga acgatcatag 120ctttgaggaa acagaccaaa tccataacaa tctgcaagag actaaactga gtcttttagc 180tcgagcagca accagttttc ttcacagccg atacatcaat atcaatcttc tctc 234<210>4<211>231<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4acccaaaagg aaccttagag gggaaaggaa attcattgtc tttgtatttg catgcgtccg 60
attacgtgac tggtccaaat acaaaaacat tggccgtctt taaactgcga gtgttggacc 120aactcaaacg caatcaccat gaaataggcc agcagttctg gtttggctct gatggacaaa 180agggggaacc caagtttttg gcgctggagg aactgcacaa ggcttcaaac g 231<210>5<211>236<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5actctccctt gtaatgttga tcgaaaagag tattcatatt tcttgattgt aaatgcttaa 60ctctgcatgt gtttccttgt aacgttgggt gaggtatgtc gaacatttga tcgctggata 120tttgggaacg ttgctttcgg acttgcaagt tgggagacac tccaccagac attcatgatt 180tggttccacg aaaaacggaa tagaatatcg ttcctgaccg ttcccaagaa cccgat 236<210>6<211>232<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6acgtaggagg gatcgatgtt cggtaagtga tctgctggtt ctggtaagca gcgtatacct 60cgagacggtc gtagtaaacg ccgatcttgt cgttagggtt ccgggaagag agagtgactt 120ggaagttgga ggtgaggagg ttcggtggat taccggagac gttgaaggcg tagacggtgg 180cgtcttggag gatgaaacgt ggctttgtag gctggagaat tgcccaaatg ag 232<210>7<211>234<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7acctttcatc gcgatacatc gcggataggt ttcttccaga taaagctatc gatcttattg 60acgaggcggg aagcagagct cgcatccaag cttttagaaa gaaaaaggag gatgcaatct 120gtatcctttc gaagccaccg gatgattact ggcaagagat cagaactgtt caggccatgc 180acgaagtggt tctatcaagc aggccgaacc aggaagatgg taataacatt gtag 234<210>8<211>239<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8acccagagca acacgaagag gctattgtct cccagggtgg tagtgtcatt atttccccat 60tgggaaagat tctcgccggg ccaaactttg aatcagaggg tctcataaca gctgatcttg 120gtatttgatc ttcatcttaa ttaggcttta gtgcagaaaa ttatgaaccc ttttacccaa 180tcattttttt ttcttatcta gatcttggcg atatcgcaag agccaagtta tacttcgat 239
<210>9<211>234<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>223cgccagggtt ttcccagtca cgac2權(quán)利要求
1.一種檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片，由序列表中SEQID №1-221 DNA序列的探針，以及具有下達(dá)GenBank登錄號的探針序列組成CA991436，CA991442，CA991443，CA991447-CA991450，CA991452-CA991458，CA991460，CA991462，CA991463，CA991465-CA991470，CA991473-CA991482，CA991484-CA991493，CA991495-CA991500，CA991502，CA991503，CA991505，CA991508，CA991510-CA991522，CA991524，CA991525，CA991527，CA991528，CA991530，CA991532，CA991534，CA991536-CA991540，CA991542，CA991544-CA991546，CA991548，CA991549，CA991551-CA991566，CA991568-CA991572，CA991574-CA991577，CA991579，CA991581，CA991582，CA991585-CA991603，CA991606-CA991610，CA991616-CA991654，CA991666-CA991668，CA991671，CA991673-CA991675，CA991678-CA991681，CA991686-CA991693，CA991698-CA991700，CA991705-CA991707，CA991710，CA991714，CA991715，CA991718-CA991720，CA991723，CA991725-CA991727，CA991729-CA991733，CA991735，CA991737-CA991763，CA991770-CA991773，CA991776-CA991778，CA991781，CA991784-CA991790，CA991792，CA991793，CA991795，CA991797-CA991804，CA991806-CA991808，CA991814，CA991817-CA991822，CA991826-CA991832，CA991834，CA991835，CA991839-CA991842，CA991848-CA991852，CA991854，CA991855，CA991857，CA991858-CA991860，CA991866，CA991869，CA991872-CA991875，CA991877，CA991879-CA991882，CA991887，CA991892，CA991895-CA991898，CA991900，CA991901，CA991903-CA991905，CA991907，CA991909，CA991911，CA991912，CA991915-CA991927，CA991930，CA991934，CA991936-CA991944，CA991946-CA991954，CA991960，CA991961，CA991964，CA991966，CA991968-CA991973，CA991976-CA991984，CA991987，CA991989，CA991991-CA991995，CA992000-CA992002，CA992005，CA992007，CA992008，CA992010-CA992012，CA992015，CA992017-CA992025，CA992028，CA992032，CA992033，CA992037，CA992041-CA992045，CA992053-CA992057，CA992061，CA992062，CA992065-CA992069，CA992072-CA992076，CA992080，CA992083，CA992086，CA992088-CA992091，CA992093-CA992097，CA992101，CA992105，CA992114，CA992118，CA992120-CA992122，CA992125，CA992127，CA992130，CA992132，CA992138-CA992146，CA992148，CA992150，CA992155，CA992159，CA992161，CA992163，CA992169-CA992172，CA992175-CA992178，CA992182-CA992192，CA992195，CA992198，CA992202，CA992203，CA992206-CA992208，CA992212，CA992214，CA992215，CA992218，CA992219，CA992221，CA992223-CA992225，CA992227，CA992229，CA992232-CA992234，CA992237，CA992241，CA992247-CA992249，CA992253，CA992254，CA992259-CA992267，CA992272，CA992273，CA992277-CA992283，CA992287-CA992289，CA992292-CA992296，CA992299，CA992303-CA992305，CA992308，CA992310，CA992315，CA992319，CA992324-CA992333，CA992336，CA992338-CA992350，CA992355，CA992356，CA992359-CA992366，CA992373，CA992376，CA992378，CA992380，CA992385-CA992388，CA992391，CA992392，CA992394，CA992396，CA992400，CA992401，CA992406-CA992418，CA992421-CA992424，CA992428，CA992431，CA992432，CA992434，CA992436，CA992439-CA992442，CA992445-CA992448，CA992450，CA992451，CA992458-CA992461，CA992464-CA992473，CA992476-CA992481，CA992484，CA992487，CA992488，CA992492，CA992496，CA992498-CA992504，CA992507，CA992508，CA992510-CA992513，CA992516-CA992524，CA992530-CA992538，CA992540，CA992542-CA992546，CA992553-CA992569，CA992573-CA992579，CA992583-CA992585，DN191370，DN191373-DN191379，DN191385，DN191388-DN191391，DN191394-DN191397，DN191399-DN191401，DN191403，DN191406-DN191413，DN191417，DN191419，DN191422，DN191424，DN191429，DN191430，DN191433-DN191435，DN191438-DN191443，DN191445，DN191450，DN191453，DN191456，DN191458-DN191462，DN191464，DN191467，DN191468，DN191471，DN191473，DN191474，DN191476，DN191479，DN191483，DN191485-DN191488，DN191491，DN191492，DN191497，DN191498，DN191502，DN191503，DN191506，DN191507，DN191510-DN191526，DN191530-DN191532，DN191534-DN191536，DN191538，DN191543，DN191544，DN191546，DN191548-DN191554，DN191556，DN191559-DN191561，DN191563，DN191564，DN191570，DN191572，DN191573，DN191575-DN191577，DN191579，DN191582-DN191586，DN191588-DN191590，DN191594，DN191597，DN191599，DN191603-DN191607，DN191609-DN191618，DN191620-DN191626，DN191629，DN191631-DN191634，DN191636-DN191638，DN191642-DN191644，DN191647，DN191649，DN191651，DN191653-DN191655，DN191659，DN191662，DN191665，DN191666，DN191670，DN191671，DN191673-DN191677，DN191679-DN191682，DN191685-DN191689，DN191693-DN191696，DN191698，DN191702，DN191703，DN191705-DN191712，DN191714-DN191722，DN191724，DN191726，DN191728-DN191730，DN191733，DN191737-DN191739，DN191741，DN191743-DN191745，DN191747-DN191749，DN191751，DN191753，DN191754，DN191757-DN191760，DN191763，DN191765，DN191766，DN191769，DN191771-DN191773，DN191775，DN191777-DN191782，DN191784，DN191787-DN191791，DN191793-DN191795，DN191797-DN191806，DN191808，DN191809，DN191811，DN191813，DN191814，DN191816-DN191822，DN191826，DN191828，DN191832-DN191846，DN191848，DN191850-DN191853，DN191856-DN191863，DN191866，DN191868，DN191869，DN191871，DN191872，DN191875，DN191877-DN191890，DN191891-DN191895，DN191898-DN191900，DN191903-DN191910，DN191914-DN191919，DN191921-DN191926，DN191930-DN191933，DN191937-DN191948，DN191950，DN191953，DN191955-DN191960，DN191962，DN191967，DN191970-DN191972，DN191979，DN191984，DN191986-DN191989，DN191992-DN191994，DN191997，DN192001-DN192005，DN192010，DN192012，DN192017，DN192019-DN192024，DN192026，DN192027，DN192036，DN192037，DN192039-DN192042，DN192044，DN192046，DN192047，DN192049，DN192051，DN192052，DN192054-DN192062，DN192064-DN192067，DN192069--DN192074，DN192076-DN192081，DN192084，DN192085，DN192087，DN192088，DN192090-DN192092，DN192094，DN192095，DN192098-DN192100，DN192103-DN19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1，DN965603，DN965604，DN965606，DN965608，DN965609，DN965611，DN965613，DN965621，DN965623，DN965627，DN965632，DN965633，DN965637，DN965647，DN965654，DN965658，DN965660，DN965661，DN965663，DN965665，DN965674，DN965676，DN965679，DN965681，DN965684，DN965686，DN965690，DN965691，DN965694，DN965695，DN965697，DN965699，DN965702，DN965704，DN965706，DN965707，DN965709，DN965719，DN965721，DN965735，DN965736，DN965737，DN965742，DN965743，DN965749-DN965751，DN965760，DN965767，DN965769，DN965774，DN965776，DN965777，DN965786，DN965790，DN965791，DN965793，DN965796，DN965801，DN965804，DN965807-DN965812，DN965815，DN965821，DN965831，DN965833，DN965835，DN965837，DN965838，DN965847，DN965848，DN965850，DN965853，DN965855，DN965858，DN965860，DN965864，DN965866，DN965867，DN965871，DN965873，DN965875，DN965879，DN965882，DN965883，DN965886，DN965889，DN965895-DN965897，DN965900，DN965901，DN965903，DN965905，DN965908，DN965909，DN965914，DN965915，DN965918，DN965919-DN965925，DN965934-DN965938，DN965942，DN965946，DN965959，DN965962，DN965964，DN965966，DN965970，DN965971，DN965975-DN965977，DN965979，DN965980，DN965984，DN965985，DN965987，DN965988，DN965997-DN965999，DN966006，DN966010，DN966013，DN966017，DN966019，DN966021，DN966023，DN966025，DN966031，DN966033，DN966035，DN966041，DN966050，DN966052，DN966054，DN966057，DN966058，DN966064，DN966066，DN966072，DN966073，DN966075，DN966088，DN966089，DN966102，DN966112，DN966116，DN966121，DN966122，DN966127，DN966133，DN966135，DN966140，DN966142，DN966147，DN966157，DN966159，DN966160，DN966161，DN966164，DN966166，DN966170，DN966177，DN966179，DN966180，DN966184，DN966186，DN966191，DN966196，DN966201，DN966203，DN966206，DN966208，DN966211，DN966213，DN966214，DN966216，DN966217，DN966221，DN966223，DN966228，DN966231，DN966233，DN966241，DN966244，DN966250，DN966251，DN966257，DN966259，DN966260，DN966268，DN966272，DN966286，DN966289，DN966291，DN966293，DN966295，DN966297，DN966300，DN966301，DN966309，DN966315，DN966325，DN966330，DN966331-DN966356，DN966358，DN966364，DN966365，DN966367，DN966370，DN966380，DN966383，DN966395，DN966400，DN966405，DN966406，DN966410，DN966414-DN966417，DN966424，DN966427，DN966436，DN966438，DN966451，DN966453，DN966464，DN966467，DN966468，DN966470，DN966472，DN966475，DN966491，DN966496，DN966498，DN966501，DN966504，DN966505，DN966512，DN966513，DN966524，DN966528，DN966530，DN966537，DN966538，DN966540，DN966543，DN966550，DN966552，DN966553，DN966555，DN966556，DN966558，DN966562，DN966566-DN966568，DN966573-DN966576，DN966579，DN966587，DN966591，DN966593，DN966596，DN966599。
2.一種權(quán)利要求1所述cDNA芯片的制備方法，包括以下步驟1)構(gòu)建受軟腐歐文氏(Erwinia carotovora subsp.carotovora)感染大白菜的抑制消減cDNA文庫以及大白菜蓮座期和結(jié)球期幼嫩葉片的cDNA文庫；2)自步驟1)中構(gòu)建的cDNA文庫中挑選非冗余序列制作探針，所述探針為序列表中SEQID №1-221的DNA序列，以及3885條具有下述GenBank登錄號的DNA序列CA991436，CA991442，CA991443，CA991447-CA991450，CA991452-CA991458，CA991460，CA991462，CA991463，CA991465-CA991470，CA991473-CA991482，CA991484-CA991493，CA991495-CA991500，CA991502，CA991503，CA991505，CA991508，CA991510-CA991522，CA991524，CA991525，CA991527，CA991528，CA991530，CA991532，CA991534，CA991536-CA991540，CA991542，CA991544-CA991546，CA991548，CA991549，CA991551-CA991566，CA991568-CA991572，CA991574-CA991577，CA991579，CA991581，CA991582，CA991585-CA991603，CA991606-CA991610，CA991616-CA991654，CA991666-CA991668，CA991671，CA991673-CA991675，CA991678-CA991681，CA991686-CA991693，CA991698-CA991700，CA991705-CA991707，CA991710，CA991714，CA991715，CA991718-CA991720，CA991723，CA991725-CA991727，CA991729-CA991733，CA991735，CA991737-CA991763，CA991770-CA991773，CA991776-CA991778，CA991781，CA991784-CA991790，CA991792，CA991793，CA991795，CA991797-CA991804，CA991806-CA991808，CA991814，CA991817-CA991822，CA991826-CA991832，CA991834，CA991835，CA991839-CA991842，CA991848-CA991852，CA991854，CA991855，CA991857，CA991858-CA991860，CA991866，CA991869，CA991872-CA991875，CA991877，CA991879-CA991882，CA991887，CA991892，CA991895-CA991898，CA991900，CA991901，CA991903-CA991905，CA991907，CA991909，CA991911，CA991912，CA991915-CA991927，CA991930，CA991934，CA991936-CA991944，CA991946-CA991954，CA991960，CA991961，CA991964，CA991966，CA991968-CA991973，CA991976-CA991984，CA991987，CA991989，CA991991-CA991995，CA992000-CA992002，CA992005，CA992007，CA992008，CA992010-CA992012，CA992015，CA992017-CA992025，CA992028，CA992032，CA992033，CA992037，CA992041-CA992045，CA992053-CA992057，CA992061，CA992062，CA992065-CA992069，CA992072-CA992076，CA992080，CA992083，CA992086，CA992088-CA992091，CA992093-CA992097，CA992101，CA992105，CA992114，CA992118，CA992120-CA992122，CA992125，CA992127，CA992130，CA992132，CA992138-CA992146，CA992148，CA992150，CA992155，CA992159，CA992161，CA992163，CA992169-CA992172，CA992175-CA992178，CA992 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1，DN966293，DN966295，DN966297，DN966300，DN966301，DN966309，DN966315，DN966325，DN966330，DN966331-DN966356，DN966358，DN966364，DN966365，DN966367，DN966370，DN966380，DN966383，DN966395，DN966400，DN966405，DN966406，DN966410，DN966414-DN966417，DN966424，DN966427，DN966436，DN966438，DN966451，DN966453，DN966464，DN966467，DN966468，DN966470，DN966472，DN966475，DN966491，DN966496，DN966498，DN966501，DN966504，DN966505，DN966512，DN966513，DN966524，DN966528，DN966530，DN966537，DN966538，DN966540，DN966543，DN966550，DN966552，DN966553，DN966555，DN966556，DN966558，DN966562，DN966566-DN966568，DN966573-DN966576，DN966579，DN966587，DN966591，DN966593，DN966596，DN966599；3)利用通用引物PCR擴(kuò)增目的片段，純化后的探針濃度應(yīng)大于100ng/μl；所述通用引物序列為序列表中的SEQ ID №222和SEQ ID №223；4)將步驟3)純化后的探針干燥后溶于50％DMSO中，點(diǎn)樣溶液中的探針濃度大于100ng/μl；5)點(diǎn)樣將步驟4)的探針溶液點(diǎn)在載玻片上，點(diǎn)制在載玻片上的樣品還包括若干個(gè)與已知基因沒有相似性的基因間序列作為外標(biāo)，干燥后得到用于檢測十字花科植物在脅迫條件下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中制備的探針還包括若干個(gè)軟腐歐文氏細(xì)菌的致病基因片段作為陰性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述軟腐歐文氏細(xì)菌的致病基因片段為具有下述GenBank登錄號的DNA片段AF022772、M36651.1、AF025769.2、L78834.1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟5)中每個(gè)探針設(shè)3個(gè)重復(fù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)中的載玻片為經(jīng)過氨基化學(xué)修飾的載玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述載玻片為多聚賴氨酸載玻片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測十字花科植物生物及非生物脅迫下基因表達(dá)信息的cDNA芯片。該基因芯片以逆境下和特殊發(fā)育時(shí)期大白菜基因的cDNA片段作為探針，由序列表中SEQ ID №1－221DNA序列的探針，以及3885條GenBank中的探針序列組成。本發(fā)明不僅可用于批量檢測十字花科植物在生物或非生物脅迫下的基因表達(dá)信息、篩選差異基因，還可用于構(gòu)建十字花科植物不同生長發(fā)育階段、不同組織器官乃至特異細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。應(yīng)用該芯片可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的高通量檢測，且操作方便、安全，檢測結(jié)果可靠、有效，可節(jié)省大量時(shí)間、人力、物力和財(cái)力，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1952172SQ20051010929
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者馬榮才, 張松賀, 常鳳啟, 謝華, 屈淑平, 遠(yuǎn)方, 戴大鵬 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院